Explorations complementaires en Hematologie Cellulaire

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1 02/10/14 KOUTZOUZIAN Alexandra L3 CR : REYNAUD Théo Tissu Sanguin Dr Marina Lafage-Pochitaloff 16 pages Explorations complementaires en Hematologie Cellulaire Plan A. Ge ne ralite s d'une suspicion de leuce mie B. Leuce mie mye loïde chronique (LMC) I. Quelques caracteristiques de la LMC II. Circonstances de decouverte III. Le myelogramme IV. Le caryotype V. La RQ-PCR (Real time Quantitative Polymerase Chain Reaction) VI.La technique de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) VII. Le role de la proteine Abelson dans la LMC VIII. Traitements et suivi de la LMC en phase chronique IX.La transformation de la LMC en phase aiguë C. Leuce mie aigue lymphoblastique (LAL) I. Quelques caracteristiques de la LAL II. La cytometrie de flux (CMF) III. Classification IV. Leucémie avec translocation 9 22 (Ph) V. L'hyperdiploïdie VI.Leucémie avec translocation / TEL-AML1 VII. La translocation t(4;11)/mll-af4 VIII. La CGH IX.Apport de la CMF dans le suivi de la maladie : Etude de la maladie residuelle A. Ge ne ralite s d'une suspicion de leuce mie La suspicion d'une leucémie se fait à travers des signes cliniques et biologiques diversement associés. Cliniquement, on note des signes d'insuffisance médullaire c'est-à-dire anémie, syndrome infectieux et syndrome hémorragique ; et des signes tumoraux avec des douleurs osseuses (la plupart des hémopathies malignes prennent naissance dans la moelle osseuse à partir de cellules hématopoïétiques donc tous les organes de l'hématopoïèse sont impliqués), une splénomégalie, une adénomégalie et une hépatomégalie. Ce qui est évocateur c'est l'association de ces signes cliniques. Tout cela entraîne la prescription d'une NFS avec les réticulocytes. À l'hémogramme, on peut voir : anémie arégénérative neutropénie thrombopénie hyperleucocytose (liée à la présence de cellules anormales dans le sang c'est-à-dire des blastes ou des précurseurs qui semblent normaux, c'est ce qu'on appelle une myélémie : «de la moelle dans le sang»). Dès que l'hémogramme est anormal, on contrôle avec un frottis sanguin. 1/16

2 Lorsqu'à l'hémogramme certains de ces signes sont aussi associés, on est amené à faire un myélogramme et si on a une forte suspicion d'hémopathie maligne, à partir d'un même prélèvement de moelle on réalise : Myélogramme (frottis) Immunophénotypage (cytométrie en flux) Cytogénétiques : caryotype, FISH, CGH Biologie moléculaire Pour que ce soit plus «imagé» le reste du cours se fait à travers deux exemple d'hémopathies malignes. B. Leuce mie mye loide chronique (LMC) I. Quelques caracteristiques de la LMC La LMC est une hémopathie maligne, une pathologie de la cellule souche hématopoïétique. Elle est classée dans le syndrome myéloprolifératif chronique ou néoplasies myéloprolifératives de l'oms. Elle a pour caracteristique d'avoir une evolution naturelle en 3 phases : Phase chronique : prolifération et différenciation, si on ne fait rien elle évolue en leucémie aiguë Phase d'accélération (transition) Phase aiguë : appelée aussi acutisation, transformation, ou leucémie aiguë Cette maladie est caractérisée par la présence d'un marqueur clonal appelé chromosome Philadelphie (Ph) qui entraîne la présence d'un gène anormal BCR-ABL qui s'exprime sous la forme d'un transcrit BCR-ABL. Ce transcrit est traduit en une protéine à activité tyrosine-kinase élevée remarquable. On dispose maintenant d'un traitement ciblé anti-tyrosine kinase (ATK) donc on peut traiter cette leucémie chronique par quelque chose qui n'est pas un agent anti-mitotique : c'est une thérapie ciblée. Il s'agit d'une maladie rare, l'incidence est de 10 cas / an / million d'habitants. Cependant la prévalence augmente car le taux de mortalité a diminué grâce au traitement efficace : dans 90% des cas la maladie est contrôlée. Les facteurs de risque sont ceux qui entraînent des cassures de l'adn (benzène, solvant, radiations...). On dit que c'est une pathologie de l'homme d'âge mûr puisqu'elle touche plus les homme que les femmes (1,4 homme pour 1 femme) et l'âge moyen de diagnostic est 54 ans. Mais on peut la voir à tous les âges, bien que ce soit très rare chez l'enfant et exceptionnel avant 5 ans. 2/16

