Rapport d activités du C.N.R. Haemophilus influenzae. Année 2013

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1 Rapport d activités du C.N.R. Haemophilus influenzae Année 2013 Olivier Gaillot Institut de Microbiologie Centre de Biologie Pathologie Génétique CHU de Lille Boulevard Jules Leclercq Lille CEDEX tél olivier.gaillot@chru-lille.fr 5 avril 2014

2 SOMMAIRE - Rappel des missions et objectifs du CNR Localisation et composition de l équipe Résumé des données épidémiologiques Isolats bactériens reçus en Autres échantillons biologiques Caractéristiques des infections Isolats invasifs Distribution des infections invasives selon l âge et le sérotype Infections non invasives Sensibilité aux bêta-lactamines Sensibilité aux autres antibiotiques Investigation des cas groupés Techniques développées par le CNR en Accréditation et contrôle de qualité externe Publications scientifiques Communication et enseignements Collaborations scientifiques ANNEXE - Liste des marqueurs épidémiologiques disponibles au CNR - Collections de souches, antigènes ou immun-sérums de référence - Liste des techniques de diagnostic/identification recommandées par le CNR - Protocole opératoire European wide molecular typing of invasive H. influenzae

3 1 Rappel des missions et objectifs du CNR en termes de santé publique : - La mission première du CNR Haemophilus influenzae est le recueil et l analyse des souches responsables d infections invasives en France. Il alerte la direction de l Institut de Veille Sanitaire et le Ministre de la Santé lors de l augmentation de fréquence ou de gravité des cas. L objectif de cette surveillance est (i) d évaluer la qualité de la protection vaccinale de la population française vis-à-vis du sérotype b (Hib), (ii) de caractériser les souches virulentes d autres types qui pourraient émerger, (iii) d identifier et de décrire les cas groupés d infections. - Le CNR réalise la surveillance de la sensibilité à six familles d antibiotiques des souches invasives ou non qui lui sont adressées. - Le CNR met à la disposition des laboratoires d analyse médicale un support technique au diagnostic des infections à H. influenzae et bactéries apparentées. Ce support inclut : s des techniques phénotypiques (biotypage, sérotypage capsulaire, identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF, antibiogramme et son interprétation) ; s des techniques génétiques de typage des isolats (typage des gènes d encapsulation, étude du polymorphisme, détection de gènes de résistance) ; s des techniques génétiques de détection de H. influenzae (capsulé ou non) dans le liquide céphalorachidien. s le dosage des anticorps anti-h. influenzae b (Hib), dans le cadre exclusif de l exploration des échecs de la vaccination anti-hib. - Le CNR participe à la mise au point, à l évaluation et à la diffusion des techniques et stratégies de diagnostic des infections à H. influenzae. Dans ses domaines d expertise, il répond aux questions que lui soumettent les biologistes et les cliniciens. - Il assure la conservation des isolats cliniques qui lui ont été confiés. Ces souches sont disponibles pour des études à réaliser par le CNR ou par d autres équipes. - Depuis son ouverture en 2009, le CNR participe au programme européen de contrôle des maladies transmissibles (The European Surveillance System, TESSy). Il est membre du consortium européen de surveillance des infections invasives bactériennes (IBD-Labnet) du European Centre for Prevention and Disease Control (ECDC, Stockholm, Suède) et participe au contrôle de qualité international mis en place en 2009 par cet organisme. Localisation du CNR : Dans l Institut de Microbiologie du CHU de Lille (Centre de Biologie Pathologie et Génétique, boulevard Jules Leclercq, Lille CEDEX. Tél ou 54 80). Le CNR fonctionne sans laboratoire associé. Une page web d information et de téléchargement des fichiers relatifs au CNR est consultable à l adresse Y figurent les rapports d activités des quatre années précédentes et les réponses du CNR aux questions les plus fréquentes de nos correspondants, ainsi qu un lien vers les recommandations vaccinales du Haut Conseil de la Santé Publique. Composition de l équipe : - Dr Olivier Gaillot, MCU-PH, responsable du CNR - M lle Karine Baroli, technicienne dédiée au CNR

4 2 RÉSUMÉ DES DONNÉES ÉPIDÉMIOLOGIQUES 2013 : s Répartition clinique et mortalité des infections invasives à Haemophilus influenzae : Parmi les 470 isolats de H. influenzae reçus au CNR, 156 avaient été responsables d infections invasives (+ 6 % par rapport à 2012) réparties en 35 méningites (- 9 %) et 121 de bactériémies sans méningite (+ 17 %). Présentations cliniques des infections invasives à H. influenzae, Au total, 25 % des patients étaient hospitalisés en réanimation au moment du diagnostic et la mortalité globale liée à ces infections était de 5,1 %. La mortalité des méningites était de 8,5 % (un enfant, deux adultes, isolats capsulés dans tous les cas [b, a et f]), celle des bactériémies était de 4,1 % (cinq adultes de plus de 45 ans, isolats non capsulés à l exception d un cas [f]). s Près de 90 % des isolats invasifs n étaient pas capsulés: Répartition des sérotypes capsulaires des 156 isolats invasifs, 2013 Cette répartition est similaire à celle des trois années précédentes, les isolats capsulés les plus fréquents étant ceux du sérotype f (n = 11).

