Activité technologique en analyse biochimique N 5
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- Antonin Martineau
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1 Année ème année BTS Bioanalyses et Contrôles & BTS Biophysicien Activité technologique en analyse biochimique N 5 L. GODIN ligodin@free.fr E.T.S.L. - 95, rue du Dessous des Berges PARIS Tél: Fax: Site: - Mail: mail@etsl.fr
2 TP n 5 : MÉTHODE DES AJOUTS DOSÉS PRINCIPE ET APPLICATIONS 1. BUT 2 2. APPLICATION A LA SPECTROSCOPIE UV-VISIBLE Produits Matériel et réactifs fournis Généralités Mode opératoire dans le cas de l'utilisation de la méthode de la droite d'étalonnage Préparation des solutions mères S 0 et B Préparation et mesure des solutions filles Méthode de la droite d'étalonnage Obtention de la droite d'étalonnage Mode opératoire dans le cas de l'utilisation de la méthode des ajouts dosés Préparation des solutions filles Méthode des ajouts dosés Réalisation des mesures et obtention de la droite Analyse des résultats Conclusion et comparaison des résultats 7 3. APPLICATION A LA SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENCE Produits Matériel et réactifs fournis Généralités Mode opératoire Préparation des solutions mères S 0 et S Sch Préparation et mesure des solutions filles Résultats Conclusion CONCLUSION GENERALE ELEMENTS DE REPONSE AUX QUESTIONS 11 E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.0/25
3 6. RAPPORT D'ACTIVITE : APPLICATION DES AJOUTS DOSES A LA SPECTROSCOPIE UV-VISIBLE Mode opératoire dans le cas de l'utilisation de la méthode de la droite d'étalonnage Préparation des solutions mères S 0 et B Préparation et mesure des solutions filles Méthode de la droite d'étalonnage Obtention de la droite d'étalonnage Mode opératoire dans le cas de l'utilisation de la méthode des ajouts dosés Méthode des ajouts dosés Réalisation des mesures et obtention de la droite Analyse des résultats Conclusion et comparaison des résultats APPLICATION DES AJOUTS DOSES A LA SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENCE Préparation des solutions mères S 0 et S Sch Résutats Conclusion et comparaison des résultats CONCLUSION GENERALE 25 E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.1/25
4 1. BUT Ce Tp expose les principes et fondements de la méthode des ajouts dosés (aussi nommée méthode des additions connues). Cette méthode constitue une alternative intéressante à la méthode de la droite de calibration afin de déterminer la concentration d'un analyte donné. Celle-ci possède notamment comme avantage la prise en compte des effets matrice (c'est-à-dire du réel milieu environnant de l'analyte). Le but du Tp est d'appliquer cette méthode à plusieurs types d'analyses tels que la spectrophotométrie d'absorption UV-Visible et la spectrofluorimétrie. 2. APPLICATION À LA SPECTROSCOPIE UV-VISIBLE 2.1. Produits Bleu patenté V Sirop de menthe contenant du bleu patenté V (colorant alimentaire E131) 2.2. Matériel et réactifs fournis 7 fioles jaugées de 20 ml Micro-cuves plastique 1 fiole jaugée de 100 ml 1 fiole jaugée de 250 ml 1 pipette jaugée de 10 ml 1 pipette graduée de 10 ml Spectrophotomètre UV-Visible Libra n 2 Une balance de précision E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.2/25
5 2.3. Généralités Les sirops de menthe disponibles dans le commerce contiennent généralement des colorants alimentaires qui conduisent à la couleur verte prise par le liquide. Le colorant jaune utilisé aujourd'hui est généralement la lutéine (E161b). Celui-ci a remplacé la tartrazine (E102) utilisé autrefois, car celle-ci peut causer des troubles de l'attention et du comportement chez les enfants. Le colorant bleu est quant à lui généralement le bleu brillant FCF (E133) de formule brute C 37 H 34 N 2 Na 2 O 9 S 3 (cf figure 3). Ce colorant est entrain de remplacer le bleu patenté V (E131) de formule brute C 21 H 31 N 2 NaO 7 S 2 qui est aujourd'hui suspecté d'être faiblement cancérogène. Figure 3. Structure moléculaire du bleu brillant FCF Figure 4. Structure moléculaire du bleu patenté V Le but de l'expérience dans cette partie est de déterminer la concentration en bleu patenté V dans un sirop de menthe du commerce. La méthode des ajouts dosés se révèle ici très intéressant en raison de l'extrême complexité de la matrice ainsi que de l'absence d'informations sur celle-ci. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.3/25
