Cellules souches hématopoïétiques

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1 Cellules souches hématopoïétiques Pr Bernard Klein INSERM-UM1 U1040: BIOTHERAPY OF NORMAL AND CANCER STEM CELLS INSTITUTE FOR RESEARCH IN BIOTHERAPY

2 Hématopoïèse! Plaquettes Les cellules du sang ont une durée de vie courte: - 1 journée pour les polynucléaires - Quelques jours pour les monocytes - 7 jours pour les plaquettes jours pour les globules rouges - De quelques jours à plusieurs années pour les lymphocytes! Les cellules du sang sont produites par des cellules souches présentes dans la moelle osseuse

3 Hématopoïèse! Plaquettes Chaque jour, l organisme doit produire Érythrocytes 200 x 10 9 /j Neutrophiles 40 x 10 9 /j Plaquettes 200 x 10 9 /j TOTAL: 440 x 10 9 /j! Les cellules du sang sont produites par des cellules souches présentes dans la moelle osseuse

4 L hématopoïèse a lieu dans la moelle osseuse! Dans la moelle osseuse! Dans tous les os (extrémités os longs, vertèbres, bassin, sternum, etc.)

5 Les cellules souches hématopoïétiques survivent et prolifèrent au contact des travées osseuses

6 OS, fémur OS trabéculaire Les cellules souches hématopoïétiques survivent et proliférent à proximité des travées osseuses

7 Les cellules du sang (CSH) sont produites par des cellules souches présentes dans la moelle osseuse. CSH purifiées

8 LES CELLULES SOUCHES Blood

9 Cellules souches et progéniteurs Une cellule souche est une cellule indifférenciée (cellule jeune, sans fonction physiologique) qui a pour propriétés : -! l'auto renouvellement!: la cellule souche se divise en deux cellules filles dont au moins une reste indifférenciée, avec les mêmes propriétés que la cellule mère, en particulier la propriété d'autorenouvellement. Ainsi la cellule souche se renouvelle constamment. - la génération des cellules différenciées, c est à dire capables d'assurer la fonction d'un tissu ou d'un organe. Une cellule souche peut être capable de générer plusieurs types de cellules différenciées. Un progéniteur peut avoir une grande capacité de prolfération et de différenciation, mais a perdu la capacité d autorenouvellement Cellule souche Progéniteurs Cellules différenciées 9!

10 Cins semaines d expansion et de différenciation Cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques CD34 Cellule souche multipotente Progéniteurs myéloïdes Progéniteurs Lymphoïdes Cellules du sang

11 Cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques 1.! Caractérisation 2.! Niche hématopoïétique 3.! Utilisation de cellules souches hématopoïétiques 4.! Collection et congélation 5.! Purification 6.! Greffe de cellules souches hématopoïétiques 7.! Modifications génétiques

12 Bradley et Metcalf, 1966: Premier test de mise en évidence des progéniteurs CULTURE EN MILIEU SEMI-SOLIDE Progéniteurs MOELLE OSSEUSE CULTURE EN MILIEU SEMI-SOLIDE ET FACTEURS DE CROISSANCE HÉMATOPOIÉTIQUES Fréquence = 1/1000 dans la moelle osseuse 14 jours!!test clonogénique!! identifie les CFU (colony forming unit)!! test fonctionnel BFU-E CFU-GM CFU-GEMM

13 De 50 à plusieurs milliers de cellules par colonie: de 6 à 12 divisions BFU-E Rouge: comprenant des cellules produisant de hémoglobine BFU-E Colonies générées par des progéniteurs de globules rouges CFU-GEMM CFU-GM Colonies mixtes Colonies générées par des progéniteurs immatures Comprenant des polynucléaires, monocytes Colonies générées par des progéniteurs de globules blancs

14 Cellules souches hématopoiétiques Cellule souche multipotente CFU-GEMM 1/10000 dans la moelle osseuse BFU-E 1/1000 dans la moelle osseuse CFU-GM 0,5/1000 Cellules du sang

15

16 LTC-IC : LONG TERM CULTURE INITIATING CELL, contient les cellules souches 1/ cellules dans la moelle osseuse FACTEURS HEMATOPOIETIQUES CELLULE STROMALES MEDULLAIRES 5 SEMAINES DE CULTURE CFU-GM BFU-E 14 JOURS DE CULTURE" Boîte de culture (milieu semi-solide)