5 3 s Les sérotypes a (2 infections, un décès) et b (3 infections, un décès), restent préoccupants en raison de leur virulence, mais sont très peu fréquents. La protection vaccinale anti-hib n a été prise en défaut que dans un cas. Il s agissait d une méningite fulminante chez un nourrisson de 3 mois ½, qui en raison de son jeune âge n avait reçu que la 1 re des trois doses du calendrier vaccinal simplifié mis en place en 2013 (Bulletin Épidémiologique Hebdomadaire, 19 avril 2013). s Quatre souches capsulées non invasives ont été identifiées, appartenant aux sérotypes e (n = 1) et f (n = 3). Elles étaient associées à des infections broncho-pulmonaires. s Le nombre d infections gynécologiques et néonatales a augmenté de façon spectaculaire (+ 15 % par rapport à 2012 et 4 fois plus qu en 2011), tendance également observée dans plusieurs pays européens. La transmission mère-enfant survient principalement per partum, mais un avortement spontané et une mort in utero ont été observés. Les isolats n étaient pas capsulés et appartenaient principalement aux biotypes II et III (80 %). s La quantité d isolats de Haemophilus haemolyticus adressés au CNR comme H. influenzae a diminuée de moitié par rapport à 2012, les spectromètres de masse commerciaux identifiant aujourd hui l espèce de façon assez satisfaisante. Seules 3 souches ont été responsables d infections invasives, confirmant une virulence moindre que celle de H. influenzae. s Résistance aux antibiotiques - Bêta-lactamines : l adoption récente des recommandations de l EUCAST par le CASFM a modifié les critères français de sensibilité à l amoxicilline et au co-amoxiclav : les isolats de H. influenzae dont la CMI est égale à 2 µg/ml sont désormais sensibles à cet antibiotique, alors qu ils étaient jusqu alors résistants. Il en résulte une apparente diminution en 2013 du taux de résistance à l amoxicilline (21,5 % vs 22,5 % en 2012) et au co-amoxiclav (4,3 % vs 12,8 % en 2012). En réalité, la proportion d isolats porteurs de mutations de la PLP3 est en progression (18,1 % vs 12,8 % en 2012), de même que la résistance au céfotaxime (1,5 % vs 0,2 % en 2012), bien que les souches invasives y aient été toutes sensibles ainsi qu à la ceftriaxone. Le CNR recommande donc que lʼactivité des bêta-lactamines dʼintérêt thérapeutique soit mesurée en routine dans les laboratoires, en particulier sur les isolats dʼotite moyenne aiguë (OMA). - Fluoroquinolones : seize isolats porteurs de mutations caractéristiques des gènes gyra et parc ont été adressés au CNR en 2013, soit 4 fois plus qu en Tous étaient de sensibilité diminuée aux fluoroquinolones (CMI d ofloxacine 0,06 µg/ml), mais quatre seulement étaient résistant selon les critères de l EUCAST, principalement des souches d infections bronchopulmonaires de l adulte. - Autres antibiotiques : la résistance au cotrimoxazole touchait 1/3 (32,6 %) des isolats tout venant, mais près de 45 % des souches d OMA du jeune enfant. Aucune résistance acquise à la rifampicine ou aux macrolides n a été détectée en Un seul isolat était résistant aux tétracyclines, y compris la minocycline.

6 4 DÉTAIL DE L ACTIVITÉ D EXPERTISE EN Nombre dʼisolats ou prélèvements (fiches de données) réceptionnés : s Isolats : 567 isolats bactériens (soit une diminution de 9 % par rapport à 2012) dont 536 Haemophilus spp. ont été reçus au CNR accompagnés d une fiche de données biocliniques. Ils se répartissaient comme suit (Fig.1A et B). Fig. 1A. Nombre d isolats de H. influenzae et d autres espèces reçus par le CNR en 2013 (orange), 2012, 2011 et La diminution du nombre d isolats reçus s explique par l accroissement du coût de transport des agents infectieux. Plusieurs laboratoires ont ainsi signalé en cours d année leur incapacité financière à envoyer au CNR leurs isolats non invasifs. * A. aphrophilus (n = 5), A. segnis (n = 5), A. actinomycetemcomitans (n = 1) Fig. 1B. Répartition par espèce des 536 isolats de Haemophilus spp. reçus en Le nombre d isolats de H. haemolyticus adressés au CNR a diminué de moitié par rapport à 2012, l identification de l espèce étant possible depuis septembre 2013 à l aide des deux principaux systèmes commerciaux de spectrométrie de masse MALDI-TOF (SM-MT). Trois isolats invasifs originellement identifiés comme H. influenzae nous sont parvenus, dont les

7 5 caractéristiques sont décrites ci-dessous (Tableau 1). Parmi eux figure une souche responsable du premier cas de méningite à H. haemolyticus jamais observé à notre connaissance. Tableau 1. Infections invasives à Haemophilus haemolyticus documentées en Origine de l isolat Âge du patient Présentation clinique Sang 4 mois Bactériémie et rhino-pharyngite L.C.R. 60 ans Méningite L.C.R. 84 ans Bactériémie sans point d appel Enfin, 26 isolats n appartenant pas au genre Haemophilus ont été identifiées comme : Pasteurella multocida subsp. multocida (n = 6, dont un isolat de méningite) Pasteurella multocida subsp. septica (n = 6, dont 3 isolats de septicémie) Pasteurella canis (n = 4), Pasteurella dagmatis (n = 2) Pasteurella bettyae (n = 3, salpingites) Neisseria bacilliformis, N. animaloris, N. cinerea, N. flavescens (n = 1) Achromobacter xylosoxidans (n = 2, otites externes) Capnocytophaga sputigena (n = 2, bactériémie et méningite) s Spectres de masse MALDI-TOF (n = 53) : suite à la publication du rapport 2011 du CNR indiquant la possibilité d interpréter à distance les spectres de masse de Pasteurellaceae obtenus sur un appareil Microflex (Bruker) et non identifiés par logiciel du fabricant, nous avons reçu 53 fichiers électroniques de spectres à analyser. Leur comparaison avec les spectres de référence de la base dédiée aux Pasteurellaceae du CNR a permis d identifier 39 isolats de H. haemolyticus, 6 de Haemophilus sputorum, 6 de P. canis et 2 de P. bettyae. s Autres échantillons biologiques (n = 16) : - Dix échantillons de LCR. Le gène ompp2 caractéristique de H. influenzae a été détecté dans un seul d entre eux, sans amplification de gène d encapsulation. Quatre des échantillons, négatifs pour H. influenzae, contenaient respectivement de l ADN de méningocoque (n = 2), pneumocoque (n = 1) et Streptococcus agalactiae (n = 1). - Cinq échantillons de liquide articulaire. Dans l un d eux l amplification des gènes ompp2, bexa et fcs a permis d affirmer la présence d une souche capsulée du sérotype f chez une patiente de 65 ans, la souche n ayant pu être cultivée par ailleurs. Les 4 autres, négatif pour H. influenzae, provenaient de jeunes patients de 3 à 12 ans. La présence d ADN de Kingella kingae a été détectée par nos soins dans 2 d entre eux. - Trois sérums pour dosage des anticorps anti-h. influenzae b, correspondant à 2 des 3 cas d infection à H. influenzae b recensés en 2013 : - cas n 1 : méningite chez un enfant de 29 mois ayant reçu les 2 premières doses de l ancien schéma vaccinal (2 e et 4 e mois), mais malheureusement pas l injection du 6 e ni le

