Introduction à la Recherche en Laboratoire Analyse bioinformatique de données de séquençage NGS médicale Dupouy Maylis Mai 2013

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1 Introduction à la Recherche en Laboratoire Analyse bioinformatique de données de séquençage NGS médicale Dupouy Maylis Mai Introduction : Dans le cadre de ma deuxième année au sein de l'ecole Nationale Supérieure d'informatique et de Mathématiques Appliquées de Grenoble (ENSIMAG), j'ai suivi le module d'introduction à la recherche en laboratoire au sein du laboratoire en Techniques de l'ingénierie Médicale et de la Complexité Informatique, Mathématiques et Applications de Grenoble (TIMC-IMAG). Le TIMC-IMAG dépend du CNRS et de l'université Joseph Fourier de Grenoble mais aussi de Grenoble INP et Vet'Agro Sup. Ce laboratoire utilise l'informatique et les mathématiques appliquées pour répondre à des problématiques de biologie et de santé. Huit équipes sont présentes dans cette structure avec pour chacune une spécialité. J'ai pour ma part intégré l'équipe de Biologie Computationnelle et Mathématique (BCM). Ses recherches s'organisent en trois axes : la génomique, la biologie des systèmes et la modélisation mathématique de systèmes biologiques complexes. Le but de cette équipe est de développer des méthodes informatiques ou mathématiques permettant le traitement non-erroné de données biologiques ou encore la modélisation de systèmes biologiques en prenant en compte toute leur complexité. Chaque axe de recherche a un domaine d'études varié. Par exemple la génomique comprend à la fois la génétique des populations et l'épidémiologie moléculaire. De même, les travaux sur les systèmes biologiques peuvent s'appliquer sur les réseaux génétiques ou sur le cancer. Pendant un semestre, j'ai travaillé sur des données génétiques fournies par le laboratoire d'andrologie, Gérontechnologie, Inflammation et Modélisation. Cette structure a été créée en 2011 pour une durée de deux ans. Elle dépend du CNRS, de l'université Joseph Fourier de Grenoble, de l'université Pierre-Mendès France de Grenoble et de l'ecole Pratique des Hautes Etudes. Ce laboratoire se divise en trois équipes : le Groupe de Recherche et d'etude du processus inflammatoire, l'équipe de Gérontechnologie, Modélisation et e-santé et l'équipe Andrologie, Génétique et Cancer. Mon projet s'inscrit dans les travaux de cette dernière équipe et plus précisément du groupe génétique infertilité et thérapeutiques. Ce groupe à plusieurs axes de recherches visant à comprendre l'infertilité masculine, le vieillissement du sperme et d'augmenter les chances de réussite de la Procréation Médicalement Assistée. Les données génétiques fournies correspondaient au séquençage de l'information génétique de trois paires de frères. Chaque paire souffre d'une pathologie très rare entraînant l'infertilité. L'infertilité de la première paire est due à une anomalie de flagelles et celles des autres paires sont dues à l'absence de spermatozoïdes dans le sperme. Le but de mon travail a donc été de mettre en évidence

2 des polymorphismes de leur ADN pouvant être responsables de ces pathologies. Je vais dans un premier temps présenter la problématique dans laquelle s'inscrit ce sujet ainsi que le contexte général d'étude et je finirai par expliquer plus précisément le travail que j'ai effectué pendant ce module. 2. Problématique et état de l'art a. Problématique De nos jours, plusieurs types de maladies sont connus, chacun ayant des causes différentes. Par exemple, une maladie peut être due à une infection bactérienne ou encore virale. D'autres maladies sont génétiques et c'est dans ce cadre là que le projet s'inscrit. En effet, de nombreuses caractéristiques d'un individu sont définies par son matériel génétique, qui est constitué d'acide désoxyribonucléique (ADN). A travers divers processus biologiques, l'adn est responsable du fonctionnement de notre corps et influence notre aspect physique par exemple. Au sein des noyaux de nos cellules, l'adn ne se présente pas sous la forme d'une seule séquence; il se présente sous forme de différents fragments : les chromosomes. Chimiquement parlant, l'adn se compose de quatre bases azotées : l'adénine (A), la guanine (G), la cytosine (C) et la thymine (T). Ces bases sont appelées nucléotides et forment pour chaque chromosome une séquence particulière. Les cellules humaines sont dites diploïdes, c'està-dire que chaque chromosome est présent en deux exemplaires, l'un étant hérité du père, l'autre de la mère. Ces deux copies forment une paire de chromosomes dits «homologues». Deux chromosomes homologues contiennent globalement la même information génétique, différente de celles des autres chromosomes