6 2.4. Mode opératoire dans le cas de l'utilisation de la méthode de la droite d'étalonnage Préparation des solutions mères S 0 et B 0 F Effectuer une dilution au 1/40 ème en prélevant un volume V 0 de sirop que vous introduirez dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter jusqu'au trait de jauge avec de l'eau distillée. Cette solution sera appelée S 0. F Préparer une solution concentré de bleu patenté de concentration environ exactement C bleu = 0,04 mg.ml -1. Pour cela vous péserez une masse m bleu de bleu patenté que vous introduirez dans une fiole jaugée de 250 ml. Homogénéiser énergiquement à la main, avant de compléter jusqu'au trait de jauge avec de l'eau distillée. F Effectuer une dilution au 1/5 ème dans une fiole de 100 ml. Cette solution sera appelée B 0. On obtient une solution mère S 0 dont vous donnerez le volume V 0 prélevé. Rapport Indiquer la masse pesée m bleu. Pour la seconde préparation, on obtient une solution mère B 0 dont vous donnerez la valeur de la concentration exacte en bleu patenté [B 0 ] Préparation et mesure des solutions filles ainsi que de l étalon de contrôle Méthode de la droite d'étalonnage F Préparer 8 solutions filles de concentration en bleu patenté V par dilutions successives de la solution mère B 0, préparée précédemment. Vous remplirez un tableau du type de celui indiqué ci-dessous : Solutions filles B i Concentration C i (mg.l -1 ) V(B 0 ) (ml) V eau (ml) Blanc : B B 2 0,6 19,4 B B 4 1,6 18,4 B B B B Tableau 1. Récapitulatif des concentrations des solutions B 1 à B 8 et de leur mode de préparation à partir de B 0 E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.4/25
7 F Préparation de l étalon de contrôle : Préparer une fiole CQ de 20 ml, en utilisant V(B 0 ) = 5 ml. Rapport Donner la concentration C ref correspondante Obtention de la droite d'étalonnage F Réaliser le spectre de la solution mère entre 400 et 800 nm, en mode Wavescan pour déterminer la longueur d'onde de travail. Rapport Vous rendrez le spectre correspondant, et vous indiquerez clairement la longueur d'onde de travail. F Réaliser la droite d'étalonnage directement sur le libra n 2 en mode Quantification. Pour cela utiliser la notice fournie directement sur le spectrophotomètre. F Réaliser 2 fois la mesure sur la solution S 0. Imprimer la droite d'étalonnage. Relever la concentration de l étalon de contrôle (inconnue-connue) C EQ et rechercher si la valeur (C EQ ) est comprise dans l intervalle d acceptabilité, soit C ref ± 5 %. Rapport En déduire, grâce à la droite d'étalonnage, les concentration en bleu patenté pour la solution S 0, C 1 et C 2, puis vérifier la compatibilité métrologique en répétabilité des deux essais à l aide de l annexe métrollogique. Donner alors la concentration de bleu patenté dans le sirop. Vous exprimerez le résultat comme indiqué dans l annexe métrologique. Q Pourquoi travaille-t-on exclusivement dans le domaine du visible? Q Quel type de cuve peut-on utiliser pour faire les mesures? Q Indiquer la nature du blanc de mesure. Q Quel est l'intérêt de déterminer la longueur d'onde de travail? E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.5/25
8 2.5. Mode opératoire dans le cas de l'utilisation de la méthode des ajouts dosés Préparation des solutions filles F Préparer 8 solutions filles de concentration croissante en bleu patenté V par ajout successifs connus de la solution mère B 0 à la solution S 0. Vous utiliserez le tableau ci-dessous, pour réaliser les solutions filles : Solutions filles X i Volume V x de S 0 (ml) V s (B 0 ) (ml) V eau (ml) Blanc : X ,0 X 2 10,0 1,2 8,8 X 3 10,0 2,4 7,6 X 4 10,0 3,6 6,4 X 5 10,0 4,8 5,2 X 6 10,0 6,0 4,0 X 7 10,0 7,2 2,8 X 8 10,0 8,4 1,6 Tableau 2. Récapitulatif du mode de préparation des solutions X 1 à X 8 à partir de B 0 et S Méthode des ajouts dosés Réalisation des mesures et obtention de la droite F Réaliser la droite d'étalonnage directement sur le libra n 2 en mode Quantification. Imprimer la droite des ajouts dosés. Rapport Démontrer la relation : C x = b m. C s V x Analyse des résultats Donner les valeurs obtenues pour la pente m et l'ordonnée à l'origine b, avec leur unité convenable. Rapport En déduire, la concentration en bleu patenté V, pour la solution S 0. Donner alors la concentration de bleu patenté V dans le sirop. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.6/25