8 6 booster du 15 e mois. Le taux d anticorps anti-hib au moment de l infection (0,3 mg/l) était nettement inférieur au taux considéré comme protecteur ( 1 mg/l). En revanche, 15 jours après l infection, ce taux a atteint 6,9 mg/l, indiquant une réponse anticorps efficace. La guérison de l enfant a été a priori complète, son audition devant être évaluée courant cas n 2 : méningite consécutive à un épisode d otite moyenne aiguë (OMA) chez un enfant d un an ayant reçu les 2 premières doses de l ancien schéma vaccinal (2 e et 4 e mois), mais malheureusement pas l injection du 6 e mois. Le taux d anticorps anti-hib au moment de l infection (0,2 mg/l) était nettement inférieur au taux considéré comme protecteur ( 1 mg/l). Un 3 e cas, plus dramatique, n a pu être exploré, faute d échantillon sanguin disponible après le décès du patient. Il s agissait d un nourrisson de 3 mois ½, présentant une méningite et choc septique fulminant ayant entraîné la mort en quelques heures. En raison de son tout jeune âge, l enfant n avait reçu que la 1 re dose du vaccin. La surveillance des enfants de la crèche que fréquentait le nourrisson n a pas révélé de cas secondaire dans les mois qui ont suivi. - provenance des échantillons : toutes les souches et échantillons biologiques d infection invasive provenaient de France métropolitaine sauf un (CH de Mamoudzou, Mayotte), s 62 de centres hospitaliers généraux s 27 C.H.U. (sur 30) s 10 laboratoires d analyse médicale de ville. - niveau de caractérisation réalisé : après vérification de l identification par SM-MT à l aide de la base de données dédiée au Pasteurellaceae du CNR, tous les isolats de H. influenzae, invasifs ou non, sont biotypés et sérotypés (agglutination à l aide d antisérums spécifiques). Le gène d encapsulation bexa est systématiquement recherché, et les souches qui le possèdent sont séro-génotypées par recherche des gènes des spécificités capsulaires a à f. De plus, le gène bcs encodant la spécificité b est recherché systématiquement afin de détecter les souches non capsulées dites «Hib -» (dont aucune n a été détectée en 2013). Les isolats d autres espèces sont identifiés par SM-MT, identification confirmée au besoin par séquençage de gènes domestiques (soda, reca, et/ou de l ARNr 16S). L expertise du CNR a été requise à trois reprises en 2013 pour identifier d éventuelles transmissions de souches de H. influenzae (i) dans un service de cardiologie, (ii) dans une maternité, (iii) dans un établissement d'hébergement pour personnes âgées dépendantes (EHPAD). Trois, quatre et six isolats ont été respectivement analysés par multilocus sequence typing (MLST), permettant de montrer qu il s agissait dans les trois situations d isolats indépendants, sans transmission croisée, à l exception du portage d une même souche par une mère et son nouveau-né.

9 7 Enfin, suite à la mise au point en 2011 de la détection par PCR de Haemophilus ducreyi et en l absence de laboratoire de référence, nous avons reçu et analysé deux échantillons de patients présentant des chancres génitaux. L ADN de H. ducreyi n a pu être amplifié dans aucun des deux cas. L un d eux au moins a pu être attribué à une infection herpétique. - Nombre de souches testées pour leur sensibilité aux anti-infectieux : La sensibilité à six familles d antibiotiques [bêta-lactamines, tétracyclines, macrolides, quinolones, rifamycines et sulfamides/triméthoprime] a été testée sur les 470 isolats de H. influenzae reçus en Le gène ftsi encodant la PLP3, principale cible des bêtalactamines, a été séquencé dans les 85 isolats de sensibilité diminuée au co-amoxiclav (CMI > 1 µg/ml). Les gènes des topoisomérases gyra et parc ont été séquencés chez 26 isolats résistant à l acide nalidixique. 2. Surveillance de lʼévolution et des caractéristiques des infections - Définition de l échantillon de souches isolées : 470 isolats de H. influenzae dont : - 20 isolats capsulés, invasifs (n = 17) ou non invasifs (n = 3) sérotype b (Hib), n = 3, invasifs : - 3 méningites infantiles (3, 12 et 24 mois), un décès - aucune infection de l adulte ou du grand enfant sérotype a (Hia), n = 2, invasifs : - 1 méningite infantile (nourrisson du CH de Mayotte) - 1 méningite mortelle, adulte de 28 ans, sans antécédent de voyage en Amérique du Nord ou dans l Indo-Pacifique (régions d endémie) sérotype e (Hie), n = 4, 3 invasifs, 1 non invasif : - 1 méningite infantile (4 mois) - 1 méningite post-traumatique de l adulte (65 ans) - 1 pneumonie bactériémique (adulte, 41 ans) - 1 exacerbation aiguë de mucoviscidose (enfant, 5 ans) sérotype f (Hif), n = 10, 8 invasifs, 2 non invasifs : - 1 méningite (adulte, 68 ans) - 1 arthrite septique (adulte, 73 ans) - 4 pneumonies bactériémiques (adultes, ans) - 2 bactériémies sans point d appel (enfant, 3 mois ; adulte, 90 ans) - 1 infection gynécologique (endométrite, adulte, 66 ans) - 1 bronchite (enfant, 3 ans) sérotype d (Hid), n = 1, invasive : - bactériémie sans point d appel (58 ans).