de l'organisme. Cette information est contenue dans des sous-parties du chromosome appelées gènes. Chaque gène détermine un ou plusieurs caractères héréditaires spécifiques. Ainsi, les maladies génétiques peuvent s'expliquer par des modifications de la séquence nucléotidique (des mutations ponctuelles, des délétions ou des insertions par exemple) qui entraînent le dysfonctionnement du caractère héréditaire déterminé par le gène ayant subi une ou plusieurs variations. Une branche de la recherche en génomique consiste à chercher, chez des individus atteints d'une pathologie donnée, des gènes qui portent un polymorphisme responsable de cette pathologie. Cela permet tout d'abord de connaître la cause exacte de la maladie et donc permettre un diagnostic futur. De plus, connaître un gène responsable d'un dysfonctionnement d'une caractéristique donnée démontre aussi que le gène participe à la définition de cette caractéristique chez l'ensemble des êtres humains et on peut donc lui attribuer une nouvelle fonction. Enfin, c'est un pré-requis au développement de la fameuse «médecine personnalisée», où le traitement est adapté à chaque patient en fonction des causes moléculaires de sa pathologie. Dans ce projet, les patients considérés sont atteints de trois types rares d'infertilité masculine et le but était donc d'essayer de trouver des gènes modifiés responsables de ces pathologies. Je vais maintenant parler plus précisément de la démarche utilisée pour répondre à cette problématique.

3 b. Etat de l'art La plupart des approches mises en œuvre pour identifier des gènes responsables de maladies se basent sur le séquençage de l'adn [5][6][7][8][9]. Cette technique consiste à trouver dans quel ordre s enchaînent les nucléotides dans les chromosomes. Les premières méthodes mises au point ne permettaient pas l'identification d'un grand nombre de bases, elles étaient de plus coûteuses en temps, et ce malgré leur automatisation. Appliquer une de ces méthodes à notre problématique nécessitait donc d'avoir sélectionné au préalable des gènes susceptibles d'être impliqués dans la maladie étudiée. Le séquençage est devenu accessible pour l'analyse de pathologies lors de l'apparition des méthodes de séquençage de nouvelle génération. Elles ont permis de lire des fragments d'adn plus courts mais en bien plus grand nombre. Le séquençage rapide d'un génome entier à un coût raisonnable est donc devenu possible. Avoir accès à un génome entier permet d'étudier non pas quelques gènes présélectionnés mais l'ensemble des gènes et augmente donc les chances de trouver un gène responsable d'une maladie. Cependant, en général, pour déterminer une variation génétique responsable d'une maladie le génome n'est pas entièrement séquencé car le coût reste onéreux pour être utiliser couramment dans le domaine de la recherche. Une stratégie consiste à séquencer les exons, c'est-à-dire les parties de gène qui interviennent dans la synthèse des protéines (principaux acteurs de notre métabolisme). En effet, les gènes se présentent comme des successions d'exons et d'introns. Les exons représentent 1 à 2% du génome et le rôle fonctionnel des introns est encore mal connu de nos jours. Le séquençage des exons uniquement a un coût réduit par rapport au séquençage d'un génome complet. Cette méthode à déjà fait ses preuves pour identifier les gènes responsables de certains troubles mendéliens. [1] Le séquençage de l'adn est suivi de l'alignement. Pour chaque read (longueur de l'ordre de 50 bases) produit par le séquenceur, cette étape consiste à identifier le site d'où il provient dans le génome de référence. Le but de cette étape est de permettre la détection de polymorphismes pour pouvoir étudier leur impact sur les différents gènes et savoir s'ils pourraient être responsables de la pathologie. Figure 1 - Exemple d'alignement. Les portions vertes représentent les reads, les portions rouges les polymorphismes, et la séquence en bleu est la séquence de référence Suite à l'alignement, pour une position donnée, il y a trois possibilités (voir figure 1): soit les nucléotides des deux séquences sont identiques, soit elles sont différentes, soit le séquençage de l'adn effectué ne permet pas d'avoir l'information de manière fiable. L'étape qui suit, l'appel des Single-Nucléotide Polymorphisms (SNPs) [2], détecte l'ensemble des polymorphismes d'un seul nucléotide entre l'individu étudié et le génome de référence et détermine son génotype. Comme cela est