3 II. Circonstances de decouverte On découvre une LMC soit chez une personne qui souffre d'asthénie soit lors d'un hémogramme systématique (médecine du travail...). L'examen clinique, s'il est fait au début de la maladie, est normal le plus souvent mais si la maladie a déjà commencé à évoluer on peut voir des signes tumoraux en particulier une splénomégalie et des signes liés à l'hyperleucocytose qui est installée depuis un moment et peut entraîner des thromboses veineuses ou artérielles. Exemple de frottis sanguin : il est beaucoup trop riche, on a une hyperleucocytose (100G/L) due à une polynucléose neutrophile et une myélémie. À l'hémogramme, tout ce qui est en gras est anormal : Globules rouges 5,5 T/L (Norme (N) : 4,5 6,2 (homme)) Hemoglobine 15,5 g/dl (N : (homme)) Teneur Corpusculaire Moyenne en Hemoglobine 30 pg (N : 27 +/- 2) Volume Globulaire Moyen 90 microns cube (N : 82-98) Globules blancs 64 G/L (N : 4-10) Polynucleaires neutrophiles 58 % soit 37G/L (N :1,7-7) Polynucleaires eosinophiles 2 % soit 1,3 G/L (N : 0,05 0,5) Polynucleaires basophiles 4 % soit 2,6 G/L (N : 0 0,05) Monocytes 2 % soit 1,3 G/L (N : 0,1-1) Lymphocytes 6 % soit 3,8 G/L (N : 1,5-4) Myeloblastes 1 % soit 0,6 G/L Promyelocytes 3 % soit 1,9 G/L Myelocytes 18 % soit 11,5 G/L Metamyelocytes 6 % soit 3,8 G/L Plaquettes : 510 G/L (N : ) La lignée rouge n'est pas touchée. Les plaquettes sont en général augmentée. L'anomalie profite surtout à la lignée granuleuse. En revanche elle ne profite pas vraiment aux lymphocytes B et T. /!\ Le pourcentage ne compte pas, seule la valeur absolue est importante! Les examens complémentaires à faire sont : un myélogramme un caryotype c'est-à-dire une cytogénétique sur moelle mais on peut le faire aussi sur du sang car il y a une myélémie donc présence de cellules malignes dans le sang (on peut avoir des cellules en division) biologie moléculaire sur sang III. Le myelogramme On observe une moelle très riche. On voit toutes sortes de cellules donc il y a un polymorphisme ce qui est rassurant par rapport à un diagnostic de leucémie aiguë où l'on ne trouve que des cellules immatures. Les mégacaryocytes sont anormaux, de petite taille. En fonction de la phase de la maladie, le pourcentage de cellules immatures varient : Phase chronique : myéloblastes < 10 % Phase accélérée : 10 % < myéloblastes < 20 % Phase acutisée en leucémie aiguë myéloïde (LAM) : myéloblaste > 20% Cependant ce n'est pas le myélogramme qui va faire le diagnostic de LMC, on a besoin pour cela des marqueurs génétiques. Il peut s'agir de marqueurs cytogénétiques qu'on obtient en faisant un caryotype. 3/16