17 Cellules CD34 + Cellules souches hématopoïétiques Cellules du sang Cellule souche multipotente LTC-IC 1/ des cellules de la moelle osseuse CFU-GEMM 1/10000 des cellules de la moelle osseuse BFU-E 1/1000 des cellules de la moelle osseuse CFU-GM 0,5/1000 Progéniteurs hématopoïétiques

18 Les cellules souches hématopoïétiques portent l antigène CD34 "! Sialomucine (glycoprotéine) "! Fonction inconnue (KO viables) "! Exprimée par:!cellules souches hématopoïétiques!progéniteurs engagés dans la différenciation hématopoïétique!cellules endothéliales

19 Les cellules souches hématopoïétiques portent l antigène CD34 Impossible d'a!cher l'image. Votre ordinateur manque peut-être de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est endommagée. Redémarrez l'ordinateur, puis ouvrez à nouveau le fichier. Si le x rouge est toujours a!ché, vous devrez peut-être supprimer l'image avant de la réinsérer. BFU-E Impossible d'a!cher l'image. Votre ordinateur manque peut-être de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est endommagée. Redémarrez l'ordinateur, puis ouvrez à nouveau le fichier. Si le x rouge est toujours a!ché, vous devrez peut-être supprimer l'image avant de la réinsérer. CFU-GM Impossible d'a!cher l'image. Votre ordinateur manque peut-être de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est endommagée. Redémarrez l'ordinateur, puis ouvrez à nouveau le fichier. Si le x rouge est toujours a!ché, vous devrez peut-être supprimer l'image avant de la réinsérer. Myeloblaste Monoblaste STEM CELL LTC-IC CFU-GEMM CD34+, CD38-, HLA-DR- 5% DES CELLULES CD34 CFU-MEG CD34 CFU-mast CELLULES CD34 = 0.5% DES CELLULES MEDULLAIRES 10% CFU-GM CD34 20% BFU-E 1% CFU-GEMM

20 5 SEMAINES 14 JOURS CD34 Polynucléaires neutrophiles GM-CFU CD34 CD34 CD34 BFU-E Globules rouges CD34 CD34+ CD38-0-5% DES CELLULES CD34 CD34 CFU-MEG Plaquettes DIVERSITÉ DU COMPARTIMENT DES CSH

21 Bien comprendre: différence entre cellules souches et progéniteurs Cellule souche multipotente Cellule souche Progéniteurs Cellules différenciées Les cellules souches hématopoïétiques ne se reproduisent pas de façon illimitée en culture: comment démontrer que ce sont des 21! cellules souches?

22 SHEEP Foetus Human CD45 HUMAN CD34+CD38- Foetus Human CD45 HUMAN CD34+CD38- MAY RECONSTITUTE A LONG TERM HEMATOPOIESIS IN FETAL SHEEP

23 SHEEP Foetus Human CD45 HUMAN CD34+CD38+ Foetus No human CD45 HUMAN CD34+CD38+MAY NOTRECONSTITUTE A LONG TERM HEMATOPOIESIS IN FETAL SHEEP

24 Notions clefs Les cellules du sang sont en constant renouvellement à partir d un petit contingent de cellules souches et progéniteurs hématopiétiques localisés dans la moelle osseuse Nous avons 0.5% de cellules portant l antigène CD34, compartiment qui contient tout un cone de différenciation de cellules souches hématopoïétiques capables d autorenouvellemnt (cellules rares, 10-6 ) et les progéniteurs hématopoïétiques (5 x 10-3 ). L identification des progéniteurs hématopoïétiques est faite à l aide des antigènes CD34, CD38 et des tests de croissance et différenciation en milieu semi solide in vitro Les cellules souches hématopoïétiques ne sont capables d autorenouvellement in vitro, du fait de la nécessité d une niche complexe.

25 Cellules souches hématopoïétiques 1.! Caractérisation 2.! Niche hématopoïétique 3.! Utilisation de cellules souches 4.! Collection et congélation 5.! Purification 6.! Greffe de cellules souches 7.! Modifications génétiques

26 Les cellules souches hématopoïétiques survivent et proliférent au contact des travées osseuses

27 Les cellules souches hématopoïétiques survivent et proliférent dans une niche hématopoïétique associant les ostéoblastes et cellules endothéliales. Capillaire CL Celso et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi: /nature07434

28 The calvarium endosteal niche is perivascular CL Celso et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi: /nature07434

