I. La levure Saccharomyces cerevisiae: mode de vie

Transcription

1 LES LEVURES

2 UE «levures» -5 avril: généralités (MN Simon) -6 avril: analyse génétique (MN Simon) -6 avril: Cycle cellulaire I: la réplication (E. bailly) -7 avril: Cycle cellulaire II: la mitose (E. Bailly) -8 avril: les analyses systématiques (MN Simon) -25 avril: Cycle cellulaire III: régulation par protéolyse (E. Bailly) -26 Avril: TD I (R Eluere) -27 avril: la transmission des signaux (MN Simon) -28 avril: TD II (R. Eluere) -29 avril: les mécanismes de contrôle (E. Bailly) -29 avril: séminaire recherche (Y. Corda) -2 mai: séminaire recherche (MN Simon) -3 mai: séminaire recherche (E. Bailly)

3 I. La levure Saccharomyces cerevisiae: mode de vie Les levures vivent sur les fruits, les fleurs et autres sources contenant des sucres. Les levures survivent à un large spectre de type environementaux: Gamme de tolérance de température: de 0 à 55 C Température de prolifération: de 12 à 40 C Tolérance au ph: croissance possible de ph Tolérance presque complète vis à vis de la déssication (levures sèches) Tolérance vis à vis de la pression osmotique: les levures peuvent pousser et fermenter jusquà des concentrations en sucre de l ordre de 3M. Tolérance alcoolique: jusqu à 20% d alcool.

4 La levure Saccharomyces cerevisiae: utilisations - Saccharomyces cerevisiae est la principale levure pour la production vinicole (forte capacité de fermentation, tolérance au faible ph et aux hauts niveaux d alcool) - Saccharomyces cerevisiae est la levure de bière (fermente en présence d oxygène) - Saccharomyces cerevisiae est la levure de boulanger (production rapide de dioxide de carbone à partir de sucres) - Outil biotechnologique pour le production de protéines d intéret commercial - Outil de criblage de nouveaux médicaments - C est un des principaux modèles cellulaires eucaryotes en recherche fondamentale du fait de la performance des outils génétiques et de biologie moléculaire et cellulaire qui y ont été développés.

5 Les autres levures d intéret Schizosaccharomyces pombe: autre levure modèle en biologie moléculaire et cellulaire Kluyveromyces lactis: la levure du lait est utilisé comme modèle pour des applications biotechnologiques Candida albicans: étudiée en tant que pathogène de l homme. Saccharomyces carlsbergensis and Saccharomyces bayanus sont proches de S. cerevisiae. éspèces d intéret vinicole. Pichia stipidis, Hansenula polymorpha, Yarrovia lipolytica sont énormément utilisés pour la production de protéines hétérologues. Champignons filamenteux constituent un large groupe de modèles génétiques (Cryptococcus, Aspergillus, Neurospora...). Ce groupe inclus certains pathogènes de l homme.

6 Saccharomyces cerevisiae -S. cerevisiae se divise par bourgeonnement. taille 4-7 mm Le bourgeonnement résulte dans la formation de deux cellules de taille inégale. -Le cycle de vie n est pas indéfini. Les cellules mères vieillissent puis meurent (la durée de vie moyenne est de 30 à 40 divisions) -Les cellules ont une structure de type eucaryote avec: une paroi de glucan, mannan, protéines un espace périplasmique une membrane en bicouche lipidique un noyau avec un nucléole des vacuoles un appareil de sécrétion (RE, golgi, vésicules de sécrétion) des mitochondries...

7 Matériel génétique de S. cerevisiae Le génome de S. cerevisiae contient 16 chromosomes + de l ADN mitochondrial et un plasmide (2m). Les chromosomes contiennent des centromères et des télomères, plus simples que ceux des eucaryotes supérieurs. Le génome de S. cerevisiae a été le premier génome eucaryote séquencé dans sa totalité (1996).