4 IV. Le caryotype Le chromosome Ph a été découvert en 1960, c'était le premier marqueur clonal d'une hémopathie maligne. C'est un tout petit chromosome, beaucoup plus petit que les autres. (Rappel : q = bras long d'un chromosome et p = bras court Le signe (+) devant les lettres indique l'ajout de matériel chromosomique au chromosome concerné et le signe (-) la perte de matériel.) Des années plus tard, grâce à des techniques de bande on a pu montrer que ce chromosome est 22q-. Il y a eu un échange de matériel entre les chromosomes 9 et 22 et donc le 9 est q+. C'est une translocation t(9;22)(q34;q11) (dans la deuxième parenthèse lire «q trois quatre et q un un» qui sont les points de cassure au niveau des bandes et sous bandes des chromosomes respectifs cités dans la première parenthèse) Pour obtenir ces images, le prélèvement de moelle osseuse et de sang (si cellules anormales) doit être stérile. Il y a de l'héparine dans la seringue mais ce n'est pas celle que l'on trouve dans les gazométries, elle est sans conservateur toxique puisqu'on doit cultiver les cellules. Le transport doit se faire rapidement et à température ambiante car les cellules meurent rapidement (½ vie +/- 24h). La mise en culture se fait sous une hotte à flux laminaire (stérile) et on met le prélèvement dans un flacon de culture. On essaie de recréer un environnement qui ressemble à la moelle osseuse. Le caryotype se fait en 1 à 3 jours. On arrête la culture en métaphase, puis on centrifuge et on fait un choc hypotonique (pour détruire les globules rouges et aussi permettre un gonflement cellulaire pour un étalement maximum des chromosomes). Enfin on étale sur des lames, on fait des colorations pour avoir les bandes et on observe au microscope. Dans les pays anglo-saxons on utilise des bande G (dénaturation chimique à la trypsine + coloration Giemsa) mais en France on fait plutôt des bande R (dénaturation à la chaleur en solution acide + Giemsa). Analyse ensuite au microscope et à l'analyseur d'image puis classement des chromosomes par paire. 4/16

5 Exemple de résultat : D'autres techniques sont importantes à réaliser dans les LMC notamment la PCR. V. La RQ-PCR (Real time Quantitative Polymerase Chain Reaction) Au niveau moléculaire, on trouve sur le chromosome 9 le gène ABL (Abelson) qui est un analogue d'un virus oncogène. Lors d'une cassure, s'il est mis en phase avec le gène BCR on obtient le gène de fusion BCR-ABL (on peut le visualiser avec les techniques d'hybridation in situ). La PCR est réalisée systématiquement quand on suspecte une LMC. Il existe différents types de transcrit : MBCR : le plus fréquent (99% des LMC). Le point de cassure se situe après l'exon b2 ou b3 sur BCR et un point de cassure entre les exons a1 et a2 sur ABL. Cela crée deux transcrits, b2a2 ou b3a2 qui sont très peu différents. mbcr : exceptionnellement le point de cassure sur BCR est beaucoup plus en 5' (en e1) donc le transcrit est beaucoup plus petit μbcr : exceptionnellement le transcrit est beaucoup plus long puisque le point de cassure sur BCR est complètement en 3' du gène (en e19) 5/16

6 La PCR est une technique très sensible, on peut détecter 1 cellule sur 1 million. Le prélèvement se fait le plus souvent sur le sang dans la LMC, même dans le suivi de la maladie contrairement aux leucémies aiguës où on utilisera plus souvent la moelle. On peut également utiliser des ganglions après les avoir coupé en morceaux et obtenu une suspension cellulaire. On extrait l'adn et/ou de l'arn à partir des cellules nuclées, on a besoin d'1ml de sang (ou de moelle). Quand on travaille sur l'arn, étant donné qu'il est très fragile on le transforme rapidement en ADNc grâce à la reverse transcription. Ensuite on applique les techniques de PCR c'est-à-dire des polymérisations en chaîne grâce à l'adn polymérase. On peut avoir des résultats sur gel avec un produit d'amplification spécifique qu'on va comparer à un marqueur de poids moléculaire. Mais maintenant on peut avoir des techniques de RQ-PCR, c'est une PCR en temps réel qui est en plus quantitative. Elle est aussi sensible que la PCR. Ce qui est intéressant c'est qu'elle permet de quantifier le transcrit. Ce n'est pas vraiment utile au diagnostic mais ça l'est pour le suivi. On peut voir une diminution de ce transcrit au fur et à mesure du temps. C'est basé sur les mêmes méthodes que la PCR mais on a en plus une sonde qui devient fluorescente quand le gène d'intérêt est retrouvé dans le tube d'analyse. On fait tout en dupliqué, tous les tubes sont en 2 exemplaires avec des témoins positifs (plasmide qui contient la séquence BCR-ABL) et des témoins négatifs. Dans l'exemple au-dessus, la courbe du patient se trouve entre les plasmides 104 et 105. Cela permet de quantifier mais pour réellement quantifier il faut faire le rapport avec un gène contrôle qui est exprimé de façon ubiquitaire (c'est ce qu'on appelle des gènes de ménage ou House Keeping Gene) qui peut être GUS ou ABL (présent sur l'autre chromosome 9 resté intact). On fait donc le rapport BCR-ABL / ABL qui va nous servir au diagnostic. Dans le suivi on fera le rapport de ce qu'on trouvera au suivi avec ce qu'on avait trouvé au diagnostic comme ça on verra la diminution au cours de la maladie. On regarde aussi la qualité de l'arn. En effet si on trouve un résultat négatif mais que le transcrit contrôle est très faible, ça veut dire que l'arn est dégradé et donc on ne peut pas rendre un résultat négatif. 6/16