10 8-156 isolats invasifs (augmentation, + 6 % par rapport à 2012) Fig. 2. Répartition des sérotypes capsulaires des isolats invasifs, En bas à droite, données La proportion d isolats invasifs non capsulés est quasiment constante depuis En 2013, la part relative des isolats capsulés b était légèrement plus faible (2 %, 4 % en 2012). Parmi les souches capsulées, celles du sérotype f ont été le plus fréquemment isolées, comme c est aussi le cas dans les pays du Nord de l Europe. - Présentations cliniques des 156 infections invasives 1. Méningites (n = 35) : Fig. 3. Étiologies des 35 méningites à H. influenzae documentées au CNR en Caractéristiques notables des méningites à H. influenzae en 2013 : - 25 % des patients étaient hospitalisés en réanimation au moment du diagnostic ;

11 9 - Les trois décès rapportés au CNR concernaient des méningites à souches capsulées : Hib pour un enfant de 3 mois ½ (cf. supra p. 6, cas n 1), Hia pour un homme de 28 ans, et Hie pour une femme de 63 ans. - Une brèche méningée a été à l origine probable de l infection dans 20 % des cas (neurochirurgie, n = 4 ; traumatisme crânien, n = 4). - Comme en 2012, le seul cas de méningite infantile consécutive à une otite moyenne aiguë a été occasionné par une souche capsulée du sérotype b (enfant d un an, cf. supra p. 6, cas n 2). En revanche, 4 méningites consécutives à une otite et/ou une sinusite ont été identifiées chez des adultes de plus de 60 ans (isolats non capsulés). 2. Bactériémies sans méningite (n = 121) : Fig. 4. Étiologies des 121 bactériémies sans méningite associée documentées au CNR en Caractéristiques notables des bactériémies à H. influenzae sans méningite en 2013 : - 29,8 % des patients étaient hospitalisés en réanimation au moment du diagnostic. - Cinq décès directement imputables à l infection ont été rapportés au CNR, soit 4,1 % (âge moyen, 63 ans). - Les infections broncho-pulmonaires bactériémiques concernaient essentiellement des hommes de plus de 65 ans (âge moyen, 67 ans ; ratio H/F = 56 %). - Trois infections ostéo-articulaires ont été documentés : 2 arthrites septiques (enfant de 19 mois, souche non capsulée ; adulte de 73 ans, souche capsulée f), et une ostéïte/spondylodiscite post-chirurgicale (adulte de 54 ans, souche non capsulée). - Un unique cas d endocardite (le 2 e reçu en 5 ans au CNR) confirme la rareté de l isolement de H. influenzae dans ce contexte.

12 10 - Parmi les 44 isolats d infections gynécologiques et/ou materno-fœtales adressés au CNR, 8 étaient invasifs au décours de chorio-amniotites (n = 4), salpingite (n = 1) et infections néonatales (n = 3). Les isolats concernés appartenaient aux biotypes I, II, III, V et VI. Aucun n était capsulé. - Distribution des infections invasives selon l âge et le sérotype capsulaire L incidence des infections invasives à H. influenzae capsulé a été à peu près identique en 2013, 2012 et Les isolats capsulés représentaient une part moins importante des bactériémies que les années précédentes : 7,5 % en 2013 (14,5 % en 2012, 13 % en 2011, 18 % en ) (Fig. 5, droite). En revanche, ils ont été responsables de près d un quart (22,8 %) des méningites à H. influenzae en 2013 (18,6 % en 2012, 20 % en 2011, mais 35 % en ) (Fig. 5, gauche). Fig. 5. Distribution des 156 infections invasives à H. influenzae selon l âge et le sérotype capsulaire. À gauche, les méningites (n = 35), à droite, les bactériémies sans méningite (n = 121). Trois méningites à Hib et une à Hia ont été documentées chez des enfants (3-29 mois), témoignant de la virulence et du tropisme méningé de ces deux sérotypes en Pédiatrie. Un patient breton de 28 ans sans antécédent particulier est décédé d une méningite à Hia. Il s agit du 1 er cas métropolitain autochtone identifié depuis 5 ans au CNR. Tous les autres isolats de Hia reçus depuis 2009, y compris cette année (méningite du nourrisson, Fig. 5) provenaient du CH de Mayotte. s Souches capsulées et infections non invasives En 2013, le CNR n a reçu que 4 isolats capsulés mais non invasifs (1,2 %), tous responsables d infections broncho-pulmonaires. Comme en 2012, seuls les sérotypes e (n = 1) et f (n =3) étaient représentés.