8 Le génome de S. cerevisiae contient environ 6,200 genes. A peu près 1/3 des gènes ont été caracterisés par des analyses génétiques, 1/3 présentent des homologies permettant la détermination de leur fonction et 1/3 ne sont homologues à aucun gène connu.

9 II. NOMENCLATURE Le nom des gènes de levure contient 3 lettres et jusqu à 3 chiffres:gpd1, HSP12, PDC6...Ces 3 lettres ont souvent une signification, liée à la fonction du gène Le gène sauvage est écrit en majuscule et en italique: TPS1, RHO1, CDC28... Les gènes portant une mutation récessive sont écrits en minuscule et en italique: tps1, rho1, cdc28 Les allèles mutants sont réprésentés par un tiret et un nombre : tps1-1, rho1-23, cdc28-2 Le produit d un gène est écrit avec une lettre majuscule suivie de deux minuscules. sans italique. un p est souvent ajouté à la fin. Tps1p, Rho1p, Cdc28p Beaucoup de gènes ont été identifiés lors du séquençage du génome et restent sans fonction connue. Ils sont nommés YDR518C, YML016W..., avec: Y pour yeast La deuxième lettre désigne le chromosome (D=IV, M=XIII...) L ou R désigne le bras droit (Right) ou gauche (Left) du chromosome. Les trois chiffres correspondent au n de l ORF compté à partir du centromère. C or-c et W disent sur l ORF est transcrite sur le brin Crick or Watson Comme pour toute règle, il existe quelques exceptions: HO, MAT...

10 III. Cycle de vie des levures Budding Yeast Fission Yeast

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12 IV. Le bourgeonnement Bourgeonnement axial (cellules haploïdes) Bourgeonnement bipolaire (cellules diploïdes) F M F M F M

13 Le bourgeonnement correspond à une polarisation de la croissance cellulaire et à un partage des organelles entre les deux compartiments cellulaires (la cellule mère et le bourgeon). Cette polarisation est liée à une réorganisation du cytosquelette d actine. Myo2 câbles d actine vacuole noyau CAP ASH1 mrna mitochondries Réseau de septines myo4

14 La mise en place du bourgeon est sous la dépendance d une petite G protéine de la famille des RHO: Cdc42. cdc42-1 Cdc42 fluctue entre deux formes: liée au GDP (inactif) ou liée au GTP (actif). Cdc42 est activé par un Guanosine Exchange Factor, Cdc24 et inactivé par des GTPase Activating Protein, Rga1-Bem3 et Bem2. Cdc24 Cdc42 GDP GAP: Rga1, Bem3, Bem2 Cdc42 GTP

15 Le complexe de polarisation est recruté à la membrane via l interaction entre Cdc24 et le marqueur de site Rsr1. Rsr1 est aussi un activateur de Cdc24. Le complexe de polarisation est stabilisé au site de croissance par deux mécanismes: le recrutement de la protéine Bem1 par la forme Cdc42-GTP et la stabilisation de la forme Cdc24 active par une interaction Cdc24/Bem1. Rsr1 Cdc24 Cdc24 Cdc42 GDP Bem1 GAP: Rga1, Bem3, Bem2 Cdc42 GTP Cdc42-GTP active un certain nombre d effecteurs PAK: Cla4, Ste20 Bni1 Gic1,2 exocyst organisation de l actine nucléation de l actine Stabilisation du complexe fusion des vésicules de sécrétion

16 Mise en place du site de pré-bourgeonnement et croissance du bourgeon Marqueurs spécifiques de site Marqueurs Généraux Rsr1 Cdc24 Bem1 Cdc42 Bem3 Rga1 Polarisome Cla4/Ste20 Membrane plasmique Rsr1: petite G protéine (famille des Ras) Cdc42: p21 GTPase (famille des Rho) Cdc24: Guanosine exchange factor de Cdc42 Rga1,Bem3: GTPase activating protein Ste20/Cla4: PAK ( p21 Activated protein Kinases) Polarisome: Bni1, Spa2, Bud6, Pea2 septines