7 VI.La technique de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) C'est un examen complémentaire du caryotype quand il n'est pas informatif. On prend une sonde moléculaire qui contient une séquence BCR et une autre qui contient une séquence ABL, chacune marquée d'une couleur différente. S'il y a une translocation entre les chromosomes 9 et 22, on verra la juxtaposition des deux signaux sur le chromosome Ph. Dans 10% des cas de LMC au diagnostic, on ne voit pas au caryotype le chromosome Ph. Dans ces cas là on s'intéresse aux résultats de la PCR, dans la moitié de ces 10% on a BCR-ABL positif et dans l'autre moitié des cas c'est négatif. Pour ces derniers cas où la clinique et le myélogramme sont très évocateurs d'une LMC, on complète le caryotype et la PCR par la FISH. Pourquoi on peut ne pas voir certaines choses au caryotype? Le caryotype est une analyse globale mais assez grossière du génome c'est-à-dire qu'un caryotype hématologique a 500 bandes (1 bande = 5 à kb ; 1 gène = 10 à 1000 kb). Donc il faut qu'il manque beaucoup de gènes pour qu'on voit quelque chose. De même certains échanges de chromosome sont trop petits pour être vus. Pour faire l'hybridation, les préparations cytogénétiques sont déposées sur des lames. On commence par une co-dénaturation : Dépôt de la sonde sur la lame, Élévation de la température à 75 C pendant 5 min : cela permet d'ouvrir l'adn de la sonde et des chromosomes. Retour à 37 C : on espère que des sondes simples brins vont se mettre sur les chromosomes simples brins. Lavages pour enlever toute hybridation non spécifique, Contre-colorations pour que les chromosomes et les noyaux soient bleus Enfin analyse au microscope et analyseur d'image Dans le cas où le caryotype est normal, on observe en FISH la juxtaposition des deux signaux sur un chromosome que l'on pensait normal. On a donc bien un signal de fusion sur un chromosome que l'on appelle alors der(22) (dérivé). Ce n'est pas dû à une translocation mais à une insertion : il y a deux points de cassure sur le chromosome 9 et un sur le 22 (dans la région BCR), le segment qui s'excise du chromosome 9 s'insère dans le chromosome 22 ce qui recrée un gène BCR-ABL sur le chromosome 22. Cela ne change rien au pronostic. En revanche c'est important à savoir pour le suivi qui se fera par hybridation in situ. 7/16