13 11 - Caractéristiques principales des isolats d infections non invasives (n = 314) 1. Isolats dʼoma de lʼenfant : - 48 isolats d enfants âgés de 2 mois à 5 ans (âge moyen, 14 mois) ont été recueillis. - Aucun n était capsulé ; - 96 % appartenaient aux biotypes II (n = 23, 48 %), III (n = 13, 27 %) et I (n = 10, 21 %). - 7 seulement produisaient une bêta-lactamase (14,5 %) ; - 6 (12,5 %) étaient résistants au co-amoxiclav (critère EUCAST 2014, CMI 4 µg/ml), soit un taux significativement plus élevé que dans l ensemble des souches (4,2 %, cf. infra p. 14, Tableau 2). En appliquant le critère qui prévalait jusqu en 2012 (résistance, CMI 2 µg/ml), ce taux aurait été de 31,3 %, en nette augmentation par rapport à 2012 (18,6 %). - Comme en 2012, les isolats résistants au co-amoxiclav provenaient tous d enfants âgés de moins de 2 ans. 2. Infections en Gynécologie-Obstétrique : - 45 isolats ont été recueillis (+ 15 % par rapport à 2012 et 4 fois plus qu en 2011). Ils correspondaient à : 28 infections materno-fœtales (chorio-amniotites, n = 5 ; infections néonatales, n = 21, avortement spontané, n = 1 ; mort in utero, n = 1). 16 infections génitales en dehors de la grossesse (vaginites, n = 4 ; bartholinites, n = 4 ; salpingites, n = 4 ; endométrites, n = 4). L incidence croissante de ces infections est observée depuis deux ans en Europe, notamment au Royaume-Uni et aux Pays-Bas, le portage vaginal de H. influenzae étant à l origine de la plupart des cas. La transmission mère-enfant est principalement per partum, mais une contamination hématogène n est pas exclue dans les cas d avortement spontané et de mort in utero décrits ci-dessus. Nous allons poursuivre le recueil en demandant à nos correspondants les plus actifs si un prélèvement vaginal maternel peut être effectué lors des infections materno-fœtales pour tenter de corréler le risque d infection à l intensité de la colonisation par H. influenzae. - Les 45 isolats n étaient pas capsulés et appartenaient à 80 % aux biotypes II et III : biotypes, infections materno-fœtales : type II, n = 15 (54 %) ; type III, n = 8 (29 %) ; type I, n = 1 (3 %) ; type V, n = 2 (7 %); type VI, n = 2 (7 %). biotypes, infections génitales : type II, n = 8 (50 %) ; type III, n = 5 (32 %) ; type I, n = 2 (12 %) ; type V, n = 1 (6 %). Cette répartition est quasiment identique à celle des observée ces 3 dernières années. Elle confirme l absence d isolats du biotype IV dans ce contexte.

14 12 3. Surveillance de la résistance aux antibiotiques - définition de l échantillon de souches testées. Tous les isolats viables parvenus au CNR ont été testés vis-à-vis de 6 familles d antibiotiques. Les isolats invasifs ont été distingués des isolats de portage et d infections localisées. La résistance aux principales molécules d intérêt thérapeutique a également été étudiée dans 2 populations, (i) les isolats des enfants âgés de 2 mois à 5 ans, notamment ceux responsables d OMA, (ii) les isolats d infection bronchopulmonaire de l adulte (Tableau 2, infra, p. 14). - définitions utilisées pour exprimer la résistance. Pour la 1 re fois, les critères retenus ont été ceux de l EUCAST, adoptés fin 2013 par le Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie. Les CMI ont été mesurées en milieu de Mueller-Hinton à 5 % de sang de cheval défribriné mécaniquement et enrichi de 20 mg/l de bêta-nad (MH-F), par microdilution en bouillon ou par epsilométrie sur gélose (Etest). Lʼadoption des recommandations de lʼeucast a modifié les critères de sensibilité à lʼamoxicilline et au co-amoxiclav : les isolats de H. influenzae dont la CMI est égale à 2 µg/ml sont désormais sensibles à ces antibiotiques, alors quʼils étaient jusquʼalors considérés résistants. Il en a résulté une apparente diminution en 2013 du taux de résistance à l amoxicilline (21,5 % vs 22,5 % en 2012) et au co-amoxiclav (4,3 % vs 12,8 % en 2012). Il s agit d un artefact lié à la nouvelle définition, plus restrictive, de la population des isolats résistants. - résultats : s Sensibilité aux bêta-lactamines (Fig. 6) : - 78,5 % des isolats de H. influenzae adressés au CNR en 2013 étaient sensibles à toutes les bêta-lactamines (exception faite de l oxacilline, naturellement inactive). L accroissement de la population sensible par rapport à 2012 (77,5 % d isolats sensibles) n est qu apparent. Si l on avait adopté les critères de sensibilité utilisés en 2012, seuls 67 % des isolats de 2013 auraient été sensibles à toutes les bêta-lactamines. - 17,8 % des 470 isolats (n = 84) produisaient une bêta-lactamase, en augmentation significative par rapport à 2012 (13,4 %) ; - 4,3 % (n = 20) étaient résistants à l amoxicilline et au co-amoxiclav par mutation de la cible des bêta-lactamines, la PLP3. Là encore, ce taux apparemment faible par rapport à celui de 2012 (12,8 %) ne reflète pas l augmentation significative du nombre de souches présentant des mutations du gène ftsi de la PLP3 que nous avons observé en 2013 (85 isolats, soit 18,1 %). - Enfin, 3 souches (0,6 %) possédaient simultanément les deux mécanismes de résistance (bêta-lactamase et mutations de la PLP3 entraînant une CMI de co-amoxiclav 4 µg/ml).

