Réactivité du système orexinergique dans l'hyperexcitabilité induite par kindling amygdalien chez le rat

Transcription

1 Ecole Pratique des Hautes Etudes 46 rue de Lille Paris Années universitaires Naïck BOURGOIN Master Recherche "Sciences de la Vie et de la Terre" Spécialité: Signalisation et Systèmes Intégrés en Biologie Réactivité du système orexinergique dans l'hyperexcitabilité induite par kindling amygdalien chez le rat Tuteur scientifique : Dr Anne MORALES Tuteur pédagogique : Dr Geneviève CORDIER Laboratoire de Physiologie Intégrative, Cellulaire et Moléculaire Directeur: Pr Jean-Marc PEQUIGNOT Equipe "adaptations neurobiologiques aux contraintes environnementales" Co-responsables: Pr Jean-Marc PEQUIGNOT et Dr Laurent BEZIN UMR 5123, CNRS et Université Claude Bernard Lyon1 Bât Raphaël Dubois Campus de la Doua 43, Bd du 11 novembre Villeurbanne Cedex

2 REMERCIEMENTS Je remercie le Professeur Jean-Marc PEQUIGNOT et le Dr Laurent BEZIN pour m'avoir accueillie et permis de réaliser ce stage dans leur laboratoire. Je remercie tout particulièrement le Dr Anne MORALES pour m'avoir permis de travailler sur sa thématique de recherche, et pour m'avoir prodigué son aide, ses conseils et ses encouragements, tant sur le plan professionnel que personnel. Je remercie le Dr Geneviève CORDIER pour toute l'attention qu'elle m'a accordé, ainsi que pour m'avoir suivie tout au long de mes deux années de Master à l'ecole Pratique des Hautes Etudes. Je remercie également Marion LE-CAVORSIN, Sandrine BOUVARD, Colette MOULIN et Béatrice GEORGES pour leur inestimable aide technique, ainsi que pour leur patience à mon égard. Je remercie aussi Fabrice NAVARRO pour son écoute, ses encouragements et ses précieux conseils, concernant notamment mes projets d'avenir. Je remercie aussi Chantal BONNET, Aurélien BOUSSOUAR, Rafaat FARES, Céline HAMELIN, Jérémie NADAM et Pascal SANCHEZ pour les moments que nous avons partagés dans la bonne humeur, tout au long de ces deux années, sans oublier Marie-Thérèse BOILLON, Frédérique COHEN-ADAD et Michel ROCHE. Je tiens enfin à exprimer des remerciements particuliers à ma meilleure amie Mary, mes sœurs Soizic et Maëlenn ainsi qu'à mes parents, pour leur soutien constant, leur incroyable patience et leur compréhension.

3 ABSTRACT Studies have demonstrated that alteration of neurotransmissions is involved in epileptogenesis. In fact, temporal lobe epilepsy results from a deregulation of the balance between glutamatergic and GABAergic transmissions. This deregulation generates a hyperexcitability with hippocampic origin. Orexin-A and -B could be involved in this hyperexcitability as they are considered as powerfull exciting neurotransmitters. These neuropeptides are derived by proteolytic cleavage from a precursor called preproorexin. They are mainly synthesized in the hypothalamus and distributed throughout the central nervous system, of which the hippocampus. Our team showed, for the first time, the reactivity of the orexinergic system in the hippocampus, following pilocarpine-induced SE (status epilepticus) in rats. This reactivity suggests that orexines could be involved in the formation of the hippocampic hyperexcitability. Nevertheless, these preliminary studies do not make it possible to determine whether orexines play a pro- or anti- epileptic role. Our work consisted in developing a new model of controlled hyperexcitability, the amygdala kindling. Later, this model will enable us to study the effect of orexins on the transformation of a healthy tissue into an epileptic tissue, by making intracerebroventricular injections of orexins. The development of the amygdala kindling consisted in 1) precisely defining the coordinates of the electrode's establishment in amygdala and 2) characterizing the behavioral stages corresponding to the progression of the amygdala flashover. Thereafter, this characterization of the stages will enable us to quantify the evolution of the seizures' gravity. We also studied, in the hippocampus, the expression of orexins in the kindling's model, to be able to compare the reactivity of the orexinergic system with that obtained, following pilocarpine-induced SE in rats. Our results showed: 1) an increase of preproorexine mrna in the hypothalamus, and 2) a decrease in the orexinergic innervation, and more particularly in orexin-b contribution, towards the hippocampus. It will be consequently important to determine whether the orexinergic system plays a pro- or anti- epileptic role. Thus, the future experiments will consist in making intracerebroventricular injections of orexins in the model of the amygdala kindling.

4 RÉSUMÉ De nombreux travaux ont montré que l'altération des neurotransmissions est impliquée dans la mise en place de l'épilepsie. En effet, le déséquilibre de la balance entre les signaux excitateurs glutamatergiques et inhibiteurs GABAergiques est responsable de l'épilepsie du lobe temporal et engendre une hyperexcitabilité d'origine hippocampique. Les orexines A et B pourraient être impliquées dans ce déséquilibre car elles sont considérées comme de puissants neuromédiateurs excitateurs. Ces neuropeptides sont issus de la maturation post-traductionnelle d'un peptide précurseur, appelé "préproorexine". Les orexines sont synthétisés principalement dans l'hypothalamus puis sont transportés vers un grand nombre de structures cérébrales, dont l'hippocampe. Notre équipe a démontré, pour la première fois, que le système orexinergique présente une réactivité dans l hippocampe chez un modèle de rats traités à la pilocarpine. Cette réactivité laisse suggérer que les orexines peuvent être impliquées dans la mise en place de l'hyperexcitabilité hippocampique. Néanmoins, ces études préliminaires ne permettent pas de définir si les orexines exercent un rôle pro- ou anti- épileptogène. Notre travail a consisté à mettre au point un nouveau modèle d'hyperexcitabilité contrôlée, le kindling amygdalien. Ce modèle nous permettra d'étudier ultérieurement le rôle des orexines sur la transformation du tissu sain hippocampique en tissu épileptogène, en effectuant des injections intracérébroventriculaires d orexines. La mise au point du kindling amygdalien a consisté 1) à définir précisément les coordonnées d implantation de l électrode dans l amygdale et 2) à caractériser les stades comportementaux correspondant à la progression de l embrasement amygdalien. Cette caractérisation des stades nous permettra, par la suite, de quantifier l évolution de la gravité des crises. Nous avons également étudié, dans l'hippocampe, l expression des orexines dans le modèle kindling, de façon à pouvoir comparer la réactivité du système orexinergique avec celle obtenue chez le modèle de rat traité à la pilocarpine. Nos résultats ont montré une réactivité du système orexinergique dans le modèle du kindling amygdalien avec: 1) une augmentation du niveau d'expression de l'arnm codant pour la préproorexine dans l'hypothalamus, et 2) une diminution de l'innervation orexinergique, et plus particulièrement de l'apport d'orexine B, vers l'hippocampe. Il sera par conséquent important de définir si le système orexinergique joue un rôle pro- ou antiépileptogène. Ainsi, les expériences futures consisteront à effectuer des injections intracérébroventriculaire d'orexines dans le modèle du kindling amygdalien.

