Travaux dirigés BIO24c Dominique Schneider Séance 4.

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1 Travaux dirigés BIO24c Dominique Schneider Séance 4. L opéron lytsr de Staphylococcus aureus code un système de régulation à deux composants qui affecte l activité peptidoglycane hydrolase et l autolyse. L inactivation de lytsr provoque en effet l altération de l activité peptidoglycane hydrolase et une lyse cellulaire spontanée. Après induction, le senseur LytS interagit avec son régulateur de réponse LytR qui active alors la transcription des gènes qui sont sous son contrôle. Une de ses cibles est l opéron lrgab qui, avec l opéron cidabc, contrôle la lyse et la mort cellulaire. Une des fonctions biologiques des opérons lrg et cid est de contrôler la lyse et la mort cellulaire pendant le développement du biofilm, la lyse procurant une source d ADN génomique extracellulaire servant de matrice pour le biofilm. Le gène cida code une peptidoglycane hydrolase et constitue ainsi un effecteur positif de la lyse cellulaire et de la libération d ADN au sein du biofilm. A l opposé, lrga code une anti-hydrolase et constitue un inhibiteur de la lyse cellulaire et de la libération d ADN au sein du biofilm. La transcription de ces deux opérons obéit à une régulation complexe, liée à des fluctuations du métabolisme des sucres et du potentiel de membrane. En revanche, les mécanismes moléculaires reliant ces signaux à la transcription des opérons lrgab et cidabc sont inconnus. 1) Un mutant délété du gène lyts, appelé KB999, a été construit dans la souche de référence UAMS-1 de S. aureus. En parallèle, un plasmide a été construit sur lequel le gène lyts a été cloné, et ce plasmide a été appelé pbk5. Des expériences de Northern blots ont été réalisées, avec des sondes ADN correspondant aux gènes lyts et lytr (Figure 1). 1 2 WT lyts lyts::pbk5 3 4 Figure 1 : Expression des gènes lyts et lytr. souches UAMS 1 (WT), KB999 ( lyts) et KB999 transformée avec le plasmide pbk5 ( lyts::pbk5). Rangées 2 et 4 : électrophorèse sur gels d agarose séparant les ARNs extraits des différentes souches ; les deux bandes correspondant aux ARN ribosomiques et sont nettement visibles. Rangées 1 et 3 : après transferts sur membranes de nylon, les gels ont été hybridés avec deux sondes correspondant aux gènes lyts et lytr, respectivement. a) Quel est le principe et à quoi sert un Northern? b) Quel est l intérêt du plasmide pbk5? c) Que montrent ces expériences?

2 2) Des expériences similaires ont été réalisées, mais cette fois en utilisant comme sonde radio marquée un fragment d ADN correspondant aux gènes lrgab (Figure 2). 1 -glucose 2 3 +glucose 4 Figure 2 : Expression des gènes lrgab. souches UAMS 1 (pistes 1), KB999 (pistes 2) et KB999 transformée avec le plasmide pbk5 (pistes 3 et 4). Les ARNs ont été extraits après 2, 4 et 6 heures de cultures contenant ou non du glucose comme source de carbone. Rangées 2 et 4 : électrophorèse sur gels d agarose séparant les ARNs extraits des différentes souches ; les deux bandes correspondant aux ARN ribosomiques et sont nettement visibles. Rangées 1 et 3 : après transferts sur membranes de nylon, les gels ont été hybridés avec une sonde correspondant aux gènes lrgab. a) Que montrent ces expériences? b) Comment feriez-vous pour étudier l effet de lytsr sur la transcription de cidabc? c) Proposez une autre technique pour démontrer votre conclusion. 3) Des cultures de la souche UAMS-1 de S. aureus ont été réalisées en milieu riche en présence de gramicidine ou de carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) qui dissipent le potentiel de membrane. Les ARNs ont été extraits et des expériences de Northern ont été réalisées avec une sonde spécifique des gènes lrgab (Figure 3). A - CCCP B

