UTILISATION DU BIOREACTEUR

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1 UTILISATION DU BIOREACTEUR MISE EN ROUTE DU REACTEUR Ouvrir l alimentation en vapeur avec les valves : VV-15 ; VV-50 ; VV-40 Ouvrir l alimentation en eau avec les valves : VE-F ; VE-C ; VE-20 Ouvrir l alimentation en air avec les valves : VA-F ; VA-02 (pression réglée à 20psig) NB : la sonde à ph doit toujours être positionnée sur HOLD lorsque le bioréacteur n est pas en mode fermentation PURGE DU CONDENSAT DES LIGNES DE VAPEUR S assurer que les valves VP-15 et VP-50 sont bien fermées Ouvrir les valves VV-15 et VV-50 Placer des récipients à la sortie des valves VP-15 et VP-50 Ouvrir légèrement la valve VP-15 afin de laisser sortir le condensat Fermer la valve VP-15 lorsque la vapeur commence à sortir Ouvrir légèrement la valve VP-50 afin de laisser sortir le condensat Fermer la valve VP-50 lorsque la vapeur commence à sortir Vider les deux récipients de condensat à l évier MISE EN MARCHE DU BIOREACTEUR Purger le condensat des lignes de vapeur Ouvrir les valves d alimentation en vapeur, en eau et en air Mettre en route l unité de contrôle (PLC) en enfonçant l interrupteur principal sur le devant du panneau de contrôle Allumer l ordinateur et l écran Le nom d usager est nvoyer et le mot de passe est boss Cliquer sur l icône LOGIN Le nom d usager est nvoyer et le mot de passe est boss Ouvrir le dossier FIX32 + ouvrir le dossier VIEW Dans la fenêtre de contrôle : cliquer sur BIOREACTEUR 20L pour avoir accès à la fenêtre principale 1

2 ETALONNAGE DES SONDES = ph et DO (oxygène dissous) Sonde ph : électrode ph-mètre Pour mettre la sonde sur HOLD : appuyer deux fois sur le bouton hold/temp Elle doit être étalonnée avant la stérilisation du bioréacteur Retirer la sonde du bioréacteur en la dévissant (en deux fois) Calibration dans le premier tampon : ph = 4 Placer la sonde dans le tampon Apres stabilisation de lecture : appuyer sur Cal Ab1 s affiche : appuyer sur enter Calibration dans le second tampon : ph = 7 Placer la sonde dans le tampon Apres stabilisation de lecture : appuyer sur Cal Ab2 s affiche : appuyer sur enter Sonde d oxygène dissous On étalonne la sonde DO à 0% : pendant la stérilisation lorsque la température du bioréacteur atteint 121 C On étalonne la sonde DO à 100 % : lorsque la température du bioréacteur atteint la température de culture (37 C pour une fermentation avec E.coli) Cocher la case contrôle O2 dissous sur la fenêtre principale après avoir calibré la sonde STERILISATION A autoclaver préalablement : Bouteille d acide (H3PO4) + aiguille d injection + tube en silicone Bouteille de base + aiguille d injection + tube en silicone Bouteille d antimousse + aiguille d injection + tube en silicone Filtre d entrée d air + aiguille d injection + vanne anti-retour + tube en silicone Avant le démarrage de la stérilisation, s assurer que le couvercle est bien mis en place, que les septums sont corrects et que tous les bouchons du couvercle sont bien vissés NB : Aucune aiguille ne doit être insérée dans le couvercle Avant le démarrage de la stérilisation, s assurer que le bioréacteur contient 20 litres de liquide afin d immerger les sondes Vérifier que les valves d alimentation en eau sont bien ouvertes : VE-F ; VEC ; VE-20 Vérifier que les valves d alimentation en vapeur sont bien ouvertes : VV-50 ; VV- 15 ; VV-40 2