15 13 - Répartition par catégories phénotypiques des 470 isolats (Figure 6) «bêta-lactamase -, aminopénicillines S» : BLNAS, 78,5 % (n = 369), «bêta-lactamase +, aminopénicillines R, mais co-amoxiclav S» : BLPAcS, 17,2 % (n = 81), «bêta-lactamase -, aminopénicillines R» : BLNAR, 3,7 % (n = 17), «bêta-lactamase + et co-amoxiclav R» : BLPAcR, 0,6 % (n = 3). Fig. 6. Sensibilité à l amoxicilline et au co-amoxiclav des 470 isolats de H. influenzae reçus en 2013 au CNR (toutes origines cliniques). Résistance, CMI > 2 µg/ml. Le repère rouge indique la limite entre isolats sensibles (à gauche) et résistants (à droite). En vert à motif : 54 isolats sensibles, mais dont la CMI est égale à 2 µg/ml et qui présentent tous des mutations de la PLP3 associées à une sensibilité diminuée aux bêta-lactamines. Jusqu en 2012, ils étaient considérés résistants. Les proportions des 4 phénotypes des 156 isolats invasifs étaient légèrement différentes, 29 (18,6%) d entre eux produisant une bêta-lactamase mais seulement 2 (1,3 %) étant résistants à l amoxicilline par mutation de la PLP3 (voir aussi Tableau 2, page suivante).

16 14 Tableau 2. Comparaison de la résistance aux principaux antibiotiques d intérêt thérapeutique des isolats cliniques de H. influenzae recueillis en En rouge, taux de résistance significativement plus élevés que dans la population générale. % de résistance (nombre) des isolats de Haemophilus influenzae, CNR 2013 Résistance tous (n = 470) invasifs (n = 156) respiratoires, adultes (n = 143) pédiatriques (âge, 2 mois-5 ans) OMA* (n = 48) hors OMA (n = 99) Bêta-lactamase + 17,8 (84) 18,5 (29) 21 (30) 14,5 % (7) 14,1 % (14) Co-amoxiclav 4,2 (87) 1,3 (2) 4,9 (7) 12,5 % (6) 1 % (1) Céfotaxime 1,5 (7) 0 0 6,3 (3) 0 Ceftriaxone 0,2 (1) (1) 0 Cotrimoxazole 32,6 (153) 24,3 (38) 35 (50) 43,8 (21) 39 (39) Fluoroquinolones 1,5 (7) 0,6 (1) 4,2 (6) 0 0 * Otite moyenne aiguë Résistance aux céphalosporines de 3 e génération (C3G) : sept isolats sur 470 (1,5 %) étaient résistants aux molécules utilisées per os (cefpodoxime et céfixime) et au céfotaxime (Figure 7). Fig. 7. Sensibilité au céfotaxime des 470 isolats de H. influenzae reçus en 2013, selon le phénotype de résistance à l amoxicilline. Sur fond rose : population résistante au céfotaxime (CMI > 0,125 µg/ml). Cette augmentation spectaculaire par rapport aux années précédentes (une seule souche résistante en 2012, CMI de céfotaxime = 0,25 µg/ml) s accompagne d un accroissement du nombre d isolats de CMI = 0,125 µg/ml (6,2 % en 2013 contre 1,4 % en 2012). Bien que tous les isolats sauf un aient été sensibles à la ceftriaxone, et que toutes les souches invasives soient jusqu à présent sensibles, le CNR recommande que lʼactivité dʼau moins une céphalosporine de 3 e génération soit mesurée en routine dans les laboratoires, en particulier sur les isolats dʼotite moyenne aiguë (cf. supra, tableau 2) l incidence de la résistance dans les différents types d infection].

17 15 Comme observé précédemment, l activité intrinsèque de la ceftriaxone était supérieure à celle du céfotaxime sur la quasi totalité des souches de H. influenzae, avec en moyenne deux valeurs de dilution d écart, y compris sur les souches de sensibilité diminuée par mutation de la PLP3 (Figure 8). Fig. 8. Sensibilité comparée au céfotaxime (en bleu) et à la ceftriaxone (en rouge), (i) en haut, des 470 isolats de H. influenzae reçus en 2013 par le CNR, (ii) en bas des 156 isolats d infections invasives. Les traits rouges indiquent la limite entre isolats sensibles (à gauche) et résistants (à droite). s Sensibilité aux fluoroquinolones : - 16 isolats (3,5 %) de H. influenzae résistants à l acide nalidixique ont été reçus en 2013 [8 (1,5 %) en 2012]. Tous présentaient au moins une mutation dans les régions QRDR des gènes des topoisomérases gyra et parc. Leurs CMI d ofloxacine (0, µg/ml) étaient supérieures à celles de souches sauvages (0,008-0,03 µg/ml), mais seuls 2 d entre eux étaient résistants à la lévofloxacine (CMI > 1 µg/ml) et 4 à l ofloxacine (CMI > 0,5 µg/ml) : - un isolat responsable de conjonctivite et d otite chez un enfant de 5 ans (CMI d ofloxacine et lévofloxacine =1 et 0,5 µg/ml, respectivement). - trois isolats d infections broncho-pulmonaires chez des adultes (53-81 ans) ayant tous reçu au moins une fluoroquinolone dans l année précédant l infection (CMI d ofloxacine = 1, 8 et 32 µg/ml, CMI de lévofloxacine = 0,5, 4 et 16 µg/ml).