8 Il faut toujours utiliser au moins deux techniques (caryotype, PCR, FISH) pour faire le diagnostic car il implique une prise en charge très lourde que le patient prend pratiquement à vie (on ne parle pas encore de guérison mais de rémission très prolongée). En résumé si Ph est absent au caryotype, le plus souvent BCR-ABL est positif (PCR, FISH) et le patient va répondre au traitement ciblé. En revanche si BCR-ABL est négatif (PCR et FISH) mais que cela ressemble vraiment à une LMC, on est face à une forme atypique (frontière entre syndromes myoprolifératif et myodysplasique (SMP/SMD)) où le traitement ciblé n'aura pas d'effet donc le patient prendra plutôt des traitements classiques de chimiothérapie et peut-être même une greffe de moelle osseuse. VII. Le role de la proteine Abelson dans la LMC Si on injecte à une souris un virus qui contient BCR-ABL, on observe une pathologie qui ressemble à la LMC chez la souris. Ce gène est donc l'élément déclenchant de la maladie. La protéine Abelson fait partie des protéines kinases cytoplasmiques. Lorsqu'elle fonctionne normalement, la protéine ABL doit fixer une molécule d'atp pour fonctionner. Dans la protéine BCR-ABL, l'atp est fixé de façon permanente, donc l'activité ne s'arrête plus. Le fait de remplacer la partie N-terminal de la protéine Abelson par la partie N-terminal de BCR permet une dimérisation de la protéine qui entraîne une activation constitutive de la protéine BCR-ABL. Cette activation crée une cascade d'autres activations permettant la prolifération, la diminution de l'apoptose, une perte de l'adhérence cellulaire. VIII. Traitements et suivi de la LMC en phase chronique Tous ces traitements peuvent être utiliser actuellement : L'Hydréa est une chimiothérapie douce qui freine la prolifération cellulaire et que l'on donne tout de suite au patient avant d'avoir le résultat du caryotype, cela permet de baisser la leucocytose mais la maladie est toujours là. L'allogreffe est encore utilisée pour les patients qui résistent au traitement par inhibiteur des tyrosineskinases (5%). Si c'est un patient jeune il faut penser à l'allogreffe dans la première année L'interféron est une molécules qui existe depuis les années 90, c'est de l'immunothérapie. On arrivait à avoir des patients en rémission complète mais il y en avait très peu (10%) donc on l'a arrêté depuis qu'on a l'inhibiteur. Anti-tyrosine kinase : le plus connu est Imatinib (Glivec ), il est très bien toléré et très efficace mais parfois des patients résistent au traitement donc on peut être amené à utiliser des ATK de 2ème génération qui sont plus efficaces mais moins bien tolérés. 8/16

9 Comment fonctionnent les ATK? La protéine BCR-ABL a une poche dans laquelle l'atp entre ce qui active la protéine. L'imatinib mime l'atp et se met à sa place dans la poche. L'ATP ne peut alors plus entrer donc la protéine n'est plus activée. Les polynucléaires meurent et tout ce phénomène normalement s'arrêtent. Dans les premiers mois on surveille par le caryotype c'est-à-dire qu'on essaie d'avoir une réponse cytogénétique complète. La réponse cytogénétique partielle est acceptable à 6 mois mais à 1 an il ne faut vraiment plus voir de chromosome Ph. Le suivi peut se faire aussi par PCR. Niveaux de maladie : On suit le patient sur la NFS pendant les 2 3 premiers mois, puis ensuite sur PCR, caryotype et FISH (uniquement si absence du chromosome Ph). IX.La transformation de la LMC en phase aiguë Cette transformation est devenue exceptionnelle grâce au traitement ATK. Dans les cas où elle a lieu, au niveau cytologique on observe qu'il n'y a que des cellules immatures (blastes). On a donc un aspect monomorphe. On peut avoir soit une transformation en leucémie aiguë lymphoïde (précurseur en général de type B) ou alors plus souvent, dans les 2/3 des cas, c'est un précurseur ou un progéniteur de la lignée myéloïde en particulier la lignée qui donne les polynucléaires et les monocytes, c'est une leucémie aiguë myéloïde. 9/16

10 Au niveau du caryotype, à la phase chroniques on voit juste un chromosome Ph. S'il y a une accélération ou une acutisation, la plupart des cas on voit des anomalies chromosomiques clonales additionnelles (ACA). Par exemple ci-dessous il y a en plus un chromosome iso17q c'est-à-dire que le 17 a perdu ses bras court et a dupliqué ses bras longs. Or sur ces bras courts on trouve le gène codant pour la p53 (ça faisait longtemps '). Il y a donc une prolifération incontrôlée. C'est pour ça qu'au diagnostic il faut vérifier qu'il n'y a pas d'autre anomalie que le chromosome Ph. Le patient peut être en phase chronique cliniquement mais s'il a ces anomalies c'est qu'il va très vite se transformer en leucémie aiguë. Ces anomalies se retrouvent de façon récurrente en plus du chromosome Ph : Anomalie de nombre : trisomie 8 ou 19 Anomalie de structure : isochromosome 17q, isochromosome Ph ou une translocation 3-21 Anomalie de nombre et de structure : duplication du Ph La translocation 9-22 fait partie des mutations de classe I qui entraînent la prolifération sans empêcher la différenciation. Il y a des mutations de classe II comme par exemple la translocation 3-21 qui font que lorsqu'elles sont associées à une mutation de classe I, la cellule devient complètement proliférante et ne se différencie plus. 10/16