4 expliqué précédemment, les humains ont des paires de chromosomes homologues. Les gènes sont donc aussi présents sous deux versions nommées allèles. Pour une position donnée, il y a deux possibilités de génotype : l'individu est homozygote si les deux allèles sont identiques et hétérozygote sinon. A ce stade, les polymorphismes rencontrés à des positions où la fiabilité de l'alignement est remise en cause ne sont pas retenus. Le critère de fiabilité sera expliqué dans la partie suivant. Cependant, la liste de SNPs restants est encore trop importante et n'est donc pas exploitable. Une étape de tri est nécessaire avant d'étudier l'impact des SNPs. Le tri ne doit conserver que les SNPs cohérents avec la pathologie du patient. Par exemple, si on étudie une maladie pour laquelle le polymorphisme responsable est supposé dominant, l'individu peut être hétérozygote pour les SNPs candidats alors que dans le cas d'un polymorphisme récessif il ne peut pas. (Voir Annexes pour une définition plus approfondie des termes génétiques). Il y a différentes stratégies pour traiter cette étape [3]. 3. Travail effectué: Comme cela est expliqué dans l'introduction, l'équipe du Docteur Pierre Ray a fourni au laboratoire TIMC-IMAG des données génétiques issues du séquençage de six patients. Ces patients sont atteints de formes rares d'infertilité masculine. Les six patients se divisaient en trois paires de frères, chaque paire ayant une pathologie différente. Une des pathologies correspond à une anomalie sur les flagelles des spermatozoïdes. Les deux autres sont des cas d'azoospermie (absence de spermatozoïdes). Il est important de préciser pour la suite qu'un individu de la paire de frères numéro trois a été séquencé 2 fois par erreur. La première étape du travail a été le réalignement des données et l'appel des SNPs, puis, nous avons appliqué deux filtres aux polymorphismes trouvés. Pour finir, nous avons tenté d'améliorer les résultats obtenus et nous les avons analysés. a. Alignement et appel des SNPs Ainsi, la première étape a consisté à aligner les données issues du séquençage sur le génome de référence humain. Cette étape a été permise grâce au logiciel MAGIC développé par un organisme américain, le NCBI. L'alignement doit faire face à plusieurs difficultés. Tout d'abord, le logiciel doit savoir faire la différence entre des variations dues à une erreur expérimentale issues du séquençage et un vrai polymorphisme. Les zones répétées du génome sont aussi difficile à aligner. En effet, une séquence donnée peut être présente plusieurs fois dans le génome (à de petites variations près), à la suite (microsatellites) ou à des positions différentes. Il est donc difficile voire impossible de savoir d'où provient un read issu d'une telle séquence répétée. Lorsque les séquences sont successives la difficulté réside dans le fait que le nombre de répétitions varie entre individu et entre chromosomes homologues. Pour pallier à ces complications, l'adn a été séquencé de manière particulière, dite "paired end": pour chaque segment d'adn traité, le séquençage a été réalisé à chaque extrémité. Il en ressort ainsi deux lectures différentes qui doivent se placer sur le génome à une faible distance

5 l'une de l'autre et en sens inverse, ce qui permet de résoudre des ambiguïtés lors de l'alignement. La réalisation de nos analyses, en particulier l'alignement, a pris du temps car le logiciel MAGIC est en constante évolution. Les chercheurs du NCBI développent et améliorent ce logiciel en prenant en compte les besoins de leur laboratoire. Les modifications apportées au logiciel introduisent parfois des bogues au niveau de l'utilisation faite par le laboratoire TIMC-IMAG. Une première partie de mon travail a consisté à identifier et corriger certains de ces bogues. A la fin de l'alignement, plusieurs reads (ou lectures) différents recouvrent une même position. Le nombre de reads à une position donnée définit sa couverture. Le logiciel n'a ensuite retenu que les SNPs contenus dans de larges zones du génome ayant une couverture suffisante. L'ADN a une double hélice, il est composé de deux brins et le dernier rôle du logiciel a été de compter le nombre de versions variantes et de versions de référence rencontrées pour chaque individu, pour chaque brin et pour chaque position des zones sélectionnées. b. Sélection des SNPs les plus prometteurs Une fois l'utilisation du logiciel terminée, nous avons pu commencer à trier les SNPs selon plusieurs critères que je vais énumérer. J'expliquerai ensuite comment ces critères ont été pris en compte en pratique. Elimination des SNPs non fiable : Du point de vu qualitatif, le critère de tri s'est porté sur la couverture des polymorphismes retenus. Plus il y a de fragments à une position donnée, moins il y a de chances de faire une erreur quand on détermine la présence ou non de SNPs. Ainsi, un polymorphisme observé sur une position peu couverte n'est pas retenu. En