18 16 Le nombre dʼisolats de sensibilité diminuée ayant doublé depuis 2012, le CNR recommande aux laboratoires de tester la sensibilité de tous les isolats infectieux selon les recommandations de lʼeucast/casfm (utilisation dʼun disque dʼacide nalidixique, et si le diamètre dʼinhibition est inférieur à 21 mm, mesure de CMI dʼune fluoroquinolone dʼintérêt thérapeutique). s Sensibilité à la rifampicine : toutes les souches testées étaient sensibles à la rifampicine (CMI comprises entre 0,03 et 0,12 µg/ml). s Sensibilité aux cotrimoxazole : 67,4 % des isolats (317 sur 470) étaient sensibles au cotrimoxazole (73 % en , 70 % en 2011 et 2012). Près de la moitié des isolats sensibles au cotrimoxazole étaient cependant résistants aux sulfamides, le triméthoprime restant seul actif. La population des isolats invasifs était plus sensible (75,7 %), alors que celle des souches d infections respiratoires de l adulte l était plutôt plus moins (65 %) (cf. Tableau 2, p.14). s Sensibilité aux tétracyclines : un seul isolat, responsable d une surinfection de BPCO, présentait une résistance de haut niveau aux tétracyclines, y compris (et de façon surprenante) à la minocycline (CMI = 64 µg/ml). s Sensibilité aux macrolides : aucune résistance acquise n a été observée en 2013, la totalité des souches étant de sensibilité intermédiaire selon les critères de l EUCAST/CASFM. - analyse des tendances. La diminution de la résistance à l amoxicilline par rapport aux années a marqué le pas cette année. Les proportions d isolats producteurs de bêtalactamase et/ou de sensibilité diminuée par mutation de la PLP3 sont redevenues similaires à ce qu elles étaient il y a une dizaine d année. Pour la 1 re fois depuis que le CNR est à Lille, deux isolats de CMI d amoxicilline 8 et 16 µg/ml ont été identifiés. La détection de telles souches est indispensable dans les laboratoires de Biologie, car elles sont associées à des échecs thérapeutiques dans l OMA du jeune enfant en cas d utilisation de bêta-lactamines orales dans ce contexte. À l inverse, aucun isolat invasif résistant au céfotaxime ou à la ceftriaxone n ayant été rapporté depuis 5 ans, les recommandations de traitement probabiliste des infections invasives par ces antibiotiques restent appropriées. L harmonisation des recommandations du CASFM et de l EUCAST est l occasion de sensibiliser les laboratoires à la détection des résistances, d autant que les résultats du contrôle national de qualité ANSM 2013 ont montré que l antibiogramme de H. influenzae n était pas maîtrisé par tous. Enfin, l évolution de la résistance aux fluoroquinolones suggère de rester vigilant quant à leur utilisation en alternative aux céphalosporines de 3 e génération pour le traitement des infections à H. influenzae.

19 17 4. Détection et investigation des cas groupés et des phénomènes anormaux Aucune transmission croisée d infections invasives n a été identifiée. (cf. supra p. 6). L épidémie grippale 2013 a été sans impact notable sur les infections signalées au CNR. Aucun des deux patients français infectés en 2013 par le coronavirus MERS n a présenté de surinfection à H. influenzae. Le CNR collabore depuis 2013 avec l association clinique et thérapeutique infantile ACTIV. Nous recoupons et complétons nos informations respectives sur les méningites pédiatriques à H. influenzae survenues en France dans le souci d améliorer l exhaustivité de notre recueil de données et de détecter des cas groupés. 5. Techniques développées en 2013 : - Identification des mutations du gène ftsi et corrélation à la diminution de sensibilité aux bêtalactamines, dans le cadre d un projet européen IBD-Labnet. - Mise en place du nouveau schéma de détection de la résistance aux bêta-lactamines proposé par l EUCAST (utilisation d un disque de pénicilline G en première intention, puis, en cas de résistance, détection de bêta-lactamase et mesure des CMI de bêta-lactamines d intérêt thérapeutique). Vérification de la cohérence des résultats avec ceux de la technique CASFM précédemment utilisée. Comparaison sur un panel de 100 souches des nouvelles géloses recommandées par l EUCAST pour l antibiogramme (MH-F) mises sur le marché par les 4 principaux fabricants. 6. Accréditation : Le Centre de Biologie Pathologie du CHU de Lille dont fait partie le CNR poursuit la démarche d accréditation des laboratoires (60 % environ des analyses bactériologiques sont accréditées depuis mars 2014). Comme indiqué dans le précédent rapport, les efforts financiers et humains consentis pour obtenir ce résultat ne nous permettent pas d envisager une accréditation spécifique du CNR. Aussi avons-nous choisi d inscrire l accréditation du CNR dans la démarche globale d accréditation du Centre de Biologie Pathologie. 7. Contrôle externe de qualité : Évaluation du CNR. En l absence de financement par l ECDC en 2013, le contrôle de qualité du réseau européen IBD-Labnet n a pu être mis en place en 2013 comme il l avait été en 2009, 2011 et Notre CNR n a donc pas été évalué cette année, mais le sera en 2014, l ECDC ayant accepté de prendre à nouveau à sa charge le CDQ IBD-Labnet.

20 18 Prestation de service : - Le CNR a fourni à son homologue belge (Centre de Référence Haemophilus influenzae, CHU Saint-Pierre, Bruxelles) un contrôle de qualité inter-laboratoire indispensable à l accréditation de ce dernier. Cinq échantillons ont été préparés, conditionnés et envoyés par nos soins à Bruxelles en septembre Nous avons analysé et commenté les résultats, et un compterendu détaillé a été adressé à nos collègues belges en décembre. - Le CNR a également fourni en 2013 les deux souches du contrôle national de qualité de l ANSM. Cette initiative a suscité un nombre considérable de demandes de renseignements, voire d expertise (!) des souches concernées. Contactés par plus de 200 laboratoires, dont 92 non-hospitaliers, nous avons constaté que nos collègues savaient où nous trouver. Une synthèse des réponses que nous avons pu leur fournir sera mise en ligne en 2014 sur la page web du CNR, dont nous nous assurons chaque mois que le lien apparaît en premier choix dans le moteur de recherche Google lors d une requête «CNR Haemophilus». 8. Publications scientifiques : - S. Le Quellec, O. Gaillot, F. Chotel, A.-M. Freydière, F. Laurent, F. Vandenesch et A. Doléans-Jordheim Septic arthritis caused by non-capsulated Haemophilus influenzae: about two cases. Journal of Clinical Microbiology 2013 ; 51: S. Spinali, V. Poitevin, R. J. Courcol, M. Simonet et O. Gaillot. MALDI-TOF mass spectrometry for instant differentiation of Haemophilus haemolyticus from Haemophilus influenzae. 113 th General Meeting, of the American Society for Microbiology, May 18-21, 2013 Denver, Colorado. (Affiche, abstract 3166). - N. Liassine, K. Baroli et O. Gaillot. Emergence of fluoroquinolones-resistance among three species of Haemophilus isolated in a clinical laboratory. 24 e (Affiche). ECCMID, mai 2014, Barcelone, Espagne. 8. Communication et enseignement : Enseignement magistral, formation des biologistes médicaux au diagnostic de H. influenzae - DES de Biologie Médicale inter-région Nord : «Haemophilus influenzae», 1 h 30 le 12/04/ Cours de Microbiologie médicale, Institut Pasteur : «Haemophilus influenzae», 4 h, 29/04/ Diplôme inter-universitaire de Microbiologie cellulaire, Lille 2-Paris VII : «Interactions cellulaires de Haemophilus influenzae», 2 h, le 5/03/2013. Conférences sur invitation : - «Haemophilus influenzae», 1 h, Institut Cochin, Paris, 05/02/ «Infections invasives à Haemophilus influenzae», 1 h, Hôpital Universitaire Saint-Pierre, Bruxelles, Belgique, 27/11/2013.