11 C. Leuce mie aigue lymphoblastique (LAL) I. Quelques caracteristiques de la LAL Ces leucémies se développent au dépens des progéniteurs de la lignée lymphoïde, B ou T. On parle de LAL B (75% des cas) ou de LAL T (25% des cas). La LAL est une maladie rare mais c'est la plus fréquente des hémopathies malignes chez l'enfant. Il s'agit d'une urgence diagnostic et thérapeutique. Chez l'enfant on guérit 80% les LAL. On fait des thérapeutiques adaptées qui dépendent des examens complémentaires. Les signes que l'on suspecte sont toujours les même, on fait un hémogramme en urgence et s'il est inquiétant on fait des explorations de la moelle osseuse : Myélogramme : résultats du frottis dans les 2h Immunophénotypage ou CMF (cytométrie en flux) : résultats le lendemain matin Cytogénétique : résultats dans la semaine Biologie moléculaire : résultats dans la semaine mais il y a tellement de gènes à analyser que ça peut aller jusqu'à 3 semaines Il y a beaucoup de formes différentes de LAL B, on a par exemple la translocation 9-22 qui est l'anomalie la plus fréquente chez l'adulte. /!\Le chromosome Ph au sein des syndromes myoprolifératifs chroniques est spécifique de la LMC mais au sein des hémopathies on le retrouve dans les LAL qui ne sont pas toujours des transformations de LMC. II. La cytometrie de flux (CMF) ou immunophenotypage Pour savoir si c'est une LAL B ou T il faut faire un immunophénotypage Le prélèvement peut être du sang, de la moelle osseuse, des liquides biologiques mais également un ganglion (mis en milieu humidifié), et il doit être acheminé rapidement, à température ambiante. On prélève sous anticoagulant (le plus souvent de l'edta, parfois de l'héparine). Pour la CMF, les cytologiste ont environ 350 anticorps qu'ils peuvent appliquer sur des suspensions cellulaires pour typer leur cellule. Ils ne les utilisent pas tous à chaque fois, en fonction de ce qu'on suspecte ; ils utilisent des panels d'anticorps. En général il y a une 20aine ou une 40aine d'anticorps par analyse. Les anticorps sont marqués en général par des fluorochromes. Ces anticorps vont aller se fixer sur les CD (Cluster de Différentiation) notamment le CD10 (ou antigène Calla) dans la LAL B de l'enfant qui va permettre de voir le degré d'immaturité de la cellule. On fait passer l'échantillon dans l'appareil, un laser analyse les cellules marquées par un anticorps. Ensuite on analyse en fonction de la taille de cellule, de sa granularité et des anticorps qui y sont présents. On obtient des nuages de points : 11/16

12 Selon les fenêtres, les images ont différents aspects. On peut analyser jusqu'à 105 cellules. Cette technique peut aussi être utilisée dans le suivi de la leucémie aiguë. L'immunophénotypage n'a aucun intérêt pour la LMC dans la phase chronique car elle n'a pas de marqueurs membranaires caractéristiques en revanche dans la phase aiguë oui. Dans les leucémies on retrouve das marqueurs normaux mais parfois on trouve des marquages aberrants. Dans une leucémie on parle de profil antigénique associé à la leucémie (LAP : leukemia associated profile). Ce profil correspond à : l'intensité d'expression l'asynchronisme de maturation des infidélités de lignée : par exemple on peut avoir des LAL avec un marquage CD13 ou CD33 qui sont des marqueurs myéloïdes l'évolution du clone Les hématogones sont des cellules immatures mais normales. III. Classification Dans les LAL T on trouve des marqueurs différents. Il existe une classification européenne appelée EGIL qui indique le degré d'immaturité de la leucémie. Si le progéniteur qui est devenu malin et très immature on l'appelle BI ou ProB, il sera CD10-. BIV ne fait plus partie des LAL, ce sont des leucémies aiguës matures. C'est la même chose que les lymphomes de Burkitt où là on a des Ig de surface positives. Dans ces cas là le traitement est à part. On a la même classification pour les LAL T : On a des anomalies cytogénétiques, dans les ¾ des cas de LAL on trouve des anomalies du caryotype aussi bien chez l'adulte que chez l'enfant. Ces anomalies ont un but diagnostic et très souvent pronostic. Les répartitions ne sont pas les mêmes entre l'enfant et l'adulte mais on retrouve les mêmes anomalies. Cela peut expliquer pourquoi chez l'enfant on a 80% de guérison alors que chez l'adulte 40%, les formes plus graves comme BCR-ABL sont plus fréquentes chez l'adulte que chez l'enfant. On va voir maintenant 3 entités au sein des LAL B : Leucémie avec translocation 9 22 (Ph) Translocation / TEL-AML1 La translocation t(4;11) / MLL-AF4 12/16