17 Le même type de polarisation se met en place lors de la conjugaison shmooing bourgeonnement

18 Les cellules de type sexuel opposé peuvent conjuguer prolifération des haploïdes arrêt du cycle et «shmooing» zygote: fusion cellulaire et nucléaire bourgeonnement du zygote sporulation Les cellules présentent donc un certain niveau de spécialisation: pour la conjugaison (cellules haploïdes) ou pour la méiose et la sporulation (cellules diploïdes)

19 V. La conjugaison Les cellules haploïdes émettent des phéromones (facteurs a ou a) détectées par les cellules de type sexuel opposé grâce à des récepteurs spécifiques. Les phéromones induisent un arrêt du cycle cellulaire et des transcriptions spécifiques La fusion cellulaire et nucléaire des deux cellules haploïdes aboutit à la formation d une cellule diploïde

20 Yeast sexual cycle fusion nucléaire fusion cellulaire Attachement des cellules

21 VI. DETERMINATION DU TYPE SEXUEL Les différences entre les types cellulaires sont déterminées par le locus MAT (mating-type locus) MAT est situé au milieu du chromosome III. les cellules exprimant l allèle MATa ont un phénotype a les cellules exprimant l allèle MATa ont un phénotype a les cellules exprimant les deux allèles ont un phénotype diploïde. Les deux allèles codent pour des protéines qui régulent l expression de sets de gènes spécialisés. Les produits du locus MAT sont au sommet d une cascade qui spécifie la différenciation des cellules.

22 Le locus MAT Le locus MAT peut coder pour trois protéines régulatrices: - a1 est codée par l allèle MATa - a1 et a2 sont codées par l allèle MATa

23 Données génétiques sur les cellules haploïdes. Les mutations dans a1 empêchent l expression des gènes a spécifiques: le facteur a1 est un régulateur positif des gènes a spécifiques. Les mutations dans a2 entraînent l expression des gènes a spécifiques dans les cellules a : le facteur a2 est un régulateur négatif des gènes a spécifiques. Les mutations dans a1 sont sans effet sur les cellules haploïdes de type a: les gènes de type a sont donc exprimés du fait de l absence du régulateur négatif a2

24 cellules haploïdes de type a gènes a gènes a gènes haploïdes spécifiques Les facteurs Mata1p et Mata2p sont produits Mata1p active les gènes spécifiques du type a. Mata2p réprime les gènes spécifiques du type a. Les gènes spécifiques des cellules haploïdes sont exprimés.

25 cellules haploïdes de type a Le facteur Mata1p est produit les gènes spécifiques du type a et les gènes spécifiques des cellules haploïdes sont exprimés du fait de l absence de a2 les gènes spécifiques du type a ne sont pas induits du fait de l absence de a1

26 cellules diploïdes a/a - Les deux locus sont présents dans la cellule - le facteur a2p réprime l expression des gènes a-specific - les protéines a1 et a2 forme un nouveau facteur qui réprime l expression des gènes haploïdes-spécifiques et l expression du gène a1 - les gènes a-specific ne sont pas exprimés du fait de l absence de a1

27 Mcm1, un co-facteur important MCM1 est nécessaire au contrôle de l expression du locus MAT. MCM1 est exprimé dans tous les types cellulaires. La protéine Mcm1 se lie aux sites régulateurs des gènes a et a-spécifiques et est un régulateur positif des deux types de gènes. Mcm1 peut se lier aux séquences régulatrices a mais doit former un dimère avec a1pour se lier aux séquences régulatrices des gènes a spécifiques.