3 Figure 3 : Expression des gènes lrgab. souches UAMS 1 (pistes 1), KB999 (pistes 2) et KB999 transformée avec le plasmide pbk5 (pistes 3 et 4). Les ARNs ont été extraits après 4 heures de cultures sans glucose mais contenant (B) ou non (A) de la gramicidine ou du CCCP. Rangée 2 (en partant du haut) : électrophorèse sur gels d agarose séparant les ARNs extraits des différentes souches dans les différentes conditions ; les deux bandes correspondant aux ARN ribosomiques et sont nettement visibles. Rangée 1 (en partant du haut) : après transferts sur membranes de nylon, les gels ont été hybridés avec une sonde correspondant aux gènes lrgab. a) Comment la gramicidine et le CCCP pourraient-ils agir pour modifier le potentiel de membrane? b) Est-ce que les résultats sont conformes à ceux de la Figure 2? c) Interprétez ces résultats. 4) La capacité du mutant KB999 à former un biofilm a été analysée. Des cultures des trois souches de S. aureus UAMS-1, KB999 et KB999::pBK5 ont été déposées dans des plaques de microtitration 96 puits et incubées pendant 24 heures en conditions statiques (Figure 4). Figure 4 : Formation de biofilms. Des cultures des souches UAMS 1, KB999 et KB999::pBK5 ont été déposées dans des plaques de microtitration 96 puits et incubées pendant 24 heures en conditions statiques. Une souche contrôle, incapable de former des biofilms (KB1050), a également été utilisée. Après incubation, les cultures ont été séchées et une coloration au crystal violet a été réalisée (partie gauche). La capacité à former un biofilm a alors été quantifiée par la mesure de l absorbance à 655nm (partie droite). a) Interprétez ces résultats. b) Quelle serait votre prédiction quant à la capacité à former un biofilm pour un mutant des gènes lrgab? Pour un mutant des gènes cidabc? 5) La quantité d ADN extracellulaire au sein du biofilm formé par ces différentes souches a été mesurée (Figure 5).

4 Figure 5 : Quantité d ADN extracellulaire au sein des biofilms. Après formation des biofilms (décrite dans la légende de la Figure 4), l ADN extracellulaire a été extrait et quantifié par PCR en temps réel en utilisant des amorces spécifiques de 4 gènes : gyra, leua, lysa et fhua codant l ADN gyrase, la 2 isopropylmalate synthase, la diaminopimélate décarboxylase A et la protéine A de transport de ferrichrome, respectivement. Les valeurs sont exprimées en nanogrammes d ADN extracellulaire par biomasse relative de biofilm, et représentent la moyenne de trois expériences indépendantes, chacune effectuée en triplicat. Les barres d erreurs correspondent aux erreurs standards des moyennes. a) Pourquoi trois expériences indépendantes? Pourquoi chacune en triplicat? b) Expliquer l unité de mesure de la concentration en ADN extracellulaire? c) Pourquoi 4 gènes ont-ils été utilisés pour estimer la concentration en ADN extracellulaire? d) Interprétez les résultats obtenus. e) Sont-ils conformes à ceux de la Figure 4? 6) La capacité de maturation du biofilm a été ensuite étudiée dans les souches UAMS-1, KB999 et KB999::pBK5 en utilisant des chambres à flux cellulaire (Figure 6).

5 Figure 6 : Maturation des biofilms. Les trois souches UAMS 1, KB999 et KB999::pBK5 ont été incubées pendant trois jours dans des chambres à flux cellulaire. (A) Images représentatives des biofilms. (B) Colorations au Syto 9 (vert) et Toto 3 (rouge) des cellules vivantes et mortes, respectivement (le Toto 3 marque également l ADN extracellulaire). Les images sont prises de dessus avec des vues orthogonales (au dessus). (C) Les images de chaque biofilm ont été compilées, et le biofilm proche du substrat solide est visualisé par une vue de dessous. (D) Les images du biofilm ont été analysées et la biomasse totale (histogrammes noirs, en m 3 / m 2 ), l épaisseur moyenne (histogrammes blancs, en m) et le volume moyen de colonie au niveau du substrat solide (histogrammes gris, en x10nm 3 ) ont été mesurés. Les barres d erreurs représentent les erreurs standards des moyennes. a) Que peut-on tirer de ces expériences quant aux caractéristiques des biofilms formés par les différentes souches? Au niveau de la structure générale des biofilms? Au niveau des profils de coloration? Au niveau de l adhésion au substrat solide? Au niveau des différents paramètres mesurés? b) De façon plus générale, que signifient ces résultats? 7) Proposez un modèle général reliant le système à deux composants LytSR à la capacité de S. aureus à former un biofilm. Indiquez dans votre modèle les signaux environnementaux et les intermédiaires impliqués.