13 IV. Leucémie avec translocation 9 22 (Ph) C'est rare chez l'enfant et fréquent chez l'adulte. On peut utiliser de la FISH où l'on verra des anomalies sur chromosome et sur noyau et on peut aussi faire la PCR. La différence par rapport à la LMC c'est que dans les 2/3 des cas le point de cassure est mbcr. Les inhibiteurs tyrosine-kinase marchent aussi dans ces LAL à condition qu'on ait bien le chromosome Ph. Depuis qu'il y a l'imatinib, on a 80% de survie à 2 ans alors qu'avant on était à 30% de survie même avec la greffe de moelle. Néanmoins on ne donne pas que de l'atk, il y a aussi une chimiothérapie lourde. Sur les caryotypes des patients, on retrouve la translocation t(9;22), mais on peut egalement retrouver plusieurs autres anomalies clonales additionnelles : Des gains tels qu'une hyperdiploidie, une duplication du chromosome Ph, une trisomie 8. Des pertes telles qu'une monosomie 7, deletion 7p qui contient le gene Ikaros ou IKZF1. La deletion de ce gene (soit entier, soit une partie) est associe a un mauvais pronostic. V. Leucémie aiguë avec hyperdiploïdie > 50 sans chromosome Ph L'hyperdiploïdie (sans chromosome Ph) représente ¼ des leucémies de l'enfant et c'est plus rare chez l'adulte. Au caryotype on observe plus de 50 chromosomes et ce sont toujours les mêmes qui sont gagnés. Il s'agit apparemment d'un problème du fuseau mitotique qui crée un avantage de prolifération de la cellule. En général il y a un très bon pronostic (> 85%) VI.Leucémie avec translocation / TEL-AML1 C'est la 2ème forme la plus importante chez l'enfant. Elle est rare chez l'adulte. Cette translocation ne se voit absolument pas au caryotype parce que les segments échangés sont de petite taille et de même coloration : c'est la dernière bande du bras court du 12 qui s'échange avec la dernière bande du bras long du 21. On la voit uniquement en hybridation in situ ou en PCR. En FISH on utilise une sonde qui correspond au gène TEL pour le 12 et une qui correspond au gène AML1 pour le 21. On obtient un signal de fusion sur le chromosome 21. Le pronostic est très favorable. 13/16

14 VII. La translocation t(4;11)/mll-af4 Il existe des formes de très mauvais pronostic, elles impliquent un gène appelé MLL (myeloid lymphoid leukemia). Ce n'est pas très fréquent mais on le retrouve dans 80% des LAL du nourrisson de moins de 1 an («infant leukemia). Le plus souvent MLL est recombiné avec un gène qui est sur le chromosome 4. Cela se voit au caryotype, il y a une translocation entre le 4 et le 11 (11q+ et 4q-). On peut le voir aussi en FISH mais cette fois ci on a 2 types de sondes possibles : les sondes de fusion (comme pour ABL) et les sondes de séparation que l'on utilise pour MLL car il a 70 partenaires. On utilise le gène luimême qui est marqué en 5' et en 3' et si on a une translocation, les deux signaux se séparent. Le pronostic est défavorable, le plus souvent c'est une indication d'allogreffe de moelle. Cette translocation se voit aussi chez l'adulte même si c'est plus rare. VIII. La CGH Enfin il existe des techniques encore plus récentes que l'on appelle CGH (hybridation génomique comparative) ou puces (à ADN, ARN,...). Cette méthode est aussi basée sur l'hybridation. On fragmente l'adn du patient et on l'amplifie par PCR. Le marque ensuite soit directement avec fluorochrome soit indirectement avec une biotine mais après on met un anticorps anti-biotine fluorescent et d'un autre côté on a un témoin normal marqué d'une autre couleur. On fait l'hybridation sur des lames qui contiennent des gènes, des séquences et selon l'intensité d'hybridation par rapport à un témoin normal on verra le nombre de copie du gène. C'est donc surtout pour voir des nombres de copie (pertes, gains). On peut aussi voir des UPD (uniparental disomy) : on perd un chromosome et on duplique l'autre. Toutes ces anomalies sont acquises, seules les cellules malignes les ont. 14/16