effet, si une position n'est couverte que par trois reads dont deux comportent un polymorphisme alors que le troisième porte la séquence du génome de référence, conclure qu'il y a une mutation semble erroné. Par ailleurs, les reads sur les deux brins doivent en théorie être identiques (mais en sens inverse). Cependant ce n'est pas toujours le cas, car les séquenceurs peuvent produire des erreurs systématiques qui dépendant de la séquence lue. Pour qu'un SNP puisse être appelé de manière fiable, nous imposons donc que le nucléotide sujet de la mutation soit couvert au moins dix fois sur chaque brin, et que les deux brins soient en accord. Ainsi, les individus étant hétérozygotes, la probabilité de n'avoir séquencé qu'un allèle sur les deux présents est suffisamment faible. [4] Elimination de SNPs par exploitation des liens de parenté : Le deuxième critère de tri que nous avons choisi d'appliquer est une méthode exploitant les liens de parenté entre individus touchés par une même pathologie. Cette méthode est appelée la linkage strategy [3]. On s'attend à ce que, si plusieurs individus d'une même famille sont atteints, un même polymorphisme soit responsable de leur maladie : on va donc chercher des polymorphismes présents chez tous les patients d'une même famille. En complément, des membres sains de la famille peuvent aussi faire séquencer leur ADN : cela permet d'exclure des mutations bénignes. Je n'avais pas de données supplémentaires d'autres individus sains de la famille, je n'ai donc vérifiée que la première obligation : un polymorphisme

6 éligible pour une paire de frères donnée devait être présent dans l'adn des deux patients. Pour pouvoir prendre en compte toutes les données issues du séquençage, j'ai travaillé non pas avec trois paires de frères mais avec quatre. Un SNP responsable de la pathologie de la dernière paire de frères devait donc être un bon candidat pour les deux paires constituées des mêmes frères. Elimination de SNPs à partir d'hypothèses faites sur les pathologies : Dans le cadre de notre projet, la première hypothèse est que l'allèle responsable de la pathologie est récessive et que les patients sont donc homozygotes (puisqu'ils présentent le phénotype). En effet, nos individus sont stériles mais leurs pères ne l'étaient pas. Il y a alors deux solutions : soit le polymorphisme est dominant et hérité de leurs mères uniquement, soit il est récessif et hérité des deux parents. Il s'agit cependant de pathologies très rares, la première possibilité semble donc peu probable : si le polymorphisme était dominant, il y aurait plus d'individus atteints. Enfin les patients sont pour la plupart issus de populations consanguines ce qui favorise l'apparition de pathologies suivant un mode de transmission récessif. Cette hypothèse est importante car les polymorphismes hétérozygotes sont plus nombreux et cela nous permet donc de les éliminer. Elimination de SNPs en prenant en compte le génome des autres individus : Les pathologies des différentes paires de frères sont rares et différentes. Les polymorphismes responsables ne doivent donc pas être les mêmes entre les maladies. Le fait de travailler sur trois paires de frères en parallèle nous donne l'occasion d'utiliser les autres individus pour éliminer des SNPs. Les personnes n'appartenant pas à une paire de frères donnée ne doivent pas être porteuses homozygotes du polymorphisme responsable de sa pathologie. Mise en pratique de ces critères : En pratique, l'hétérozygotie ou l'homozygotie des individus est calculée à partir du pourcentage de lectures porteuses du polymorphisme. Le calcul fait par la majorité des logiciels est le suivant : Avec V le nombre de versions ayant le polymorphisme et R le nombre de versions identiques au génome de référence. Cependant, les deux brins de l'adn sont complémentaires et contiennent donc la même information. La plateforme MAGIC nous fournissait les informations relatives à chaque brin. Ainsi, nous avons utilisé ces informations en calculant le pourcentage de versions modifiées rencontrées pour chaque brin. Les calculs effectués sont les suivants : et Les pôles (+ et -) ajoutés aux lettres correspondent aux brins sur lesquels les chiffres portent. Les lettres ont la même signification que dans la formule précédente. La comparaison des résultats obtenus pour chaque brin correspond à un premier critère de cohérence nécessaire. En effet les brins appartenant aux mêmes chromosomes sont complémentaires deux à deux et portent donc nécessairement le même génotype. Si le résultat du premier brin indique la présence d'un SNP homozygote et celui du deuxième brin correspond à un SNP hétérozygote, on sait qu'il y a eu une erreur