9 Conclusion et comparaison des résultats Comparer les résultats obtenus dans le cas des deux méthodes utilisées. Rapport Conclure. Q Quel est l'intérêt de la méthode des ajouts dosés? Q méthodes? Le domaine de linéarité est-il important à prendre en compte dans chacune des deux 3. APPLICATION À LA SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENCE 3.1. Produits Sulfate de quinine monohydraté (CAS n ) Solution aqueuse d'acide sulfurique molaire H 2 SO 4 (1 mol.l -1 ) Schweppes 3.2. Matériel et réactifs fournis 6 fioles jaugées de 20 ml 1 cuve 4 faces optiques 2 fioles jaugées de 100 ml 1 P1000 et une pipette jaugée de 4 ml Spectrofluorimètre Shimadzu 1501 Une balance de précision Remarque Les cuves en quartz à quatre faces optiques sont extrêmement fragiles et coûtent très cher. Les manipuler avec le plus grand soin et ne les utiliser que pour le spectrofluorimètre. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.7/25
10 3.3. Généralités Le Schweppes Indian Tonic est une boisson gazeuse rafraîchissante aux extraits d'écorces de Quinquina et d'oranges amères. Il est composé d'eau gazéifiée, de sirop de glucose-fructose, de sucre (8,7 %), d'un acidifiant : l'acide citrique et d'arôme naturel tel que la quinine. La quinine est une molécule organique de formule C 20 H 24 N 2 O 2 (M = 782,94 g.mol -1 ) dont la structure est représentée ci-dessous : Figure 4. Structure moléculaire de la quinine Elle présente des propriétés pharmacologiques (antipyrétique, analgésique et antipaludique). C'est une molécule fluorescente extraite naturellement de l'écorce du Quinquina (arbuste) sous forme d'une poudre blanche. C'est un composant aromatique de l'"eau tonique" (goût amer) présente dans le Schweppes et dans les boissons gazeuses portant la mention "tonic". Ces boissons peuvent contenir jusqu'à 100 mg.l -1 de quinine sans inconvénient pour la santé. En dose excessive, la quinine peut provoquer des problèmes de surdité et même la mort (dans de rare cas). Le maximum de la fluorescence est situé à 450 nm et le domaine de linéarité de l'intensité de fluorescence en fonction de la concentration est compris entre 0 et 6, mol.l -1. Un dosage à l'aide de la méthode de la droite d'étalonnage a permis d'évaluer la teneur en quinine dans le Schweppes à (71 ± 8) mg.l -1. La méthode des ajouts dosés se révèle encore ici très intéressante pour les mêmes raisons que dans le cas du sirop (c'est-à-dire complexité de la matrice et absence d'informations sur celle-ci) Mode opératoire Préparation des solutions mères S 0 et S Sch F Préparer une solution concentré de sulfate de quinine de concentration environ exactement C quinine = 0,1 g.l -1. Pour cela vous péserez une masse m quinine de sulfate de quinine que vous introduirez dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter jusqu'au trait de jauge avec la solution aqueuse de H 2 SO 4 à 1 mol.l -1. F Prélever 600 µl de la solution précédente que vous placerez dans une fiole jaugée de 20 ml. Compléter jusqu'au trait de jauge avec la solution aqueuse de H 2 SO 4 à 1 mol.l -1. Cette solution sera appelée S 0. F Effectuer une dilution au 1/100 ème en prélevant un volume V Sch de Schweppes que vous introduirez dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter jusqu'au trait de jauge avec la solution aqueuse de H 2 SO 4 à 1 mol.l -1. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.8/25