29 Osteoblast s CXCR4!3-adrenergic receptor Nestin + CXCR4 VLA4 VCAM1 VLA4 Tie-2 CAR BON E Ang SCF Tie-2 C-kit C-kit

30 Niche hématopoïétique associant ostéoblastes et cellules endothéliales

31 L interaction des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques avec la niche hématopoïétiques impliquent de nombreux signaux de communication cellulaire, en autre des! des chimiokines,! des molécules d adhésion intercellulaires et à la matrice extracellulaire,! des cytokines ou facteurs de croissance. Le facteur de croissance utilisé sur un plan thérapeutique est le G-CSF de l anglais Granulocyte-Colony Stimulating Factor

32 G-CSF : granulocyte colony stimulating factor! Neupogen (Neulasta forme pégylée) ou Granocyte! 5 mg/ kg/jour! Mobilisation des cellules souches hématopoïétiques! Réduit de moitié la durée d aplasie post chimiothérapie! Neutropénie cyclique! Neutropénie idiopathique : injection à forte dose car faible sensibilité du récepteur

33 Mobilisation des cellules souches hematopoïétiques! 1- Par facteur de croissance : G-CSF! 2 En sortie d aplasie! Après un chimiothérapie! Exemple : Endoxan forte dose! Lors d une myélémie

34 Cellules souches hématopoïétiques 1.! Caractérisation 2.! Niche hématopoïétique 3.! Utilisation de cellules souches 4.! Collection et congélation 5.! Purification 6.! Greffe de cellules souches 7.! Modifications génétiques

35 Une chimiothérapie intensive et greffe de cellules souches hématopoïétiques permet de doubler la survie dans certains cancers Moelle osseuse qui produit les cellules du sang Chimiothérapie Intensive détruit La moelle osseuse

36 Congélation Collecte Progéniteurs hématopoïétiques Avant chimiothérapie Moelle osseuse

37 Congélation Injection Moelle osseuse après chimiothérapie Moelle osseuse

38 Cellules souches hématopoïétiques 1.! Caractérisation 2.! Niche hématopoïétique 3.! Utilisation de cellules souches 4.! Collection et congélation 5.! Purification 6.! Greffe de cellules souches 7.! Expansion à usage thérapeutique 8.! Modifications génétiques

39 Collection des cellules souches hematopoïétiques! 1- Moelle osseuse! Anesthésie générale (500 ponctions)! Plus de un litre de moelle osseuse! Prélèvement souvent limité en vol.! Nombre limité de précurseurs! Transfusion autologue de 2 culots globulaires (donneur volontaire)! 2 - Possibilité des les induire à circuler dans le sang périphérique

40 Mobilisation des progéniteurs hématopoïétiques dans le sang périphérique et collection MOELLE OSSEUSE Molécules d adhésion VLA4, VCAM1, SCF SANG PERIPHERIQUE Elastase Catepsin G CD34 CXCR4 SDF-1 CD34 Polynucléaire neutrophile Prolifération Modulation des molécules d adhésion Mobilisation des cellules CD34 dans la circulation CD34 Collection par cytaphérèse G-CSF Mozobil (Plerixafor): Inhibiteur de CXCR4/SDF-1

41 Cytaphérèse Cellules souches (cellules mononuclées) patient!! 4 5 heures (2h pour don plaquettes)! 1 à 3 séances!

42 Mobilisation des cellules souches hematopoïétiques #! 1 Par facteur de croissance : G-CSF #! 2 En sortie d aplasie Après un chimiothérapie Exemple : Endoxan forte dose Lors d une myélémie #! 3 Si mauvaise moblisation, ajout de Plerixafor, inhibiteur du récepteur de chimiokine CXCR4

43 Congélation et stockage en azote liquide! Congélation en DMSO 10% et albumine humaine 4%! Descente en température contrôlée : NiCool! Stockage en azote liquide (-196 C) ou en vapeur d azote (-140 C)! Pendant plusieurs années (>10 ans)! Décongélation:! Au bain marie dans l UTC puis lavages pour éliminer le DMSO (nouvelle législation : interdiction de réinjecter le DMSO)

44 L unité de thérapie cellulaire! Réceptionne le greffon, filtre et conditionne! Congèle! Effectue les contrôles de qualité! Infectieux! Nb de cellules souches du greffon (! 2 millions CD34 viables/kg de poids de receveur)

45 CNRS and INSERM Institutes, University of Science IRB, Clinical Hematology CIC in Biotherapy Unit of Cellular and Gene Therapy, 900 m 2 Institut of Neurosciences