7 (souvent provenant d'erreurs systématiques et séquence-spécifiques des séquenceurs) mais on ne peut pas savoir dans quel sens, et on ne prend donc pas le polymorphisme en compte. Les informations apportées par ce calcul permettent plus précisément de déterminer si l'individu est homozygote référence, hétérozygote ou homozygote variant. Un individu est considéré comme homozygote référence si la proportion de version mutées est trop faible (<0.2). En effet, comme cela est dit précédemment, les expériences effectuées sont bruitées et des erreurs sont possibles. Ce n'est pas parce qu'on a rencontré une version mutée à une position donnée qu'elle est vraiment présente dans l'organisme ; il peut s'agir d'une erreur de séquençage ou d'alignement. Un individu est déterminé comme hétérozygote (c'est-à-dire qu'il a hérité d'un seul allèle variant sur les deux présents dans son organisme) si la proportion d'adn muté représente environ la moitié de l'adn séquencé (pourcentage compris entre 0,3 et 0,7). Le cas d'un individu homozygote cassé (les deux allèles ont hérité du polymorphisme) est choisi si la proportion d'adn muté est fortement représentée (>0,8). Les intervalles [0,2 ; 0,3] et [0,7 ; 0,8] correspondent à des zones ambiguës. S'il n'y a une ambiguïté que pour un des deux calculs, le génotype est déterminé en fonction de la valeur obtenue pour l'autre brin. Par exemple, si on trouve une valeur inférieure à 0,2 et une comprise entre 0,2 et 0,3 on va estimer que l'individu est homozygote de référence. Si ce n'est pas le cas ou si la valeur trouvée sur l'autre brin n'est pas cohérente, le polymorphisme n'est pas considéré comme un bon candidat. Avec cette technique, on a pu regarder pour quelles positions et quels polymorphismes deux frères étaient homozygotes variant alors que les autres individus étaient hétérozygotes ou homozygotes référence. Une couverture insuffisante, des résultats incohérents entre les deux brins ou encore l'absence d'un polymorphisme donné chez un des individus représente une absence d'information. En effet, dans le dernier cas, on ne peut pas savoir si l'individu a ce polymorphisme ou encore nous ne pouvons pas connaître son génotype. Lorsque deux frères sont homozygotes pour une mutation donnée, si pour l'un des autres individus il y a un manque d'information, le polymorphisme n'est pas retenu comme candidat valable. Ce choix pourrait potentiellement éliminer le candidat responsable de la pathologie mais permet aussi de réduire la probabilité de garder un polymorphisme qui n'est en réalité pas un bon candidat. A la sortie de mon script de tri, il reste 1776 SNPs susceptibles d'être la cause des pathologies des différentes paires de frères. c. Application d'un deuxième filtre La quantité de SNPs étant encore trop importante, nous avons appliqué un nouveau filtre. Je vais donc expliquer les nouveaux critères pris en compte. Tri des SNPs selon l'expression des gènes : L'information génétique est la même dans toutes les cellules pourtant tous les gènes ne sont pas "actifs" dans toutes. On dit qu'un gène est exprimé dans une cellule s'il est à l'origine de la synthèse d'une protéine présente dans celle-ci. En fait, un gène n'a pas que deux états possibles (exprimé ou non-exprimé). Il y a différents degrés d'expression d'un gène selon le type de

8 cellules. Le degré d'expression est quantifié par un score entre 0 et 30. A l'aide de la base de données Aceview développée par le NCBI, le score dans les cellules testiculaires ont été récupéré pour les gènes concernés par les SNPs candidats. Nous avons imposé un score minimal de 10. Tri des SNPs selon leur position : Bien qu'ils ne soient pas ciblés lors de la capture, certains fragments d'introns peuvent apparaître dans les données séquencées. Cependant le rôle des introns est trop peu connu à l'heure actuelle, et l'effet d'un SNP situé dans un intron n'est pas facile à déterminer. Nous avons choisi de retenir les SNPs introniques que s'ils étaient situés dans un voisinage très proche des exons (+2/-2 nucléotides). Leur proximité avec l'exon peut entraîner, en cas de mutations, des perturbations dans la synthèse de la protéine. Ainsi, un SNP trop éloigné des exons est éliminé. Tri des SNPs selon leurs conséquences : Le but est de déterminer l'impact des polymorphismes sur les protéines encodées par les gènes touchés. Il y a différents types de polymorphisme. En effet, lors de la génération d une protéine à partir de l ADN, chaque ensemble de 3 nucléotides (codons) permet de déterminer un élément de la protéine (un acide aminé) ou alors de signaler la fin de la protéine (cas du codon stop). Un codon ne peut coder que pour un seul acide aminé mais un acide aminé peut être codé