11 Indiquer la masse exacte pesée m quinine. Rapport On obtient une solution mère S 0 dont vous donnerez la concentration [quinine] 0. Pour la seconde préparation, vous donnerez le volume prélevé V Sch de Schweppes Préparation et mesure des solutions filles F Préparer 5 solutions filles de concentration croissante en sulfate de quinine par ajout successifs de volumes connus de la solution mère S 0 à la solution S Sch. Vous utiliserez le tableau ci-dessous, pour réaliser les solutions filles : Solutions filles X i Volume V x de S Sch (ml) V s (S 0 ) (ml) V acide sulfurique (ml) X 1 4,0 0 16,0 X 2 4,0 0,6 15,4 X 3 4,0 1,2 14,8 X 4 4,0 1,8 14,2 X 5 4,0 2,4 13,6 Tableau 3. Récapitulatif du mode de préparation des solutions X 1 à X 5 à partir de S 0 et S Sch F Vous paramètrez le spectrofluorimètre comme indiqué dans la notice technique. F Pour chaque mesure, remplir un tableau sous Excel. Réitérer 3 fois la mesure (cela veut dire, concrêtement, qu'il faut vider et remplir à chaque fois la cuve 4 faces optiques). Q Comment fonctionnent les monochromateurs d'émission et d'excitation dans le cas de l'obtention d'un spectre d'émission? Résultats Rapport Imprimer la droite des ajouts dosés, sous Excel, en choisissant une courbe de tendance affine. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.9/25
12 Donner les valeurs obtenues pour la pente m et l'ordonnée à l'origine b ainsi que leurs écart-types s m et s b. Rapport En déduire, la concentration en quinine pour la solution S Sch, ainsi que son écart-type. Donner alors la concentration de quinine dans le Schweppes, ainsi que son écart-type Conclusion et comparaison des résultats Comparer le résultat obtenu avec celui obtenu par la méthode de la droite d'étalonnage. Rapport Conclure sur la conformité de la quinine dans le Schweppes. 4. CONCLUSION GÉNÉRALE Rapport Conclure sur tous les résultats obtenus. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.10/25
13 5. ÉLÉMENTS DE RÉPONSE AUX QUESTIONS Q Pourquoi travaille-t-on exclusivement dans le domaine du visible? On travaille dans le domaine exclusif du visible, car les solutions à analyser sont colorées. Q Quel type de cuve peut-on utiliser pour faire les mesures? On peut utiliser des cuves en quartz, verre ou plastique, mais pour des raisons économiques, on préférera utiliser des cuves en plastique. Q Indiquer la nature du blanc de mesure. Le blanc de mesure doit être le solvant utiliser pour réaliser les différentes solution, donc dans le cas du bleu brillant, l'eau distillée. Q Quel est l'intérêt de déterminer la longueur d'onde de travail? Il faut effectuer un spectre de l'analyte afin de déterminer la longueur d'onde de travail, c'est-à-dire la longueur d'onde pour laquelle l'absorbance de l'analyte est maximale. Cela permet, d'une part, de travailler au maximum de sensibilité de la méthode d'analyse, d'autre part, les bandes passantes des spectrophotomètres n'étant pas infiniment minces, les écarts à la loi de Beer-Lambert seront minimisés si l'on travaille à cette longueur d'onde. Q Quel est l'intérêt de la méthode des ajouts dosés? Cette méthode constitue une alternative intéressante à la méthode de la droite de calibration afin de déterminer la concentration d'un analyte donné. Celle-ci possède notamment comme avantage la prise en compte des effets matrice (c'est-à-dire du réel milieu environnant de l'analyte). Donc, cette méthode permet de savoir si l'espèce dosée se comporte de la même manière dans le milieu d'analyse et dans la gamme. Q méthodes? Le domaine de linéarité est-il important à prendre en compte dans chacune des deux Il arrive souvent que la relation de linéarité ne soit valable que pour une gamme donnée de concentration. Ainsi, pour de fortes concentrations en analyte, il est fréquent que la relation linéaire ne soit plus vérifiée. L'utilisateur devra donc veiller à se situer dans le domaine de linéarité de la méthode pour l'analyte, généralement en pratique, en diluant les différents étalons, et autres échantillons. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.11/25
14 Q Comment fonctionnent les monochromateurs d'émission et d'excitation dans le cas de l'obtention d'un spectre d'émission? Dans cette opération, le monochromateur d'excitation est fixe et c'est le monochromateur d'émission qui balaye en longueur d'onde. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.12/25
15 TP n 5 : Rapport 6. TP n 5 : RAPPORT D ACTIVITÉ : APPLICATION des AJOUTS DOSÉS à la SPECTROSCOPIE UV-VISIBLE 6.1. Mode opératoire dans le cas de l'utilisation de la méthode de la droite d'étalonnage Préparation des solutions mères S 0 et B 0 On obtient une solution mère S 0 dont vous donnerez le volume V 0 prélevé. Indiquer la masse pesée m bleu. Pour la seconde préparation, on obtient une solution mère B 0 dont vous donnerez la valeur de la concentration exacte en bleu patenté [B 0 ] Préparation et mesure des solutions filles Méthode de la droite d'étalonnage Remplisser le tableau ci-dessous : Solutions filles B i Concentration C i (mg.l -1 ) V(B 0 ) (ml) V eau (ml) B B 2 0,6 19,4 B B 4 1,6 18,4 B B B B Tableau 1. Récapitulatif des concentrations des solutions B 1 à B 8 et de leur mode de préparation à partir de B 0 E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.13/25
16 Obtention de la droite d'étalonnage Indiquer la longueur d'onde de travail : λ bleu patenté = E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.14/25
17 Imprimer la droite d'étalonnage A = f(c) E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.15/25
18 Relever la concentration de l étalon de contrôle (inconnue-connue) C EQ et rechercher si la valeur (C EQ ) est comprise dans l intervalle d acceptabilité, soit C ref ± 5 %. En déduire, grâce à la droite d'étalonnage, les concentration en bleu patenté pour la solution S 0, C 1 et C 2, puis vérifier la compatibilité métrologique en répétabilité des deux essais à l aide de l annexe métrollogique. Donner alors la concentration de bleu patenté dans le sirop. Vous exprimerez le résultat comme indiqué dans l annexe métrologique. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.16/25
19 6.2. Mode opératoire dans le cas de l'utilisation de la méthode des ajouts dosés Méthode des ajouts dosés Réalisation des mesures et obtention de la droite Imprimer la droite des ajouts dosés. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.17/25
20 Démontrer la relation : C x = b m. C s V x Analyse des résultats Rappeler l'équation de modélisation obtenue pour la droite des ajouts dosés, avec le coefficient de corrélation R 2. Donner les valeurs obtenues pour la pente m et l'ordonnée à l'origine b, avec leur unité convenable. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.18/25
21 En déduire, la concentration en bleu patenté pour la solution S 0. Donner alors la concentration de bleu patenté dans le sirop. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.19/25
22 Conclusion et comparaison des résultats Comparer les résultats obtenus dans le cas des deux méthodes utilisées. Conclure. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.20/25
23 7. APPLICATION des AJOUTS DOSÉS à la SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENCE 7.1. Préparation des solution mères S 0 et S Sch On obtient une solution mère S 0 dont vous donnerez la concentration [quinine] 0. Pour la seconde préparation, vous donnerez le facteur de dilution appliquée sur la solution de Schweppes. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.21/25
24 7.2. Résultats Imprimer la droite des ajouts dosés : E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.22/25
25 Donner les valeurs obtenues pour la pente m et l'ordonnée à l'origine b ainsi que leurs écart-types s m et s b. En déduire, la concentration en quinine pour la solution S Sch, ainsi que son écart-type. Donner alors la concentration de quinine dans le Schweppes, ainsi que son écart-type. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.23/25
26 7.3. Conclusion et comparaison des résultats Comparer le résultat obtenu avec celui obtenu par la méthode de la droite d'étalonnage. Conclure sur la conformité de la quinine dans le Schweppes. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.24/25
27 8. CONCLUSION GENERALE Conclure sur tous les résultats obtenus. E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges PARIS Protocole & Rapport 5.25/25
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