3 Vérifier que les 2 valves VE-25 alimentant le condenseur du filtre de sortie d air sont fermées Ouvrir la valve de sortie d air du bioréacteur : VA-10 Dans la fenêtre principale du logiciel, sélectionner contrôle de température Sélectionner le mode chauffage vanne vapeur Sélectionner l onglet stérilisation + cocher stérilisation réacteur Indiquer les différents paramètres de stérilisation : Durée : 20 minutes Température de stérilisation : 121 C (pour le départ de la stérilisation) Tolérance de minuterie : 0,50 C Bande morte de refroidissement : 5 C (vitesse de refroidissement) Consigne de refroidissement : 100 C NB : si changement d un de ces paramètres = cliquer sur confirmation reset Cliquer sur le bouton DEPART NB : on entend le bruit des valves solénoïdes Sélectionner l onglet température Cliquer sur la SET POINT et ajuster la consigne de température à 121,5 C Sélectionner l onglet fenêtre principale et cliquer sur contrôle agitation Sélectionner l onglet agitation et entrer la consigne d agitation (200 rpm) Lorsque la température du bioréacteur atteint 101 C = fermer la valve VA-10 afin de pressuriser le bioréacteur Lorsque la température du bioréacteur atteint 121 C = la stérilisation commence et la minuterie se met en route Calibrer la sonde DO à 0% + ouvrir légèrement la valve VA-10 afin de faire circuler de la vapeur dans le filtre de sortie d air pour le stériliser Lorsque la durée de stérilisation sera terminée, la consigne de température sera automatiquement modifiée à la température de refroidissement = 100 C Lorsque la température atteindra 100 C = brancher stérilement (sous flamme) l aiguille du filtre d entrée d air dans le septum prévu à cet effet A l issue, ouvrir complètement la valve de sortie d air VA-10 Sélectionner l onglet DO et cliquer sur aération manuelle + ajuster à 5L.min -1 Sélectionner l onglet Température et modifier la valeur par la température de fermentation (pour E.coli T=37 C) + calibrer la sonde DO à 100% Température Check point : Avant le début de la stérilisation 101 C = fermer la valve VA C = déclenchement minuterie de stérilisation calibrer la sonde DO à 0% ouvrir légèrement VA-10 Après la fin de la stérilisation 100 C = insérer stérilement l aiguille du filtre d entrée d air 37 C = calibrer la sonde DO à 100% NB : après calibration de la sonde, cocher contrôle O2 dissous dans la fenetre principale 3

4 FERMENTATION Ouvrir les valves d alimentation en eau : VE-F ; VEC ; VE-20 Ouvrir les valves d alimentation en vapeur : VV-50 ; VV-15 ; VV-40 Purger le condensat des lignes de vapeur S assurer que les sondes ph et DO sont bien étalonnées S assurer que le bioréacteur a bien été stérilisé Insérer stérilement les aiguilles des bouteilles d acide, de base et d anti mousse et place les tubes en silicone dans les pompes péristaltiques Ouvrir les 2 valves VE-25 alimentant le condenseur du filtre de sortie d air Ouvrir la valve de sortie d air : VA-10 Ajuster la hauteur de la sonde anti mousse (5 à 15 cm au dessus du liquide) Dans la fenêtre principale, cocher fermentation Sélectionner l onglet température et entrer la valeur de température désirée pour la fermentation (T=37 C pour E.coli) Sélectionner l onglet ph et entrer la valeur de ph désirée (ph=7,4 pour E.coli) Sélectionner l onglet DO Cocher le mode contrôle agitation et contrôle oxygène dissous Entrer la valeur de consigne de la DO en % de saturation Entrer les vitesses minimum et maximum d agitation en rpm Entrer le % de la plage de DO pour le contrôle d agitation Entrer les débits minimum et maximum d aération Cocher le mode contrôle agitation et aération manuelle Entrer la valeur du débit d air Sélectionner l onglet agitation et entrer la consigne de vitesse d agitation Aération manuelle : Vitesse : 200 à 400 rpm Débit O2 : 5 à 20 L.min -1 Débit d air : 5 L.min -1 Dans la fenêtre principale, sélectionner : Contrôle agitation Contrôle température : vanne vapeur Contrôle ph : enlever le mode HOLD du bioréacteur en cliquant deux fois sur TEMP Contrôle mousse Dans la fenêtre principale, appuyer DEPART Revérifier chaque consigne : température-ph-do-agitation-aération Pour contrôler les différentes valeurs, cliquer sur lectures dans la fenêtre principale Lorsque le temps de fermentation est atteint, appuyer sur OOF dans le fenêtre principale pour arrêter la fermentation Mettre la sonde à ph sur HOLD Récolter votre culture par la valve de vidange préalablement stérilisée ou effectuer une centrifugation de votre culture A l issue, remplir le bioréacteur d un volume de 20 litres d eau déionisée afin d immerger les sondes 4