46 Cellules souches hématopoïétiques 1.! Caractérisation 2.! Niche hématopoïétique 3.! Utilisation de cellules souches 4.! Collection et congélation 5.! Purification 6.! Greffe de cellules souches 7.! Modifications génétiques

47 PURIFICATION DES PROGENITEURS HÉMATOPOÏETIQUES Anticorps anti-cd34! 1% Cellules CD 34" Cellules tumorales 50 Milliards Aimant Cellules CD 34" Cellules tumorales 500 Millions

48

49 % CD34+ AVANT PURIFICATION % CD34+ APRES PURIFICATION CD34: 2,01% CD34: 99,63% CD34: 1,12% CD34: 98,61%

50 Cellules souches hématopoïétiques 1.! Caractérisation 2.! Niche hématopoïétique 3.! Utilisation de cellules souches 4.! Collection et congélation 5.! Purification 6.! Greffe de cellules souches 7.! Expansion à usage thérapeutique 8.! Modifications génétiques

51 Deux type de greffes! Allogreffe : donneur!! Autogreffe : greffe de ses propres cellules souches hématopoïétiques!

52 Allogreffe

53 Allogreffe de CSH! Remplacement d'une moelle et/ou d'un système immunitaire par des cellules souches hématopoïétiques et des lymphocytes T! Remplacement définitif de toutes les cellules myéloïdes et lymphoïdes du receveur.! Donc l immunosuppression n'est pas définitive (différent de la greffe d organe).

54 Origine du greffon! Donneur HLA compatible:! Fratrie (1/4 est compatible)! Donneur compatible non apparenté : fichier de typage HLA! Compatibilité ABO non nécessaire! Moelle osseuse ou cytaphérèse

55 Allogreffe de Cellules souches Hématopoïétiques après chimiothérapie intensive Volontaire sain 5000 PNN (log) 500 Aplasie Neutropénie sévère jours Immunosuppresseurs : ciclosporine, corticoïdes, etc.

56 Chambre stérile! Chambre une personne! Flux laminaire : air stérile! Nourriture stérile! Décontamination digestive! Personnel soignant: surblouse stérile, masque, bonnet, gants stériles! Surveillance +++! Attention : isolement + stress + long séjour (1 mois) " dépression

57 Indications! Leucémies myéloides du sujet jeune (! 40 ans)

58 En 2000, une équipe a une l idée d éliminer la chimiothérapie intensive pour limiter la toxicité de l allogreffe. Immunosuppression Chimiothérapie modérée! Lymphocytes! Cellules souches hématopoïétiques!!destruction des cellules hématopoïétiques du receveur!!greffe des cellules souches du donneur Donneur identique ou proche (HLA)!!Destruction des cellules tumorales par les lymphocytes du donneur Résultats cliniques très prometteurs

59 Augmentation des allogreffes chez les patients de plus de 50 ans 59!

60 Indications d allogreffe 60!

61 Une limite majeure à l allogreffe de cellule souche est le nombre de donneurs compatibles (1 million de donneurs dans le monde)! Sang de cordon: une nouvelle source de cellules souches

62 Le sang de cordon contient des cellules jeunes au premier jour de la vie -! des lymphocytes (défense de l organisme) -! des cellules souches du sang -! des cellules souches multipotentielles

63 Allogreffe de cellules souches et de lymphocytes de sang de cordon en cancérologie chez l enfant Prélèvement et congélation de Sang de cordon dans une banque de cellules Immunosuppression Chimiothérapie modérée!!destruction des cellules hématopoïétiques du receveur!!greffe des cellules souches du sang de cordon!!destruction des cellules tumorales par les lymphocytes du sang de cordon

64 Une limite majeure est le nombre de cellules souches dans le sang de cordon, qui rend la greffe souvent impossible chez l adulte. Comment avancer?

65 Immunosuppression Chimiothérapie modérée!!destruction des cellules hématopoïétiques du receveur Cordon 1!!Greffe des cellules souches du sang de cordon Cordon 2!!Destruction des cellules tumorales par les lymphocytes du sang de cordon

66 Augmentation très rapide du nombre d allogreffes de sang de cordon aux Etats-Unis. Similaire en Europe Nombre de greffes Année 66!

67 Autogreffe

68 CHU Montpellier! 2004: 100 autogreffes, 10 allogreffes sur fichier $!2011: 76 autogreffes, 80 allogreffes $!30 allogreffes sur fichier, 10 greffes de sang de cordon 2em centre en France après l Hôpital St Louis, Paris Objectifs:! sangs de cordon en banque en France Actuellement:!! 2 banques actives (Besançon / Bordeaux) sangs de cordon maintenant disponibles dans les banques françaises! Autres banques agréées: St Louis / Montpellier/Marseille / Créteil/ Grenoble/poitiers/ 68!