21 19 - «L antibiogramme de Haemophilus influenzae», 1 h, Centre de Biologie Pathologie, CHU de Lille, 11/02/14. - «État de la résistance aux antibiotiques de Haemophilus influenzae» 1 h, CHU Necker-Enfants Malades, Paris, 02/04/ Principales collaborations : Collaborations internationales - Participation au réseau européen Invasive Bacterial Diseases-Labnet (European Centre for Disease Control, Stockholm, Suède). Le CNR français coordonne le projet «European wide molecular typing of invasive BLNAR H. influenzae isolates» en fournissant aux CNR des 28 pays participant le protocole d analyse des mutations du gène ftsi de la PLP3 et en analysant les extraits bactériens de ceux des CNR qui n ont pas les moyens matériels de procéder au séquençage. Karine Baroli et moi-même sommes les curateurs du site de comparaison en ligne des séquences des gènes de résistance de H. influenzae que nous constituons dans la base publique PubMLST. - Collaboration avec le Centre de Référence Haemophilus influenzae de Belgique (Dr Anne Dediste, CHU Saint-Pierre, Bruxelles). Le CNR fournit une expertise génétique à son homologue belge, ainsi que l accès à sa base de données SM-MT pour l analyse des spectres de masse non reconnus par le logiciel commercial BioTyper. - Fourniture des données épidémiologiques annuelles relatives aux infections invasives françaises à H. influenzae pour la base de données européenne TESSy (en collaboration avec Susan Georges, InVS, Saint-Maurice). - Participation à l étude PneumoTone «Surveillance des pneumonies hospitalisées et des méningites bactériennes, Togo », coordinatrice, Dr Betty NJANPOP-LAFOURCADE, Institut Pasteur, Paris. Le CNR réalise l identification et le typage capsulaire et de la résistance aux bêta-lactamines de souches de méningites du district de Toné (Nord Togo). Collaborations nationales : - Observatoire national des méningites de l adulte : le CNR est partenaire du protocole «Cohorte des Méningites Bactériennes de l Adulte» (COMBAT, coordonnateur, Pr. Xavier Duval, CHU Bichat-Claude Bernard) pour la caractérisation phénotypique, antibiotypique et génétique des isolats de H. influenzae responsables de méningite provenant de 80 centres hospitaliers. Il réalise également la caractérisation directe de H. influenzae sur les échantillons biologiques (LCR, biopsie cutanée) dont la culture est négative.

22 20 - Agence Nationale de Sécurité du Médicament : fourniture des souches du contrôle national de qualité (avril 2013) et rédaction de la notice «Antibiogramme de Haemophilus influenzae» en CNR des méningocoques (collaboration avec le Dr Taha) : différenciation des Neisseria commensales et pathogènes de l oropharynx par SM-MT à l aide d une base dédiée du CNR Haemophilus influenzae. - Membre du Groupe de travail «Vaccination des prématurés», Haut Conseil de la Santé Publique. - Relecture des recommandations CASFM/EUCAST 2014 de la Société Française de Microbiologie.

23 ANNEXE Liste des marqueurs épidémiologiques disponibles au CNR s Biotype, antibiotype ; s Sérotype et génosérotype capsulaire ; s Étude du polymorphisme de macrorestriction (RFLP) ; s Étude du polymorphisme par MLST des isolats ou, par défaut, de l ADN du LCR ; s Étude du support génétique de la résistance aux bêta-lactamines et fluoroquinolones. Collections de souches, antigènes ou immun-sérums de référence : s Trois souches de référence pour contrôle de qualité de l antibiogramme, ATCC 49247, ATCC et ATCC s Ne fabriquant pas d immun-sérums, le CNR ne peut les fournir à ses correspondants. Liste des techniques de diagnostic/identification recommandées par le CNR : s Les procédures d identification conventionnelles et de caractérisation génétique des souches de H. influenzae sont fournies sur demande aux correspondants du CNR. Les séquences d amorces et conditions de PCR que nous utilisons sont également fournies sur simple demande. s Recommandations EUCAST/CASFM 2014 relatives à la mesure de la sensibilité aux antibiotiques. s Chapitre 34 consacré à l antibiogramme de H. influenzae dans l ouvrage «Antibiogram», P. Courvalin, R. Leclercq et L. B. Rice, eds. ASM Press, Washington 2010/ESKA, Paris Traduction et mise à jour du même chapitre dans la 3 e édition de l ouvrage «L Antibiogramme» de P. Courvalin, R. Leclercq et E. Bingen, éditions ESKA, Paris 2011.