15 On peut faire avec cette technique un diagnostic d'hyperdiploïdie (> 50) mais pour les leucémie MLL on ne voit rien car ça ne met pas en évidence des réarrangement chromosomiques, des anomalies de structure, on ne peut voir que des pertes ou des gains. Sur ce schéma on a rapporté les chromosome en ordonnée et les types d'anomalie en abscisse : On peut voir qu'il existe des leucémies hypodiploïdes. Avec cette technique on peut voir par exemple la perte d'un gène comme on a pu voir dans la majorité des cas de translocation 9 22 la perte d'ikaros, mais on peut aussi voir cette perte dans 10% des cas de leucémies aiguës BCR-ABL négatives. Cette perte entraîne un mauvais pronostic. IX. Apport de la CMF dans le suivi de la maladie : Étude de la maladie residuelle MRD : minimal residual disease C'est la maladie résiduelle minime qui peut persister jusqu'à 1 an après le traitement. Quand elle persiste c'est un mauvais pronostic, on est donc amené à greffer le patient. Après la greffe il reste moins d'1 cellule sur mais on ne peut pas dire s'il y en a pas du tout car la technique n'est pas assez sensible. Une autre technique est utilisée pour le suivi des patients. C'est une technique moléculaire appelé suivi par IgTCR. Les progéniteurs lymphoïdes dans les LAL sont déjà engagés dans la différenciation donc ils ont souvent commencé à réarranger leurs Ig. Toutes les cellules tumorales ont le même réarrangement ce qui va nous permettre de les suivre mais il faut repérer ce réarrangement dès le diagnostic. Chaque patient a un réarrangement différent que l'on caractérise par les techniques de PCR et de séquençage. Dans les LAL B, on retrouve le réarrangement physiologique dans 85% des cas et parfois on en aura des aberrants. C'est à peu près la même chose pour les LAL T. Cette technique est très sensible et très spécifique. On peut l'utiliser après la première cure de chimiothérapie, la deuxième cure voire après la troisième cure. Avoir plus d'1 cellule sur 100 après l'induction de la première cure c'est de pronostic défavorable. Pour ces patients on considère l'allogreffe de moelle. 15/16

16 CONCLUSION : Quand on fait le bilan d'une hémopathie maligne au diagnostic on fait toutes ces analyses génétiques car on sait qu'il y a des anomalies cytogénétiques ou moléculaires acquises dans la majorité des hémopathies malignes. Elles ont une valeur diagnostic (Ph dans les LMC qui induit une indication thérapeutique) et pronostic (hyperdiploidie chez l'enfant, rearrangement MLL,...). Ces marqueurs de clonalité établis au diagnostic vont nous permettre de suivre le patient. En pratique le suivi sur caryotype ne se fait que pour les LMC, on ne suit pas une LAL sur caryotype. Quand on est en rémission moléculaire majeure, le caryotype ne sert plus à rien. Le suivi moléculaire est aussi bien pour les LMC que pour les LAL avec la cytométrie en flux, les Ig-TCR, Toutes ces techniques sont complémentaires : Analyse globale du genome : caryotype (resolution kb) et CGH Analyses ciblees : FISH (resolution : 50 a 100kb), PCR (transcrits chimeriques), sequencage des genes d Ig et TCR dans LAL A retenir +++ pour ce cours : Les explorations complémentaires demandées selon les formes de leucémies L'apport des explorations sur les diagnostics de ces hémopathies. Les pronostics des différentes formes À Céline, Marion et leur nouveau canapé qui me permettent chaque jour de squatter chez elles, À Vanina et Marlène qui m'ont soutenu à tous mes ronéos (pas comme certains ;) ), À Malik... euh Schnell!!! (évite de te faire tuer en Palestine!!) À Malika, ma globe-trotteuse avec qui j'aurais dû passer le wei... À On qui décidément sait faire beaucoup de choses! Et surtout à toi Aurélien, merci de m'avoir emmené dans ce train... (reviens en un seul morceau et vivant toi aussi!!!) 16/16