5 LISTE DES ABREVIATIONS AA : acide aminé ADN : acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ADT : after discharge threshold AMPc : adénosine monophosphate cyclique AP : antéro-postériorité ARN : acide ribonucléique ARNm : ARN messager BDNF : brain derived neurotrophic factor CA : corne d'ammon CCK : cholecystokinine dntp : desoxynucleotide triphosphate DO : densité optique EEG : enregistrement électroencéphalographique GABA : acide γ-amino-butirique GD : gyrus denté H : hile NPY : neuropeptide Y OX 1 R : récepteur aux orexines de type 1 OX 2 R : récepteur aux orexines de type 2 OX-A : orexine A OX-B : orexine B OXs : orexines PBS : tampon phosphate salin PCR : polymerase chain reaction PF : paraformaldéhyde Prépro-OX : préproorexine Protéine Gi : sous type de protéine G qui inhibe la production d'ampc Protéine Gq : sous type de protéine G qui provoque l'augmentation du calcium intracellulaire Protéine Gs : sous type de protéine G qui stimule la production d'ampc RT : reverse transcription SE : status epilepticus SO : stratum oriens SP : stratum pyramidale SR : stratum radiatum TA : température ambiante

6 INTRODUCTION GENERALE... 1 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES... 3 I. EPILEPSIE PARTIELLE DU LOBE TEMPORAL... 3 I-1. L'hippocampe... 3 I-1-1. Localisation et anatomie... 3 I-1-2. Connections hippocampiques... 4 I-2. L'épileptogenèse: mise en place de l'hyperexcitabilité... 5 I-2-1. Implication des neuromédiateurs GABAergique et glutamatergique... 5 I-2-2. Implication des neuropeptides... 6 I-3. Modèles d'étude de l'épilepsie du lobe temporal... 7 I-3-1. Modèles d'épilepsie induite par traitement pharmacologique... 7 I-3-2. Modèle d'hyperexcitabilité contrôlée: le kindling amygdalien... 8 II. IMPLICATION DU SYSTEME OREXINERGIQUE DANS L'HYPEREXCITABILITE... 9 II-1. Réactivité du système orexinergique au cours de l'épileptogenèse... 9 II-2. Interaction du système orexinergique avec les neuropeptides et les neuromédiateurs.. 10 II-3. Le système orexinergique II-3-1. Les orexines II Synthèse des orexines II Distribution des orexines II-3-2. Les récepteurs aux orexines OX 1 R et OX 2 R II Structures des OX 1 R et OX 2 R II Distribution d' OX 1 R et OX 2 R II Mécanismes d'action MATERIELS ET METHODES I. ANIMAUX II. MODELE D'EPILEPTOGENESE : LE KINDLING AMYGDALIEN II-1. Chirurgie stéréotaxie II-2. Embrasement amygdalien III. MESURE DE L'EXPRESSION DES ARNm CIBLES PAR RT-PCR QUANTITATIVE III-1. Prélèvement des cerveaux III-2. Extraction et purification des ARN totaux III-3. Vérification de l'absence de contamination en ADN génomique III-4. Réaction de transcription inverse (RT) calibrée des ARNm en ADNc III-4-1. Principe III-4-2. Réaction de tanscription inverse III-5. PCR quantitative en temps réel III-5-1. Principe III-5-2. Gammes étalons III-5-3. Réaction de la PCR dite en "temps réel" III Choix des couples d'amorces III Mélanges réactionnels et protocoles d'amplification III Identification des ADNc amplifiés III-5-4. Analyse de la quantité des ARNm cibles détectés par RT calibrée et PCR en "temps réel"... 20

7 IV. ANALYSES IMMUNOHISTOCHIMIQUES IV-1. Prélèvement des cerveaux IV-2. Coupes des cerveaux perfusés IV-3. Coloration au crésyl violet et recalage anatomique IV-4. Détection immunohistochimique de l'ox-b IV-5. Comptages des neurones orexinergiques dans l'hypothalamus latéral IV-6. Mesure de la densité des fibres orexinergiques dans le thalamus paraventriculaire et l'hypothalamus latéral IV-7. Comptage des fibres orexinergiques dans l'hippocampe RESULTATS I. Mise en place du modèle d'embrasement amygdalien, dit "kindling", chez le rat I-1. Caractérisation de la progression des stades du kindling I-2. Représentation du déroulement du kindling II. Variation de l'expression des ARNm du système orexinergique, suite à la mise en place d'une hyperexcitabilité contrôlée chez le rat II-1. Niveau d'expression basal de l'arnm codant pour la prépro-ox dans l'hypothalamus et l'hippocampe II-2. Modulation du système orexinergique dans l'hippocampe et l'hypothalamus III. Variation de l'expression protéique de l'orexine-b, suite à la mise en place d'une hyperexcitabilité contrôlée chez le rat III-1. Augmentation du nombre de neurones orexinergique dans l'hypothalamus latéral III-2. Augmentation de la densité des fibres orexinergiques dans l'hypothalamus latéral III-3. Diminution de la densité des fibres orexinergiques dans le thalamus paraventriculaire III-4. Diminution du nombre de fibres orexinergiques dans l'hippocampe DISCUSSION I. MODELE DU KINDLING AMYGDALIEN CHEZ LE RAT II. REACTIVITE DU SYSTEME OREXINERGIQUE SUITE A LA TRANSFORMATION DU TISSU CEREBRAL EN TISSU HYPEREXCITABLE CONCLUSION ET PERSPECTIVES RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES... 33

8 Introduction générale INTRODUCTION GENERALE L'épilepsie est un trouble neurologique caractérisé par la répétition de crises soudaines et brèves. Le travail de notre équipe de recherche porte sur l'épilepsie partielle du lobe temporal. Cette épilepsie se développerait, dans de nombreux cas, à la suite d'affections neurologiques diverses : encéphalite herpétique, méningite bactérienne, traumatisme crânien, tumeur cérébrale, malformation vasculaire. Dans ce type d'épilepsie, les crises sont associées à l'hyperactivité d'une zone cérébrale définie comme "foyer épileptogène", localisée le plus souvent au niveau de l'hippocampe. L'absence de traitements pharmacologiques efficaces pour bloquer les crises est un problème majeur. En effet, la résection chirurgicale du foyer épileptogène demeure le seul recours possible pour enrayer la récurrence des crises, malgré les séquelles invalidantes et irréversibles qu'elle peut provoquer. Ainsi, face à l'impuissance de l'approche pharmacologique une fois que l'épilepsie est établie, un axe de recherche s'est développé afin d'éclaircir les mécanismes de l'épileptogenèse, c'est-à-dire ceux qui aboutissent au développement de l'épilepsie. En effet, la connaissance de ces mécanismes pourrait permettre l'élaboration de nouveaux traitements permettant d'enrayer la transformation du tissu sain hippocampique en un tissu hyperexcitable, chez des patients prédisposés à ce trouble neurologique. L'hyperexcitabilité résulte d'un déséquilibre de la balance entre les signaux synaptiques excitateurs et inhibiteurs. Des neuromédiateurs, tels que le glutamate et le GABA, sont impliqués dans l'hyperexcitabilité des tissus cérébraux, mais de nombreux neuropeptides jouent également un rôle dans la transformation épileptogène du tissu hippocampique. Ainsi, notre équipe de recherche a découvert que le système orexinergique pourrait être impliqué dans la mise en place de l'épileptogenèse. Les orexines A et B (OX-A/B) sont deux peptides dérivés, par maturation post-traductionnelle, d'un précurseur "la préproorexine" (prépro-ox) et sont synthétisés essentiellement dans l'hypothalamus. Ces peptides sont bien connus pour être des neuromédiateurs excitateurs qui interviennent dans la régulation de la prise alimentaire et de l'état d'éveil. A la suite d'un état de mal cérébral (status epilepticus SE) induit par l'administration de pilocarpine chez le rat, la réactivité du système orexinergique se traduit par une synthèse endogène d'ox-b dans l'hipppocampe et une altération du transport des orexines dans le cerveau. La synthèse endogène d'ox-b laisse suggérer l'implication de ce peptide dans la mise en place de l'hyperexcitabilité hippocampique. 1

9 Introduction générale Notre travail de recherche a consisté à définir l'implication du système orexinergique lors de la mise en place de l'épilepsie, dans un autre modèle: l'embrasement amygdalien, aussi appelé "kindling" amygdalien. Ce modèle consiste à implanter, par chirurgie stéréotaxique, une électrode bipolaire dans l'amygdale et à stimuler électriquement les rats jusqu'à l'obtention d'une crise généralisée d'épilepsie, dite de stade 5. Au cours du kindling, la phase d'épileptogenèse, qui est l'étape de transformation du tissu sain hippocampique en un tissu épileptogène et hyperexcitable, se déroule progressivement et est calibrée par l'observation de stades comportementaux allant de 1 à 5. Dans un premier temps, nous avons mis au point le modèle du kindling dans notre laboratoire. Puis, la réactivité du système orexinergique a été étudiée afin de caractériser le système. Nous avons ainsi analysé: 1) l expression de l ARN messager codant pour la préproorexine et les récepteurs aux orexines, dans l'hypothalamus et l'hippocampe, 2) le nombre de corps cellulaire OX-B immunopositifs dans l'hypothalamus, et 3) l'innervation orexinergique dans l'hippocampe, le thalamus et l'hypothalamus. 2

10 Rappels bibliographiques RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES I. EPILEPSIE PARTIELLE DU LOBE TEMPORAL L'épilepsie est un trouble neurologique caractérisé par la répétition de crises pendant lesquelles l'activité électrique d'une population de neurones est pathologiquement élevée et synchronisée. Cette pathologie se développerait pendant une phase de mise en place de l'épilepsie appelée épileptogenèse, qui fait souvent suite à une lésion cérébrale provoquée par un accident vasculaire, une tumeur ou encore un traumatisme cérébral (Cf. figure 1). En clinique, l'épilepsie du lobe temporal est la forme la plus commune d'épilepsie et est corrélée avec de soudaines décharges électriques synchronisées dont le foyer est généralement situé dans une structure cérébrale bien précise: l'hippocampe. I-1. L'hippocampe I-1-1. Localisation et anatomie L'hippocampe est une petite structure sous-corticale enroulée sur elle-même et occupant la face médiane du lobe temporal. Situé légèrement en profondeur et saillant dans le ventricule latéral, il est relié par le subiculum et le cortex enthorinal (Cf. figure 2a). L'hippocampe est connecté à l'amygdale et au thalamus. L'ensemble de ces structures constitue les éléments principaux du système limbique, jouant un rôle fondamental dans l'apprentissage, la mémoire et les émotions. L'hippocampe est formé de deux structures en forme de U inversés, le gyrus denté et la corne d'ammon (Cf. pour revue O'Keefe et Nadel, 1978). Sur la base de différences morphologiques et de ses connexions synaptiques, la corne d'ammon est encore subdivisée en trois parties: les régions CA1, CA2 et CA3 (Cf. figure 2b). Différents types de cellules sont présents dans l'hippocampe, comme dans la majorité du système nerveux central. Les cellules ayant la plus évidente importance physiologique sont les neurones pyramidaux qui sont des neurones excitateurs glutamatergiques. Ils constituent la majeure partie des cellules du stratum pyramydale de la corne d'ammon et sont en contact avec diverses cellules de l'hippocampe et du cortex. Dans le gyrus denté, les neurones principaux sont les cellules granulaires. Plus petites et de forme arrondie, elles envoient leurs projections axonales, appelées fibres moussues, vers le stratum radiatum du CA3. En dehors des cellules pyramidales, l'hippocampe possède: 1) des cellules en corbeille situées dans le stratum oriens, 2) des neurones fusiformes situés dans la région du hile, 3) des 3

11 Evènement cérébral ponctuel ÉPILEPTOGEN PILEPTOGENÈSE Crises épileptiques spontanées ÉPILEPSIE DU LOBE TEMPORAL Foyer: hippocampe Figure 1 : Schéma général de la mise en place de l'épilepsie du lobe temporal. A la suite d'un évènement cérébral ponctuel, l'épilepsie se met en place au cours d'une phase appelée "épileptogenèse", qui est l'étape de transformation d'un tissu cérébral sain en un tissu dit épileptique, dont la caractéristique est d'être hyperexcitable. Cette étape est ensuite suivie d'une succession de crises épileptiques définissant la pathologie de l'épilepsie et dont un des foyers d'embrasement se situe dans l'hippocampe Cortex cérébral Cerebellum Hippocampe dorsal Moëlle épinière Tronc cérébral Hippocampe ventral Subiculum Bulbe olfactif Nerfs optiques Hypothalamus Figure 2a : Dessin de cerveau de rat situant l'hippocampe. L'hippocampe constitue la partie interne du cortex cérébral, adjacente au cortex olfactif. structure est constituée de deux parties : dorsale et ventrale. Cette CA1 CA2 EC CA3 DG Figure 2b : Structure interne de l'hippocampe. DG : gyrus denté, CA : corne d'ammon, EC : cortex entorhinal, pp : voie perforante, sm ou l-m : stratum moleculare, sg : stratum granulosum, mf : fibres moussues, so : stratum oriens, sp : stratum pyramidale, sr : stratum radiatum, sc : collatérales de Shaffer, S : subiculum, H : hile.

12 Rappels bibliographiques cellules en corbeille de type pyramidal situées dans le stratum granulosum du gyrus denté et enfin 4) des cellules bipolaires et multipolaires, principalement situées dans le stratum pyramidale (Caeser et Aertsen, 1991). La plupart de ces cellules sont des interneurones de type GABAergiques, exerçant une action inhibitrice sur les réseaux avoisinants. Quatre type de cellules gliales ont été décrits dans l'hippocampe: les astrocytes, qui représentent environ 75% des cellules non-neuronales, sont en contact avec les vaisseaux sanguins (Beach et al., 1982). Ils participent à la constitution de la barrière hématoencéphalique et jouent aussi un rôle important dans la nutrition des neurones. Les oligodendrocytes sont impliqués dans la myélinisation des fibres axonales, la microglie est impliquée dans la phagocytose des déchets cellulaires et les fibroblastes sont les cellules de soutien. I-1-2. Connections hippocampiques Le flux d'informations à travers l'hippocampe est unidirectionnel. Le circuit le plus simple est constitué d'une voie principale excitatrice trisynaptique mettant en jeu 4 groupes de neurones: les cellules pyramidales du cortex enthorinal envoient leurs axones, formant la voie perforante, vers le gyrus denté pour contacter les cellules granulaires. Les axones des cellules granulaires, les fibres moussues, contactent les cellules pyramidales du CA3 qui, à leur tour, envoient des axones, appelés les collatérales de Schaffer, à travers le stratum pyramidale vers l'aire du CA1 (Cf. figure 3). Ces derniers neurones envoient leurs projections hors de l'hippocampe, vers le subiculum qui contacte en retour le cortex enthorinal, formant ainsi une boucle anatomique. L'hippocampe reçoit des afférences de 4 régions principales: l'hippocampe controlatéral, le cortex enthorinal, l'aire du septum médian et différents sites du tronc cérébral, mais projette aussi des efférences via le fornix. Les neurones pyramidaux concentrent leurs axones dans ce faisceau qui projette vers d'autres structures du télencéphale et du diencéphale. Une autre voie efférente de l'hippocampe part du subiculum qui projette vers le cortex entorhinal qui, à son tour, contacte différentes aires associatives du néocortex (Cf. O'Keefe et Nadel, 1978). De par ces connections, l'hippocampe pourrait ainsi être impliqué dans l'organisation, le triage et la synthèse des informations spécialisées provenant de différents centres sensoriels. 4

13 CA 1 Voie perforante Collatérales de Schaffer + + B H - G +++ Gyrus denté Fibres moussues CA 3 Cellules : pyramidales G : granulaires B : en corbeille H : du Hile Figure 3 : Schéma représentant la régulation du flux d'informations dans l'hippocampe. Le flux d'informations provenant du cortex enthorinal arrive dans l'hippocampe par la voie perforante, puis contacte les cellules granulaires du Gyrus denté. Les axones des cellules granulaires, les fibres moussues, contactent les cellules pyramidales du CA3 qui, à leur tour, envoient des axones, appelés les collatérales de Schaffer, à travers le stratum pyramidale vers l'aire du CA1. Le flux d'informations est régulé, avant son arrivée dans la région du CA3, par un rétro-contrôle négatif: les cellules situées dans la région du hile contactent les cellules en corbeille, qui inhibent partiellement l'hyperexctitabilité engendrée au niveau du Gyrus denté.

14 Rappels bibliographiques I-2. L'épileptogenèse: mise en place de l'hyperexcitabilité I-2-1. Implication des neuromédiateurs GABAergique et glutamatergique Au cours de l'épileptogenèse, l'hippocampe tendrait à devenir hyperexcitable suite à un déséquilibre de la balance entre les signaux synaptiques excitateurs et inhibiteurs. Dans l'hippocampe, l'acide γ-amino-butyrique (GABA) et le glutamate sont les deux principaux neurotransmetteurs permettant le traitement de l'information. Au cours de l'épileptogenèse, il se produirait une diminution du signal inhibiteur GABAergique, tandis que le signal excitateur glutamatergique serait amplifié (Cf. figure 4). De nombreux résultats ont mis en évidence l'implication du neuromédiateur GABAergique dans la mise en place de l'hyperexcitabilité (Cf. pour revue Bradford, 1995). Il a été montré une diminution significative (30-50%) des neurones ou des terminaisons nerveuses GABAergiques, associée à une diminution (60-70%) de la concentration en GABA extracellulaire, dans le cerveau de rats rendus épileptiques par kindling amygdalien. D'autres études ont, de plus, montré que l'administration, dans le système nerveux central, d'inhibiteurs des GABA-transaminases ou d'agonistes des récepteurs GABAergiques apparaissait comme étant anti-convulsivante. L'administration d'agents bloquant les glutamate-décarboxylases, quant à elle, entraînerait des convulsions. Enfin, il a été récemment montré qu'une diminution des transporteurs GABAergiques se produisait dans les membranes neuronales et/ou gliales de tissus cérébraux épileptiques, chez l'homme comme chez le rat (During et al., 1995). Une telle réduction des transporteurs GABAergiques tendrait donc à réduire globalement l'inhibition cérébrale et, par conséquent, à augmenter les phénomènes d'excitation. D'autres travaux ont aussi mis en évidence l'implication du neuromédiateur glutamatergique dans la mise en place de l'hyperexcitabilité (Cf. pour revue Bradford, 1995). Une étude a montré qu'une injection intracérébrale de glutamate ou d'un agoniste de ses récepteurs, comme par exemple le NMDA, entraîne des convulsions, suggérant l'implication de ce neurotransmetteur dans l'épilepsie. Il a également été montré que les dommages tissulaires et la neurodégénérescence, caractéristiques de cette pathologie, conduisent à une libération rapide et importante de glutamate dans le milieu extracellulaire, là où les récepteurs au glutamate sont présents de façon ubiquitaire. De plus, ces changements conduisent aussi à une diminution de la réabsorption du glutamate et par conséquent, son accumulation. L'implication du système excitateur glutamatergique peut alors se faire à trois niveaux: 1) au niveau de l'hyperactivité chronique convulsive, qui a lieu dans le foyer d'embrasement de l'épilepsie, 2) au niveau du signal excitateur conduisant à l'initiation des crises convulsives et 5

15 Neurones GABAergiques - Neurones glutamatergiques + Signal inhibiteur Signal excitateur Figure 4 : Schéma du déséquilibre de la balance "excitation/inhibition" au cours de l'épileptogenèse. Au cours de l'épileptogenèse, dans l'hippocampe, l'équilibre physiologique entre le signal glutamatergique excitateur et le signal GABAergique inhibiteur est perturbé. La balance penche alors en faveur du signal excitateur glutamatergique, conduisant l'hippocampe à devenir hyperexcitable.

16 Rappels bibliographiques au recrutement des neurones adjacents au foyer, et 3) au niveau de la diffusion et de l'amplification de l'hyperactivité, conduisant à des crises généralisées d'épilepsie (Bradford, 1995). I-2-2. Implication des neuropeptides Il a été montré que de nombreux neuropeptides et/ou leurs récepteurs tels que la bradykinine (BK) (Mazzuferi et al., 2005), le neuropeptide Y (NPY), ou encore la cholecystokinine-octapeptide (CCK) (Schwarzer et al., 1996) étaient impliqués dans la mise en place de l'hyperexcitabilité et pouvaient jouer un rôle pro- ou anti-épileptogène. Le neuropeptide Y (NPY) est le peptide le plus abondant et le plus largement distribué dans le système nerveux central (SNC). Il a été montré que le niveau d'expression de l'arnm codant pour le NPY était augmenté dans certaines régions impliquées au cours de l'épileptogenèse (Vezzani et al., 1999; Redrobe et al., 1999). Six récepteurs se liant au NPY ont été identifiés, dont les récepteurs Y 1, Y 2 et Y 5 qui semblent jouer un rôle dans la mise en place de l'hyperexcitabilité. Ainsi, des travaux ont montré que le récepteur Y 2, qui est impliqué dans la transduction de signaux excitateurs, était augmenté dans l'hippocampe de rats épileptiques (Gobbi et al., 1998; Schwarzer et al., 1998). D'autres études ont montré que les récepteurs Y 1 et Y 5, qui sont impliqués dans la transduction de signaux inhibiteurs, étaient inhibés dans l'hippocampe de rats épileptiques (Gobbi et al., 1998; Kofler et al., 1997; Bregola et al., Ces études, réalisées sur le NPY et sur ses récepteurs Y 1, Y 2 et Y 5 ont donc permis de montrer 1) la réactivité du système "NPY" au cours de l'épileptogenèse et 2) son rôle pro-épileptogène. La cholecystokinine (CCK) est un neuropeptide intervenant dans l'inhibition de l'excitabilité des cellules pyramidales et granulaires de l'hippocampe (Cf. pour revue Schwarzer et al., 1996). L'augmentation du niveau d'expression de l'arnm codant pour la CCK, dans l'hippocampe de rats kindlés ou traités à l'acide kaïnique a permis de démontrer la réactivité de ce neuropeptide au cours de l'épileptogenèse. Ainsi, il a été montré que la CCK altérait la mise en place de l'hyperexcitabilité: 1) en bloquant les effets excitateurs de l'acide kaïnique transmis des fibres moussues vers CA3, 2) en inhibant la transmission synaptique des collatérales de Schaffer vers CA1 et 3) en supprimant l'augmentation intracellulaire de calcium induite par le glutamate dans des neurones de rats en culture. La CCK est donc reconnue comme ayant une activité anti-convulsive via les dendrites des neurones pyramidaux et non-pyramidaux. 6

17 Rappels bibliographiques Récemment, il a été trouvé que la bradykinine intervenait au cours de l'épileptogenèse, en favorisant l'hyperexcitabilité. En effet, une étude a montré que l'expression du récepteur B 1 de la bradykinine, physiologiquement absent, était fortement augmentée dans le cerveau de rats rendus épileptiques par kindling amygdalien (Mazzuferi et al., 2005). Il semblerait donc que le système "bradykinine" favorise la mise en place de l'hyperexcitabilité, via l'activation du récepteur B 1 qui augmente alors la concentration en glutamate extracellulaire. Depuis peu, notre équipe de recherche, a mis en évidence que les orexines A et B pourraient être impliquées au cours de la phase d'épileptogenèse. Ces neuropeptides sont bien connus pour jouer un rôle important dans la régulation de l'éveil, de la stimulation de la prise alimentaire et de la régulation de la balance énergétique (Sakuraï, 2005). I-3. Modèles d'étude de l'épilepsie du lobe temporal Les modèles animaux constituent les meilleurs outils pour étudier et comprendre la pathophysiologie de l'épilepsie du lobe temporal. Ils contribuent 1) à déterminer la nature des dommages qui peuvent contribuer au développement de l'épilepsie, 2) à observer et/ou à intervenir au cours de la phase d'épileptogenèse et 3) à étudier le cerveau épileptique dans ses moindres détails, que ce soit au niveau anatomique, physiologique ou encore moléculaire. I-3-1. Modèles d'épilepsie induite par traitement pharmacologique Ces modèles impliquent l'administration de molécules pharmacologiques telles que l'acide kaïnique ou la pilocarpine, qui entraînent un état de mal cérébral appelé status epilepticus, qui sera arrêté par l'administration d'un anti-convulsivant. Les animaux entrent alors en phase d'épileptogenèse au cours de laquelle le tissu cérébral sain va devenir hyperexcitable, et dont le foyer d'embrasement se situe principalement dans l'hippocampe. Après une période variant entre deux semaines et plusieurs mois, les animaux commencent à présenter des crises épileptiques généralisées et spontanées, persistant jusqu'à la mort des animaux. Ces modèles d'épilepsie, induite par traitement pharmacologique, ont pour avantage de présenter les mêmes caractéristiques typiques de sclérose hippocampique détectée chez de nombreux patients atteints d'épilepsie du lobe temporal. Dans ces modèles la perte de neurones est très importante et donc accompagnée de nombreux réarrangements et de compensations au niveau des circuits neuronaux (Dichter, 2006). Ces modèles sont actuellement les plus utilisés aujourd'hui dans la recherche sur l'épilepsie du lobe temporal. Toutefois, aucun modèle n'est parfait, et le principal inconvénient 7

18 Rappels bibliographiques rencontré, ici, est la dégénérescence importante et rapide, obligeant les tissus cérébraux à compenser, dans l'urgence, au manque de certains neuromédiateurs. De plus, ces modèles sont assez dévastateurs pour l'organisme et de nombreux animaux sont perdus au cours de chaque expérimentation, c'est pourquoi nous avons cherché à utiliser un modèle plus "propre" d'hyperexcitabilité contrôlée. I-3-2. Modèle d'hyperexcitabilité contrôlée: le kindling amygdalien Le kindling amygdalien s'intéresse plus particulièrement aux mécanismes de mise en place de l'hyperexcitabilité et c'est le modèle animal que nous avons choisi pour notre étude. Même si le kindling a été initialement réalisé sur le rat, cette technique s'est étendue à d'autres espèces de mammifères incluant la souris, le chien, le chat et quelques espèces de primates (Racine, 1978). Dans ce modèle, l'hyperexcitabilité du tissu hippocampique se met en place progressivement au cours d'une série de stimulations électriques, jusqu'à ce que l'animal présente de très fortes convulsions. La progression de la transformation du tissu hippocampique sain en un tissu épileptogène est calibrée par des stades comportementaux, décrits par Racine en Au fur et à mesure des stimulations appliquées à l'animal, l'intensité des crises augmente jusqu'à atteindre le stade maximum, égal à 5. Lorsque l'animal s'est stabilisé en stade 5, il développera systématiquement une crise de cette intensité à chaque stimulation, même après plusieurs mois d interruption (Cf. figure 5). L'avantage principal du kindling amygdalien est de permettre l'étude de la phase d'épileptogenèse, dont la progression est facilement visible grâce aux enregistrements électroencéphalographiques (EEG) et est calibrée par les stades comportementaux de l'animal. Ce modèle a pour avantage de pouvoir contrôler l'apparition des crises; aucune crise ne peut se déclencher spontanément, elles sont obligatoirement induites par stimulations électriques. De plus, le kindling ne nécessite pas l'administration d'un convulsivant chimique, qui pourrait interférer avec le/les neuromédiateur(s) endogène(s) d'intérêts. Enfin, le kindling amygdalien apparaît, actuellement, comme un très bon modèle animal, permettant l'étude de l'effet d'un agent pharmacologique sur la mise en place de l'hyperexcitabilité (Dichter, 2006). Il est en effet possible, grâce à l'étude de la progression des stades comportementaux, de définir si un neuromédiateur est pro- ou anti-épileptogène. Dans ce but, des injections répétées du neuromédiateur d'intérêt peuvent être réalisées dans l'hippocampe, avant chaque stimulation. Ainsi, si la pente de la courbe, décrivant le nombre de stimulations nécessaires pour atteindre chaque stade est abaissée/augmentée, il est alors possible d'affirmer que le 8

19 Nombre de stimulations électriques Crises épileptiques induites Début des stimulations 1er stade Epileptogenèse 0 I II III IV V Stades Figure 5 : Schéma représentant l'épileptogenèse induite par kindling. Le kindling amygdalien conduit à la transformation du tissu hippocampique sain en un tissu épileptogène, calibrée par l'observation de stades comportementaux déclinés sur une échelle de 0 à 5 et définis par Racine en Lorsque le tissu est devenu épilèptogène, le rat développe alors systématiquement une crise de stade 5 à chaque stimulation, même après plusieurs mois d'interruption.

20 Rappels bibliographiques neuromédiateur joue un rôle pro-/anti- épileptogène, au cours de la mise en place de l'hyperexcitabilité. En effet, l'abaissement/l'élévation de la courbe signifiera qu'un moins/plus grand nombre de stimulations électriques aura été nécessaire pour que les rats entrent en stade 5 et que leurs tissus cérébraux deviennent définitivement hyperexcitables. Si un tel évènement se produit, le neuromédiateur sera donc considéré comme l'un des acteurs accélérant/ralentissant la mise en place de l'hyperexcitabilité hippocampique. II. IMPLICATION DU SYSTEME OREXINERGIQUE DANS L'HYPEREXCITABILITE L'hypothèse selon laquelle les orexines joueraient un rôle dans la transformation épileptogène du tissu hippocampique résulte de la découverte, dans notre laboratoire, d'une réactivité du système orexinergique au cours d'une épileptogenèse induite pharmacologiquement par la pilocarpine. II-1. Réactivité du système orexinergique au cours de l'épileptogenèse Notre équipe de recherche a découvert, récemment, une synthèse locale d'ox-b, non seulement par les neurones des couches principales de l'hippocampe (cellules pyramidales de la corne d'ammon et cellules en grain du gyrus denté), mais aussi par de nombreux interneurones et astrocytes, à la suite d'un état de mal cérébral (status epilepticus SE) induit par injection intra-péritonéale de pilocarpine (Morales et al., en soumission). L'absence de synthèse endogène d'ox-b, dans l'hippocampe des rats non traités, conforte d'autant plus l'hypothèse selon laquelle ce peptide jouerait un rôle dans la transformation épileptogène du tissu hippocampique. Ainsi, nous avons montré, dans l'hippocampe, une augmentation significative: 1) de l'expression de l'arnm codant pour la prépro-ox et 2) du nombre de corps cellulaires exprimant OX-B, 2 à 3 jours après le déclenchement du SE. En revanche, nous avons montré une diminution significative: 1) de l'arnm codant pour la prépro-ox dans l'hypothalamus et 2) du nombre de fibres exprimant OX-B dans la région thalamique, suite au SE. On peut donc penser, que la neurodégénérescence rapide, entraînée par le SE, a réduit et/ou supprimé les voies de transmission orexinergique provenant de l'hypothalamus. Dans ces conditions, le système nerveux central a donc dû mettre en place des mécanismes de compensation au niveau de l'hippocampe; celui-ci n'étant plus innervé correctement par OX-B, il a dû compenser ce manque en synthétisant lui-même ce neuropeptide. 9

21 Rappels bibliographiques La perte évidente de masse corporelle (Klitgaard et al., 2002) ainsi que la réduction de la prise alimentaire observées, chez des rats, suite au SE induit par pilocarpine, renforcent l'hypothèse que les orexines peuvent être impliquées au cours de l'épileptogenèse. II-2. Interaction du système orexinergique avec les neuropeptides et les neuromédiateurs Les nombreuses efférences et afférences des neurones orexinergiques suggèrent qu'il existe des interactions importantes, dans le cerveau, entre ces neurones et les neuropeptides des centres de l'éveil/sommeil, de même qu'avec les neuropeptides des centres de l'appétit situés dans l'hypothalamus (Cf. figure 6). L'importance du rôle des orexines dans le maintien de l'état d'éveil est hautement suggérée par la découverte d'une déficience en neurones orexinergiques chez environ 90% des patients narcoleptiques (Thannickal et al., 2000). Ces peptides agissent à la fois sur: 1) les neurones histaminergiques du noyau tubéromamillaire, 2) les neurones noradrénergiques du locus coeruleus, 3) les neurones sérotoninergiques du raphe dorsal et 4) les neurones cholinergiques de la partie basale du cerveau antérieur (Sakuraï, 2005). Chez les patients narcoleptiques, il a été montré une altération de la balance énergétique, qui se traduit par une diminution de la prise alimentaire et une augmentation de l'indice de masse corporelle, suggérant l'implication du système orexinergique dans la régulation de la prise alimentaire. Des travaux ont alors montré que l'injection intracérébroventriculaire (ICV) d'oxs, chez le rat, entraînait une augmentation de la prise alimentaire (Sakuraï et al., 1998). De plus, une autre étude a montré qu'une injection simultanée ICV d'ox-a et de NPY, à des concentrations trop faibles pour qu'elles soient efficaces, entraîne une augmentation significative de la prise alimentaire (Sahu, 2002). Ces résultats suggèrent que ces deux peptides agissent de façon synergique sur la stimulation de la prise alimentaire. Outre ses interactions avec les neuropeptides, le système orexinergique semble aussi interagir avec les neuromédiateurs tel que le glutamate. En effet, des études électophysiologiques ont montré que les agonistes des récepteurs ionotropiques glutamatergiques (AMPA et NMDA) excitent les neurones orexinergiques, tandis que les antagonistes du glutamate les inhibent (Li Y et al., 2002). De plus, les ARNm codant pour les transporteurs VGLUT1 et VGLUT2 du glutamate ont été détectés respectivement dans 50% et 13% des neurones hypothalamiques exprimant les orexines (Rosin et al., 2003). Ainsi, les neurones orexinergiques, de par leur interaction avec le glutamate, pourraient bien être 10