par plusieurs codons. On parle de redondance du code génétique. Nous avons choisi de ne prendre en compte que les mutations qui sont à l origine du remplacement d un acide aminé par un codon stop ou alors les délétions ou suppressions d un nombre de nucléotides non multiple de trois. En effet, si la délétion ou la suppression affecte un nombre de nucléotides divisible par trois, cela correspond à la suppression ou à l ajout d un acide aminé dans la protéine : son impact est plus difficile à déterminer. Dans le cas contraire, ces phénomènes entraînent un décalage du cadre de lecture pour la traduction de l ADN en acide aminé et donc la majorité des acides aminés déterminés après ce polymorphisme seront différents de ceux de la protéine initiale, et aboutiront statistiquement rapidement à un codon stop : toute la fin de la molécule est modifiée et tronquée. Dans le cas d'une mutation d un nucléotide qui ne change pas l acide aminé correspondant ou lorsqu elle entraîne juste l échange d un acide aminé par un autre ou la suppression ou l'ajout d'un acide aminé, ses conséquences sont plus difficiles à déterminer. Par exemple, le remplacement d'un acide aminé par un autre peut avoir un impact sur le repliement de la protéine et les conséquences sur sa fonction ne peuvent être connues que par une étude supplémentaire. Mise en pratique : J'ai utilisé un script développé par Laure Sambourg (BCM) permettant de calculer l'impact de chaque SNPs sur les différents gènes auxquels il appartient. À la sortie de ce second script, il n'y avait plus que 10 SNPs susceptibles d'être responsables d'une des pathologies (voir Figure 2). Le premier problème est que ces SNPs concernaient soit la première paire de frères soit la deuxième. Il semblerait donc que la mutation responsable de la pathologie de la troisième paire ait été éliminée au cours des tris. De plus, les filtres associés ne sont pas trop exigeants et on s'attendait donc à avoir une liste de gènes candidats plus longue.

9 Résultat de la première expérience Paire 1 Paire 2 Paire 3 Paire 4 Figure 2 - Proportion de SNPs candidats trouvés pour chaque paire de frère d. Amélioration des résultats Après analyse des données initiales, il s'est avéré que les fichiers correspondants aux individus de la dernière paire de frères avaient une taille bien moins conséquente que ceux des autres paires. Il semblait donc que la couverture du séquençage de cette paire de frères ne soit pas assez élevée et que cela faussait nos résultats. L'expérience a donc été répétée en utilisant uniquement les individus des premières paires de frères. Il y a eu alors 177 polymorphismes candidats en sortie; ce qui était plus cohérent avec nos attentes. Plus précisément 70 SNPs candidats ont été trouvés pour la première paire et 107 pour la deuxième. e. Analyse des résultats Le laboratoire AGIM a fait appel avant le début de mon projet à une entreprise de bioinformatique, Intéragène, pour réaliser un travail similaire sur une des paires de frères azoospermiques (la première). Après leurs analyses, 22 gènes candidats ont été retenus. Par des analyses supplémentaires du laboratoire, un des SNPs proposés a été mis en avant comme meilleur candidat à la vue des gènes qu'il modifiait. Nous avons donc regardé si ces 22 gènes étaient présents de notre liste de résultats; car cela nous permettrait d'avoir confiance dans les résultats obtenus pour l'autre paire de frères. Cependant, un seul des gènes était commun aux deux listes. Il s'agissait d'un gène positionné sur le chromosome X. Le chromosome est traité comme n'importe quel chromosome par mon script mais un polymorphisme sur ce chromosome n'est pas valide. Tout d'abord, les individus masculins sont hémizygotes pour les chromosomes X et Y; nous les avons considérés comme homozygote dans le script. De plus, le chromosome X d'un homme est hérité de sa mère et, comme expliqué précédemment, que la maladie soit due à un héritage purement maternel est peu probable. Nous avons donc essayé de comprendre pourquoi nos filtres avaient éliminé les polymorphismes retenus par l'entreprise. Nous n'avons pas eu le temps de traiter les 22 SNPs mais pour les premiers de la liste deux cas ont été observés : soit le SNP ne passait pas le deuxième filtre soit le SNP était absent du fichier de sortie de MAGIC. Ainsi, suite à cette comparaison, nous ne sommes pas capables de conclure si c'est notre analyse ou celle d'intéragène qui est erronée. L'analyse des résultats s'est donc arrêtée à cette étape. Si les résultats avaient été validés, il aurait cependant fallu utiliser la base de données Aceview pour déterminer la fonction des gènes candidats et voir si elle avait un rapport avec la spermatogénèse.