69 Autogreffe de Cellules souches hématopoïétiques Collecte (cytaphérèse) G-CSF Stockage en vapeur d azote (-140 C) 5000 PNN (log) 500 Aplasie Neutropénie sévère 50 Décès 10 jours

70 5 SEMAINES 14 JOURS Polynucléaires neutrophiles GM-CFU BFU-E Globules rouges Plaquettes CFU-MEG

71 Indications! Myélome au diagnostic! Augmentation d un facteur cinq du taux de rémission complète! Doublement de la survie! Lymphome (de mauvais pronostic ou en rechute)! LAM de mauvais pronostic sans donneurs! Environ 2500 autogreffes en France par an (100 à Montpellier)

72 Cellules souches hématopoïétiques 1.! Caractérisation 2.! Niche hématopoïétique 3.! Utilisation de cellules souches 4.! Collection et congélation 5.! Purification 6.! Greffe de cellules souches 7.! Modifications génétiques

73 Transfert de gènes dans les progéniteurs hématopoïétiques IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15! Chaîne gamma! Science, 288: , 2000!

74 CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES Cellule souche multipotente

75 "c "c Cellules souches hématopoïétiques CD34 Séminaires Ketty Schwartz 75

76 CD34 5 x 10 5 /ml SCF, TPO, IL-3, Flt3-L + retrovirus-"c 3 jours Cellules CD34 Exprimant la chaîne gamma Incubateur: 37 C, CO2 5%

77 Octobre patients survivants sur neuf à 10 ans 77

78 LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Hacein-Bey-Abina et al., Science, Oct 2003 We have previously shown correction of X-linked severe combined immunodeficiency [SCID-X1, also known as gamma chain (gamma(c)) deficiency] in 9 out of 10 patients by retrovirus-mediated gamma(c) gene transfer into autologous CD34 bone marrow cells. However, almost 3 years after gene therapy, uncontrolled exponential clonal proliferation of mature T cells (with gammadelta+ or alphabeta+ T cell receptors) has occurred in the two youngest patients. Both patients' clones showed retrovirus vector integration in proximity to the LMO2 protooncogene promoter, leading to aberrant transcription and expression of LMO2. Thus, retrovirus vector insertion can trigger deregulated premalignant cell proliferation with unexpected frequency, most likely driven by retrovirus enhancer activity on the LMO2 gene promoter. retrovirus retrovirus LMO2 Oncogène

79 RISQUE DE CANCER: MUTAGÉNÈSE INSERTIONNELLE!! 5 Patients/20 : prolifération de lymphocytes T incontrôlée («leucémie»)!! 1 décès!! 4 patients traités avec succès par chimiothérapie retrovirus retrovirus LMO2 Oncogène Séminaires Ketty Schwartz 79

80 RISQUE DE CANCER: MUTAGÉNÈSE INSERTIONNELLE!! 5 Patients/20 : prolifération de lymphocytes T incontrôlée («leucémie»)!! 1 décès!! 4 patients traités avec succès par chimiothérapie Séquences inactivatrices retrovirus LMO2 Oncogène Séminaires Ketty Schwartz 80

81 ADRENOLEUCODYSTROPHIE! Mutation dans le gène ABCD1! Correction ex vivo par lentivirus (HIV) 81

82 UN BLOCAGE DANS LA FONCTION DES CELLULES MICROGIALES (MACROPHAGES)entraînant une perte de myéline qui recouvre les axones 82

83 ABCD1 Cellules souches hématopoïétiques CD34 ABCD1 83

84 84

85 Beta Thalassémie! Mutation dans le gène beta globine! Correction ex vivo par lentivirus (HIV) Nature, Octobre

86 !-globin Cellules souches hématopoïétiques CD34!-globin 86

87 87

88 Notions clefs La niche des cellules souches hématopoïétiques est dans la moelle osseuse et assure la régulation du nombre, de la quiescence, de la prolifération et diférenciation des cellules souches hématopoïétiques Les cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques sont d application médicale courante, notamment pour traiter les patients atteints de cancer touchant les cellules souches hématopoïétiques ou des cancers graves. Il est possible de réparer un gène défectueux dans les cellules souches hématopoïétiques et de corriger à long terme une maladie génétique.

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