22 Facteurs métaboliques périphériques inhibition stimulation glucose Estomac ghréline Tissus adipeux leptine Tronc cérébral Aire préoptique GABA LC noradrénaline inhibition sommeil paradoxal Raphé sérotonine anxiété Hypothalamus LHA orexines VTA dopamine éveil, attention Noyau arqué ghréline NPY TMN histamine LDT-PPN acétylcholine REM, éveil inhibition sommeil profond Prise alimentaire Figure 6 : Schéma représentant les interactions du système orexinergique avec les neuopeptides des centres de l'éveil et de l'appétit, d'après Sakuraï, Les centres dopaminergique, limbique et cholinergique sont stimulés par les orexines qui régulent l'activité motrice et le sommeil paradoxal. Les facteurs métaboliques périphériques, tels que le glucose, la leptine et la ghréline, module l'activité neuronale orexinergique afin de réguler l'état d'éveil et la balance énergétique. Abbréviations: LHA, aire latérale hypothalamique - NPY, neuropeptide Y - TMN, noyau tuberomamillaire - LC, locus coeruleus - VTA, aire tegmentale ventrale - LDT, noyau tegmental latérodorsal - PPN, noyau tegmental pedonculopontine.

23 Rappels bibliographiques impliqués lors de la mise en place de l'hyperexcitabilité, permettant la transformation d'un tissu cérébral sain en un tissu épileptogène. II-3. Le système orexinergique II-3-1. Les orexines II Synthèse des orexines Les orexines sont synthétisées à partir d'un peptide précurseur de 130 acides aminés (AA), la préproorexine, qui est issu de la traduction d"un ARNm portant le même nom. Ce peptide immature est clivé, après maturation post-traductionnelle, en orexine A (33AA) et en orexine B (28AA) (Cf. figure 7) (De Lecea et al., 1998; Sakuraï et al., 1998). Les séquences de ces deux peptides sont très conservées entre les espèces vertébrées (chez l'homme et le rat, OX-A 100% et OX-B 95% d'homologies). L'hypothalamus latéral a été, jusqu'à présent, considéré comme le seul territoire de synthèse des orexines (Sutcliffe et al., 2002). Toutefois, des études ont montré que certains neurones cérébraux exprimaient l'arnm codant pour la préproorexine, avec une synthèse locale des orexines, dans le bulbe olfactif (Caillol et al., 2003) et dans le noyau central de l'amygdale (Ciriello et al., 2003). Il est actuellement considéré que l'hypothalamus latéral constitue la principale zone de synthèse des orexines et que d'autres régions, cérébrales ou non, constituent des zones "secondaires". II Distribution des orexines Les orexines A et B, produites dans l'hypothalamus latéral, sont exportées vers de nombreux territoires cérébraux via les prolongements des neurones orexinergiques. Ces fibres se projettent vers les autres territoires de l'hypothalamus mais également vers d'autres structures cérébrales telles que le locus coeruleus, le noyau du faisceau solitaire, la substance noire et l'hippocampe (Cf. figure 8, d'après Peyron et al., 1998). II-3-2. Les récepteurs aux orexines OX 1 R et OX 2 R II Structures des OX 1 R et OX 2 R Les récepteurs OX 1 R et OX 2 R sont couplés à des protéines G et possèdent sept domaines transmembranaires codés par sept exons. Les séquences entre les récepteurs OX 1 R et OX 2 R sont fortement homologues (64%) et sont très conservées entre les espèces (chez l'homme et le rat, OX 1 R 94% et OX 2 R 95% d'homologies) (Sakuraï et al., 1998). Les 11

24 cap ARNm codant pour la préproorexine Sequence OX-A OX-B signal PolyA exon1 exon2 Peptide signal Préproorexine 130 AA Maturation post-traductionnelle 33 AA 28 AA Orexine A Orexine B Figure 7 : Schéma de la synthèse des orexines. Les orexines A et B sont issues de la maturation post-traductionnelle du peptide précurseur appelé préproorexine, lui-même traduit à partir de l'arnm du même nom. Hippocampe Aire périfornicale de l hypothalamus Figure 8 : Distribution anatomique du système orexinergique dans le cerveau de rat, d'après Peyron et al., Les orexines sont exprimées dans quelques milliers de neurones de l'aire périfornicale de l'hypothalamus latéral qui projettent vers de nombreux territoires cérébraux dont l'hippocampe.

25 Rappels bibliographiques expériences portant sur l'affinité des orexines pour leurs récepteurs montrent que OX 1 R fixerait spécifiquement OX-A tandis que OX 2 R fixerait OX-A et OX-B avec la même affinité (Sakuraï et al., 1998). II Distribution d' OX 1 R et OX 2 R La cartographie des ARNm codant pour les récepteurs OX 1 R et OX 2 R a montré que ceux-ci sont très largement distribués dans le cerveau selon une répartition différentielle. Par exemple, le locus coeruleus et le noyau du raphé dorsal expriment uniquement l'arnm d' OX 1 R tandis que le noyau tubéromamillaire et le noyau acumbens expriment l'arnm d'ox 2 R (Marcus et al., 2001). L'hippocampe exprime fortement les deux types de récepteurs mais la localisation tissulaire des ARNm par hybridation in situ a permis de montrer que cette répartition est hétérogène au sein de cette structure. L'ARNm d'ox 1 R est retrouvé dans le gyrus dentelé et les régions CA1 et CA2 de la corne d'ammon, tandis que l'arnm d'ox 2 R est présent dans le gyrus dentelé et la région CA3 de la corne d'ammon (Cf. tableau 1). Les études immunohistochimiques portant sur les deux types de récepteurs ont fait apparaître la même distribution que celle observée pour les ARNm (Cluderay et al., 2002). II Mécanismes d'action Toutes les études portant sur la transduction intracellulaire du signal orexinergique ont été menées in vitro sur des cultures cellulaires. Deux voies de signalisation pourraient être impliquées dans la transduction du signal orexinergique : la voie calcique et la voie de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc). L'activation des récepteurs OX 1 R et OX 2 R couplés à des protéines Gq entraînerait une augmentation du calcium intracellulaire résultant d'une libération de Ca 2+ à partir des stocks intracellulaires et d'un influx de Ca 2+ extracellulaire (Smart et al., 1999) (Cf. figures 9 et 10). D'autres données expérimentales ont montré que l'activation d'ox 1 R couplé à une protéine Gs provoquait une augmentation de l'ampc (Cf. figure 9) (Mazzocchi et al., 2001) alors que l'activation d'ox 2 R couplé à une protéine Gi diminuait l'ampc (Cf. figure 10) (Nanmoku et al., 2000). Le signal transmis par OX 1 R serait donc de type excitateur, tandis que celui transmis par OX 2 R serait excitateur ou inhibiteur en fonction de la nature du neurone postsynaptique. Dans le cadre de notre projet, nous avons décidé de mettre en place, au laboratoire, un modèle d'hyperexcitabilité contrôlé chez le rat: le kindling amygdalien. En effet, ce modèle animal est mieux adapté que le modèle pilocarpine pour étudier l'effet pro- ou anti- 12