10 4. Conclusion Au cours de ce semestre passé en laboratoire, mon objectif était de trouver, à partir de données issues d'un séquençage nouvelle génération, une liste de gènes potentiellement responsables de trois pathologies d'infertilité masculine. La faible couverture d'une paire de frères m'a empêchée d'atteindre ce but pour l'une des pathologies, mais, j'ai trouvé 70 gènes candidats pour la première paire de frères et 107 pour la deuxième. Les méthodes utilisées pour réaliser ce travail sont des méthodes classiques pour résoudre ce genre de problématique : l'alignement des données séquencées, le génotypage de chaque individu qui comprend l'élimination des polymorphismes pour lesquels la qualité de l'alignement ou des données n'était pas suffisante, l'exploitation d'un lien de parenté ou encore l'analyse des gènes touchés. Cependant, le faible recouvrement avec les résultats trouvés par une entreprise de bioinformatique pour une des paires de frères nous empêche de conclure quant à la qualité des résultats obtenus. Cependant, nos résultats pourraient peut-être être validés ou invalidés par l'analyse des fonctions des gènes touchés par les polymorphismes candidats. 5. Remerciements Merci à Nicolas Thierry-Mieg et Laure Sambourg pour m'avoir encadrée durant ce module. 6. Annexes Explication approfondie des termes dominant et récessif : Les gènes déterminent le phénotype d'un individu c'est-à-dire ses caractères observables. Les caractères déterminés par un gène dépendent donc des deux allèles du gène. Il y a alors plusieurs possibilités. Pour illustrer les différents cas, nous prendrons l'exemple du groupe sanguin. Dans le cas d'un individu homozygote, le caractère est déterminé par la seule allèle présente. Les gens du groupe "O" ont deux fois l'allèle "O". Dans le cas d'un individu hétérozygote, la première possibilité est d'avoir un allèle dominant et un récessif (c'est-à-dire qu'il n'y a qu'un allèle qui influe sur le phénotype de l'individu). C'est le cas par exemple des individus qui ont un allèle "A" et un "O", le groupe sanguin qui en résulte est "A" : l'allèle "A" est dominante et l'allèle "O" est récessive. La dernière possibilité est que les allèles soient codominantes (les deux s'expriment). Les allèles "A" et "B" sont codominantes, un individu ayant ces deux allèles est de groupe sanguin "AB". 7. Bibliographie Publications: 1 Michael J. Bamshad et al, Exome Sequencing as a tool for Mendelian disease gene discovery, Rasmus Nielsen et all, Genotype and SNP calling from next-generation sequencing data, Christian Gilissen et al, Disease gene identification strategies for exome sequencing, Christian Gilissen et al, Exome sequencing identifies WDR35 Variants Involved in Sensenbrenner Syndrome, Rachel Emma Dickinson et al, Exome sequencing identifies GATA-2 as the cause of

11 dendritic cell, monocyte, B and NK lymphoid deficiency, Bin Xu et al, Exome sequencing supports a de novo mutational paradigm for schizophrenia, Minji Byun et al, Whole-exome sequencingbased discovery of STIM1 deficiency in a child with fatal classic Kaposi sarcorma, Janel O. Johnson et al, Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS, Jutta Becker et al, Exome sequencing Identifies Truncating Mutations in Human SERPINF1 in Autosomal-Recessive Osteogenesis Imperfecta, 2011 Image: