Techniques de cytogénétique. G. Quenum, O. Raoul, C. Turleau Laboratoire de cytogénétique Pr. M. Vekemans Necker Enfants malades Novembre 2007

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1 Techniques de cytogénétique Nomenclature G. Quenum, O. Raoul, C. Turleau Laboratoire de cytogénétique Pr. M. Vekemans Necker Enfants malades Novembre 2007

2 Cytogénétique La cytogénétique est l étude du matériel génétique au niveau cellulaire Cette étude est réalisée au microscope optique Le stade d analyse des cellules est généralement la métaphase La taille minimale des remaniements détectés est de l ordre de quelques mégabases La FISH permet d étudier des remaniements inframicroscopiques et/ou de travailler en interphase

3 Cytogénétique étude des chromosomes (de chroma = couleur + soma = corps) outil : le microscope optique (x 1000)

4 HISTORIQUE 1956 Choc hypotonique dispersion des chromosomes 1959 Tri 21, Turner, Klinefelter 1960 Tri 13, Tri 18, Ph 1960 Cultures à court terme de lymphocytes sanguins (MOORHEAD) ère délétion : 5p Marquage en bandes identification de chaque chromosome 1975 Haute résolution 1990 Hybridation in situ

5 Ordre de grandeur Génome haploïde Mb pdb Chr Mb (8,6 %) Chr Mb (1,6%) 1 bande 1 sous-bande 1 gène «moyen» Mb 1-5 Mb pb

6 Anomalies chromosomiques Constitutionnelles, elles entraînent : des échecs de la reproduction des malformations congénitales des retards mentaux des troubles du développement sexuel Acquises, elles sont très fréquentes dans les cancers et les leucémies

7 Constitutionnelles vs.acquises gamète parental [méiose] 1ères divisions du zygote [mitose] somatique et germinale homogène ou mosaïque Formation Répartition tissu différencié [mitose] somatique* clonales tout l organisme limitées à un tissu ou organe stables habituellement simples Type Transmission évolutives (évolutions clonales) souvent complexes transmissibles non transmissibles Association possible des deux types d anomalies : prédisposition génétique à certains cancers (rétinoblastome, cancers colo-rectaux, leucémie et tri 21, etc...)

8 Indications du caryotype Suspicion d un syndrome chromosomique connu Anomalies congénitales multiples Retard mental Suspicion d anomalie de l empreinte Ambiguité sexuelle Syndrome d instabilité chromosomique Parents d un enfant atteint d anomalie chromosomique de structure Couple après 2 fausse-couches ou + Produits d avortement ou Enfants mort-nés Aménorrhée Troubles de la puberté Retard de croissance Indications de diagnostic anténatal Indications hématologiques

9 Cycle cellulaire Le cycle cellulaire comporte deux parties l interphase (18-24h) au cours de laquelle il n y a pas de modification visible du noyau, est divisée en : phase G1(Gap1). phase S (Synthèse). phase G2 (Gap 2). La mitose (1 h). les chromosomes deviennent visibles, la membrane nucléaire disparaît et la structure intérieure de la cellule est remplacée par le fuseau séparation des chromatides-sœurs et migration dans chaque cellule-fille

10 Cycle cellulaire M 1(H) G0 G2 (4H) G1 (10H) S (9H)

11 Mitose La mitose se décompose en prophase prométaphase métaphase anaphase Télophase cytadiérèse Les 46 chromosomes à 2 chromatides se séparent en 2 lots de 46 chromosomes à 1 chromatide. Chaque cellule-fille reçoit un exemplaire de chaque chromatide-sœur. Conservation du complément chromosomique de chaque cellule Le complément chromosomique de chaque cellule tel qu il apparaît à la mitose est appelé caryotype

12 Mitose Condensation de l ADN en chromosome (2 chromatides) Séparation des centrosomes Réplication de l ADN Disparition de l enveloppe nucléaire L enveloppe du noyau se reforme Décondensation des chromosomes Chromosomes condensés, à la plaque équatoriale Séparation des chromatides

13 Caryotype humain Méthodes d étude Les chromosomes ne sont visibles qu au moment de la division cellulaire (métaphase) Certains tissus ont un taux de division spontané suffisant pour une analyse directe : moelle osseuse, villosités choriales, certaines tumeurs, etc Dans la majorité des cas, une culture cellulaire est indispensable

14 Méthodes d étude : 2 approches Cytogénétique moléculaire : FISH (hybridation in situ révélée par fluorescence) complémentaire du caryotype métaphase ou interphase remaniements cryptiques Cytogénétique classique : le caryotype métaphase (prométaphase) analyse des bandes résolution : plusieurs Mb

15 Principaux tissus étudiés en cytogénétique humaine postnatale - sang fibroblastes cutanés hématologique - moelle osseuse - sang (blastes) prénatale - villosités choriales - liquide amniotique - sang fœtal tumorale - tissu tumoral - ganglions - épanchement liquidiens

16 Caryotype sanguin C est la technique la plus simple et la plus utilisée en routine. Cellules étudiées : lymphocytes T transformés par la PHA prélèvement stérile sur héparine de sodium (héparine de lithium et EDTA toxiques) mise en culture 0.5 à 1 ml de sang total/10 ml de milieu de culture + sérum phytohémagglutinine (PHA) 72h de culture à 37 ph 7-7.4

17 Culture de lymphocytes Milieux de culture - permettent la multiplication des cellules - constitués de solution saline, d acides aminés, de vitamines, auquel on ajoute des antibiotiques et du sérum (veau fœtal) - certains sont pauvres en acides folique ou thymidine (sites fragiles) Phytohémagglutinine PHA - M/P/C - extraite du haricot Phaseolus vulgaris - provoque une transformation blastique des lymphocytes T

18 Obtention des mitoses Blocage en métaphase par la colchicine - Inhibe la formation du fuseau, - retarde la séparation des chromatides soeurs - ajoutée 2 heures avant la fin de culture Choc hypotonique - du volume cellulaire, lyse des hématies Fixation des chromosomes - Alcool/ acide acétique (Carnoy) Etalement sur lame Coloration

19 Au microscope : objectif 10x

20 Au microscope : objectif 100x

21 Culture de fibroblastes Indications - Enfants mort-né - Recherche de mosaïque - Lignes de BLASCHKO - Asymétrie corporelle - Reconnaissance d un syndrome connu pour n exister qu en mosaïque (Tri 8 Tetra 12p) Biopsie cutanée - Conservation du prélèvement dans sérum physiologique / milieu de culture Culture - Longue et délicate

22 Caryotype prénatal Liquide amniotique SA ; ml. cellules d origine variée culture de 7 à 15j. récolte in situ ou en suspension Choriocentèse 8-11 SA ; mg. tissus extra-embryonnaires examen direct (cytotropho.) culture (stroma villositaire) ; 7-10 jours. Sang fœtal risque du prélèvement résultat rapide 72 heures

23 Amniocentèse

24 Amniocentèse Réalisée entre 15 et 17 SA 20 ml de liquide stérile, température ambiante types cellulaires : cellules fœtales, cellules de l ectoblaste amniotique, cellules du mésoblaste amniotique, cellules trophoblastiques, cellules maternelles

25 Culture de liquide amniotique 2 méthodes de culture : - en flacons les cellules devront être décollées (trypsinées) - in situ permet l analyse directe des clones résultat plus informatif Milieu sans PHA Durée de culture - estimation selon l aspect des colonies (~2 semaines) Récolte de la culture même principe que pour les lymphocytes Arrêt en métaphase - choc hypotonique fixation - +/- étalement

26 Ponction de villosités choriales Voie transvaginale

27 Culture de villosités choriales Quelques villosités : 10 à 20 mg - Cellules trophoblastiques (ext), cellules mésenchymateuses (int) - Tissu extraembryonnaire Technique directe : cytotrophoblaste - métaphases obtenues à partir des cellules spontanément en division - Résultat dès 24-48H Culture : stroma mésenchymateux - désagrégation mécanique et enzymatique des villosités - cellules mésenchymateuses et fibroblastes, mises en culture - Résultat 10-15j Sortie de culture : - Arrêt en métaphase - choc hypotonique fixation - étalement