26 OX 1 R OX 2 R CA1 X CA2 X X CA3 X Gyrus Denté (GD) X Tableau 1 : Distribution différentielle des récepteurs orexinergiques OX1R et OX2R dans l'hippocampe (d'après Marcus et al., 2001). L'ARNm d'ox 1 R est exprimé dans les neurones de CA1, CA2 et du gyrus denté, tandis que l'arnm d'ox2r est exprimé, quant à lui, dans les neurones de CA2 et CA3. Seule la région CA2 exprime donc les ARNm des deux types de récepteurs. OX 1 R Orexine A Ca ++ OX 1 R G q Activation des canaux Ca ++ Entrée de Ca ++ extracellulaire G s Mobilisation des stocks intracellulaires de Ca ++ [Ca ++ ] intracellulaire [AMPc] SIGNAL EXCITATEUR SIGNAL EXCITATEUR Figure 9 : Voies de transduction présumées du signal orexinergique déclenché par l'activation d'ox 1 R. La fixation de l'orexine A sur OX 1 R entraîne, selon la nature du neurone, l'activation soit d'une protéine Gq soit d'une protéine Gs. Quand OX 1 R est couplé à une protéine Gq, le Ca 2+ intracellulaire est augmenté suite à la libération de Ca 2+ par le réticulum ou par une influx de Ca 2+ extracellulaire via les canaux Ca 2+ membranaires. Quand OX 1 R est couplé à une protéine Gs, la voie de l'adénylate cyclase est activée et la concentration intracellulaire d'ampc est augmentée. Dans les deux cas, le signal transmis excite la cellule cible.

27 Rappels bibliographiques épileptogène d'un neuromédiateur. Notre travail s'est focalisé sur OX-B dont nous avons étudié l'expression génique dans l'hypothalamus et l'hippocampe, afin de vérifier son implication dans notre modèle du kindling. 13

28 OX 2 R Orexine A ou B Ca ++ OX 2 R G q Activation des canaux Ca ++ Entrée de Ca ++ extracellulaire G i Mobilisation des stocks intracellulaires de Ca ++ [Ca ++ ] intracellulaire [AMPc] SIGNAL EXCITATEUR SIGNAL INHIBITEUR Figure 10 : Voies de transduction présumées du signal orexinergique déclenché par l'activation d'ox 2 R. La fixation de l'orexine A sur OX 1 R entraîne, selon la nature du neurone, l'activation soit d'une protéine Gq soit d'une protéine Gi. Quand OX 2 R est couplé à une protéine Gq, le Ca 2+ intracellulaire est augmenté suite à la libération de Ca 2+ par le réticulum ou par une influx de Ca 2+ extracellulaire via les canaux Ca 2+ membranaires; cette hausse du Ca 2+ intracellulaire a un effet excitateur sur la cellule cible. Quand OX 2 R est couplé à une protéine Gi, la voie de l'adénylate cyclase est inhibée et la concentration intracellulaire d'ampc est diminuée; le signal transmis inhibe la cellule la cellule cible.

29 Matériels et méthodes MATERIELS ET METHODES I. ANIMAUX Des rats mâles Sprague-Dawley (180 g g) provenant de l'animalerie Harlan ont été utilisés et réceptionnés deux semaines avant traitement. Les rats ont été logés par groupes de cinq, sous conditions environnementales contrôlées (lumière de 6 h à 18 h, 23 C ± 1 C, eau et nourriture ad libitum). Le jour de l'opération, les rats ont été transférés dans des cages individuelles et maintenus isolés jusqu'à la fin de l'expérimentation. Les expériences ont été effectuées selon le décret 87/848 du Ministère de l'agriculture et de la convention Européenne 86/609. Tout au long de l'expérimentation, la douleur ressentie par les rats a été prise en compte en fonction de critères bien objectifs définis et le comité d'éthique d'expérimentation animale de l'université Claude Bernard Lyon 1 (UCBL) a donné un avis favorable au protocole. II. MODELE D'EPILEPTOGENESE : LE KINDLING AMYGDALIEN II-1. Chirurgie stéréotaxie Les rats ont été anesthésiés par une injection intra-péritonéale d'un mélange constitué de Xylazine (Rompun 2%) à 10 mg/kg et de Kétamine (Imalgène 1000) à 80 mg/kg. Une électrode de stimulation bipolaire profonde a ensuite été implantée, par stéréotaxie, dans l'amygdale droite de chaque cerveau. Les coordonnées, à partir du bregma, pour l'implantation de l'électrode étaient : Latéralité +4,7 mm Antéropostériorité +2,8 mm Hauteur -8,5 mm par rapport à la surface de l'os du crâne (Paxinos et Watson, 1998). Le site d'implantation de l'électrode profonde est représenté sur la figure 11. Les enregistrements électroencéphalographiques (EEG) ont été fait à l'aide de petites vis fixées dans l'os du crâne et reliées à un connecteur. L'électrode, les vis et le connecteur ont été maintenus par un chapeau de ciment dentaire (Paladur ). Les rats ont ensuite été mis au repos pendant 15 jours. II-2. Embrasement amygdalien Le seuil de post-décharge (After Discharge Threshold, ADT), induisant une réponse EEG, a été déterminé pour chaque rat. Les rats ont alors été stimulés deux fois par jours, de 8h30 à 9h30 et de 16h30 à 17h30, pendant trois semaines, avec une intensité égale à deux fois l'adt. Le stade comportemental atteint a été noté à la suite de chaque stimulation. 14