28 cellules haploïdes de type a Mcm1 induit l expression des gènes a-spécifiques et haploïdes spécifiques

29 cellules haploïdes de type a Les facteurs Mata1p et Mata2p sont produits Mata1p + Mcm1p activent les gènes a-spécifiques Mata2p + Mcm1p répriment les gènes a-spécifiques Mcm1p induit l expression des gènes haploïde-spécifiques

30 cellules diploides a/a Mata2 + Mcm1 repriment les gènes a-spécifiques Mata1 + Mata2 repriment les gènes haploide-specifiques et MATa1 Mata1 n est pas présent pour activater les gènes a- specifiques

31 VII.Changement de type sexuel Les souches de laboratoire sont stables sous forme haploïde (a ou a). Dans la nature, S. cerevisiae n existe que de façon transitoire sous forme haploïde. Une souche naturelle amenée au laboratoire peut être induite à sporuler (carence en azote). Les spores isolés vont donner naissance à une population de cellules haploïdes. Cependant, on observera rapidement l apparition spontanée de cellules diploïdes La différence entre les souches naturelles et de laboratoire tient à une mutation dans un seul gène: HO (pour homothallisme).

32 Changement de type sexuel Le changement de type sexuel est lié à un réarrangement chromosomique programmé. Au cours de ce processus, une cellule haploïde va se diviser puis la cellule mère va changer de type sexuel. Deux cellules de type sexuel opposé sont donc générées. Le cycle de division cellulaire des haploïdes donne donc naissance à deux cellules capables de conjuguer.

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34 Changement de type sexuel Les analyses génétiques ont identifié trois zones sur le chromosome III: - Le locus MAT localisé au centre du chromosome. - Les locus HML et HMR (pour hidden MAT Right and Left ). HML (left arm) contient une copie silencieuse de MATa. HMR (right arm) contient une copie silencieuse de MATa.

35 Conversion génique au locus MAT Au cours du changement de type sexuel, l information au locus MAT est remplacée par l information des locus HMR ou HML. L échange d informations entre les locus MAT et HM n est pas réciproque. Cet échange d information correpond à une conversion gènique et est initié par une endonucléase spécifique d un site proche du locus MAT. Cette endonucléase est le produit du gène HO.

36 le type sexuel ( mating type ) est déterminé par l allèle (a or a) porté par le locus MAT. L allèle mating type specific (a or a) est introduit au locus MAT par recombinaison. Une copie silencieuse (non transcrite) de chaque allèle est stockée au niveau de HMLa et HMRa

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38 Transcriptional silencing Comment les locus HMLa et HMRa sont ils maintenus transcriptionellement silencieux? La structure de la chromatine autour de HMLa et HMRa est condensée (heterochromatine) Les histones sont déacetylées l ensemble bloque l accès à la machinerie de transcription.

39 Silent Information Regulator (SIR) proteins Active both at HML and HMR and telomeres Origin Recognition Complex (ORC) Has several roles in initiating DNA replication and coordinating replication and transcription Origins are active on plasmids but not on the chromosome Transcription Factors Rap1p and Abf1p

40 SPÉCIFICITÉ MATERNELLE DU CHANGEMENT DE TYPE SEXUEL -L endonucléase HO n est produite que dans la cellule mère -l expression du gène HO est réprimé dans la cellule fille par le répresseur transcriptionnel Ash1 -l ARNm codant pour Ash1 est spécifiquement transporté dans le bourgeon pendant l anaphase Darzacq et al.curr.opin. Microbiol. 2003

41 L ARNm de ASH1 contient 4 «zipcodes» reconnus par une RNA-binding protein She2. She2 s associe via She3 à She1/Myo4, une protéine myosinlike qui fournit la force motrice pour le transport le long des fibres d actine.

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43 Pourquoi les cellules diploïdes sporulent-elles? -Dans la nature, les levures prolifèrent sous forme diploïde (plus résistante), alors pourquoi le sporulation? - les spores sont une forme de résistance aux conditions extrèmes - la sporulation est un moyen de protéger le génome contre l accumulation de mutations. - la méiose est un moyen de créer de nouvelles combinaisons d allèles éventuellement avantageuses -Pourquoi le changement de type sexuel à chaque génération: - Si une seule spore de la tétrade survie, il peut y avoir conjugaison entre la cellule mère et la cellule fille après la première division.