28 Evolution des techniques cytogénétiques 1960 Coloration homogène des chromosomes - Caryotype normal - Anomalies de nombre - Anomalies de structure MAIS de grande taille sans indication précise des chromosomes en cause 1970 Bandes chromosomiques métaphasiques - Identification précises des chromosomes - Trisomies et monosomies partielles - Localisation fine par dosage génique 1980 caryotype prométaphasique - Syndromes microdélétionnels - Pathologie du point de cassure 1990 FISH - Remaniements inframicroscopiques

29 Bandes chromosomiques méthodes générales d identification : les bandes sont réparties sur toute la longueur des chromatides bandes Q (quinacrine) bandes G (trypsine/giemsa) bandes R (réverse/chaleur) mise en évidence de structures particulières bandes C (constitutive hétérochromatine) bandes T (terminales) coloration NORs (organisateurs nucléolaires) autres bandes de réplication incorporation de 5-bromodeoxyuridine (5-BrdU)

30 Type Méthode Localisation bandes R dénaturation par la chaleur réparties le long du + coloration au Giemsa chromosome bandes G digestion par la trypsine réparties le long du + coloration au Giemsa chromosome bandes Q coloration fluorescente réparties le long du par la Quinacrine chromosome bandes C dénaturation par BaOH centromères, + coloration au Giemsa constrictions secondaires, Yq bandes T chaleur + Giemsa extrémités chromosomiques bandes de incorporation de BrdU coloration des bandes en réplication + coloration FPG fonction de leur moment de réplication

31 Coloration Giemsa standard Coloration : - Giemsa à 3% eau distillée tamponnée ph 6,7 pendant 10 - Rinçage à l eau du robinet Observation - Lumière ordinaire - 2 objectifs : 10 chercher les mitoses à immersion analyse Résultats - Chromosomes bien colorés(euchromatine/hétérochromatine) - Classification en groupes (A/B/C/D/E/F/G) - bras courts des acrocentriques, constriction IIiaires (1,9,16), bras long Y

32 Coloration Giemsa standard

33 Bandes chromosomiques-i. méthodes générales d identification : bandes Q (quinacrine) bandes G (trypsine/giemsa) bandes R (réverse/chaleur) ces bandes sont réparties sur toute la longueur des chromatides

34 Bandes chromosomiques Extrémités : bandes T Hétérochromatine constitutive : bandes C Organisateurs nucléolaires : Nors Euchromatine : bandes G /Q bandes R b. de réplication Acrocentriques

35 Bandes R Technique - Dénaturation thermique ménagée (Dutrillaux Lejeune 1971) Earle ph 6,5 à 87 c Temps variable ( ) selon âge des lames - Coloration Giemsa - Observation Contraste de phase 100 à immersion Résultats - Alternance bandes claires et sombres - Constriction Iaires non colorées - Bras courts acrocentriques et extrémité de l Y peuvent être colorés (marqueurs)

36 Bandes R

37 Bandes G Technique - Dénaturation par la trypsine (Dutrillaux et col. Seabright) Lames dans solution de trypsine 3-30 selon l âge des lames Rinçage dans PBS (Phosphate Buffered Saline) - Coloration au Giemsa Résultats - Alternance de bandes claires et sombres (inverse des bandes R) - Reconnaissance individuelle des chromosomes - Régions hétérochromatiques variables

38 Bandes G

39 Technique Bandes Q - Coloration solution de quinacrine 20 - Rinçage tampon phosphate - Montage tampon phosphate Observation - Lumière U.V. Résultats - Alternance de bandes claires et sombres, identiques aux bandes G (différences pour l hétérochromatine) - Centromère du 3 parfois du 4 - Certains bras courts d acrocentriques - Surtout bras long de l Y

40 Bandes Q