5 Retirer toutes les aiguilles du couvercle : acide-base-anti mousse-air + replacer les bouchons sur les septums Effectuer une stérilisation du bioréacteur : Dans la fenêtre principale du logiciel, sélectionner contrôle de température Sélectionner le mode chauffage vanne vapeur Sélectionner l onglet stérilisation + cocher stérilisation réacteur Indiquer les différents paramètres de stérilisation : o Durée : 20 minutes o Température de stérilisation : 121 C (pour le départ de la stérilisation) o Tolérance de minuterie : 0,50 C o Bande morte de refroidissement : 5 C (vitesse de refroidissement) o Consigne de refroidissement : 100 C Cliquer sur le bouton DEPART Sélectionner l onglet température Cliquer sur la SET POINT et ajuster la consigne de température à 121,5 C Sélectionner l onglet fenêtre principale et cliquer sur contrôle agitation Sélectionner l onglet agitation et entrer la consigne d agitation (200 rpm) Lorsque la température du bioréacteur atteint 101 C = fermer la valve VA-10 afin de pressuriser le bioréacteur Lorsque la température du bioréacteur atteint 121 C = la stérilisation commence et la minuterie se met en route Lorsque la durée de stérilisation sera terminée, la consigne de température sera automatiquement modifiée à la température de refroidissement = 100 C Changer la valeur de la température afin de faire refroidir le bioréacteur Une fois le bioréacteur refroidit, vider le volume du bioréacteur dans le drain à l aide du tube en silicone et ouvrir le bouchon vitré du couvercle pour laisser entrer de l air Procéder au nettoyage du bioréacteur NETTOYAGE DU BIOREACTEUR Dans la fenêtre principale, sélectionner Nettoyage Retirer du couvercle : la sortie d air (avec condenseur) + la jauge à pression + la sonde anti mousse Retirer le couvercle en dévissant les 6 vis à tête hexagonale à l aide de la clé Allen adéquate Nettoyer le couvercle dans le robinet à l aide d une brosse avec de l eau déminéralisée et du savon + rincer à l eau déminéralisée Vérifier les joints et les septums, si besoin les changer Nettoyer l intérieur du bioréacteur avec de l eau déminéralisée, du savon et la brosse : drainer lorsque c est fini A l issue, remplir le bioréacteur d un volume de 20 litres d eau déminéralisée afin d immerger les sondes Remettre le couvercle en place et le visser avec la clé Allen et les 6 vis selon un «cross- pattern» Aligner le couvercle de façon à ce que le bouchon sans septum soit vis à vis du tuve d injection d air Replacer sur le couvercle : la sortie d air (avec condenseur) + la jauge à pression + la sonde anti mousse 5

6 Procéder à la fermeture du système du logiciel Fermer les valves d alimentation en eau : VE-F ; VEC ; VE-20 Fermer les valves d alimentation en vapeur : VV-50 ; VV-15 ; VV-40 Fermer les valves d alimentation en air: VA-F ; VA-02 FERMETURE DU SYSTEME Dans la fenêtre principale, appuyer sur ARRET afin de mettre le système sur OFF S assurer que le bioréacteur contient un volume de 20 litres en eau déminéralisée afin d immerger les sondes Fermer les valves d alimentation en eau : VE-F ; VEC ; VE-20 Fermer les valves d alimentation en vapeur : VV-50 ; VV-15 ; VV-40 Fermer les valves d alimentation en air: VA-F ; VA-02 6