Validation d'une méthode pour les isoagglutinines en gel

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1 Travail de diplôme Validation d'une méthode pour les isoagglutinines en gel Carole Jaccoud ESSanté, 53 ème volée CHUV, Unité de Médecine Transfusionnelle Stage en immunohématologie du au Responsable accompagnante : Mme Sandrine Bouquet

2 Résumé Le groupage ABO repose sur la détermination des antigènes (A et/ou B) et des anticorps (les isoagglutinines) de ce système. Ces analyses s appellent l épreuve globulaire et l épreuve sérique et elles peuvent être faites avec une méthode en tube ou en carte. À ce jour, l effectue le groupage en tube et en carte pour l épreuve globulaire mais seule la méthode en tube est réalisée pour l épreuve sérique. Afin de valider une méthode pour déterminer les isoagglutinines en carte j ai comparé des hématies-tests commerciales avec des hématies-tests provenant de donneurs de sang en testant le plasma d environ 200 patients. Après études des résultats obtenus et des coûts, la méthode sera introduite avec des hématies-tests diluées manuellement dans une solution isotonique. Abstract The ABO blood typing is based on the determination of antigens (A and B) and antibodies of this system, isoagglutinins. These tests are named forward and reverse blood grouping and can be made in tube or gel card method. To date, the performs the forward grouping test in tube and gel card but the reverse grouping test is carried out only in tube. To validate the isoagglutinins in gel card, I compared commercial red blood cells with donors red blood cells testing the plasma of about 200 patients. After studies of outcomes and costs, the method will be introduced with manually diluted red blood cells in an isotonic solution. 2

3 1 Table des matières Résumé... 2 Abstract Introduction Présentation de l' Rappels théoriques Antigènes érythrocytaires Anticorps Système ABO Forces d'agglutinations But Matériel et méthodes Matériel Méthodes Dilutions Méthode en tube Méthode en carte Méthode Erytra Coûts Hématies-tests faites «maison»: Hématies-tests diluées dans de l'immusol: Hématies-tests diluées dans du Diluent2: Hématies-tests commerciales : Hématies GRIFOLS: Hématies BIORAD: Discussion

4 6 Résultats Présentation Discussion Résultats discordants ou très faibles: Isoagglutinines faibles ou avec une différence 2 intensités selon la technique: Résultats entre ++ et +++: Résultats très faibles ((+) ou +) et avec une différence 2 intensités: Synthèse des résultats: Conclusion Remerciements Bibliographie Lexique Annexes B.L des concentrés érythrocytaires utilisés: Résultats bruts :

5 2 Introduction Ce travail de diplôme s'est déroulé dans le cadre de mon stage au CHUV à l'unité de Médecine Transfusionnelle (). En Suisse, il y a 13 Services Régionaux de Transfusion Sanguine (SRTS) dont le SRTS VD, duquel dépend l'. Ainsi, ce laboratoire a à sa charge toutes les analyses d'immunohématologie du CHUV, et reçoit également les analyses de laboratoires externes qu'ils ne sont pas en mesure d'effectuer. Les prescriptions et recommandations pour la transfusion de produits sanguins labiles (PSL) sont éditées par Transfusion CRS Suisse (T-CH CRS) et de l'institut Swissmedic. ( 1 ) 2.1 Présentation de l' L' est divisée en deux laboratoires: un laboratoire de routine (local 511) et un laboratoire d'urgences (local 604). Le laboratoire des urgences prend en charge toutes les analyses des services des soins intensifs, des urgences, les déchocages, les analyses externes urgentes, les consultations ambulatoires nécessitant des transfusions et également toutes les commandes de PSL sans tube (concentrés érythrocytaires dont les tests prétransfusionnels sont valables, concentrés plaquettaires, plasmas frais congelés et commandes externes de PSL nominatifs ou non). Le laboratoire de routine effectue les analyses qui ne sont pas urgentes, comme les suivis de grossesse, les commandes de sang pour le programme opératoire du lendemain et pour les externes ainsi que les demandes d'analyses des autres services du CHUV que ceux susmentionnés. Le laboratoire du 604 est ouvert 24 heures sur 24 et 7 jours sur 7, ce qui nécessite un tournus de garde avec la présence de deux techniciennes, tandis que le laboratoire du 511 est ouvert de 7h00 à 15h30, du lundi au vendredi. 2.2 Rappels théoriques Antigènes érythrocytaires Les antigènes de la membrane érythrocytaire sont formés d'hydrates de carbone et de protéines, liées ou non à des lipides ou des sucres. Les protéines sont directement codées par un gène et les sucres sont produits par des enzymes. Par définition, un antigène est une molécule capable de former un complexe antigène-anticorps de manière spécifique dans le cadre d'une réaction immune. ( 1 ) 5

6 2.2.2 Anticorps Les anticorps, ou immunoglobulines, sont des protéines produites par les lymphocytes B, suite à une exposition à un antigène absent de l'organisme (anticorps immuns). Il existe plusieurs classes d'immunoglobulines: les IgG, IgD, IgE, IgA et les IgM. Les IgG, IgD et les IgE ont la même structure sous forme de deux chaînes lourdes, constituées d'une partie variable et de plusieurs parties constantes, et deux chaînes légères, comportant une partie constante et une partie variable. Les IgA ont une structure très proche de celle des IgG. Quant aux IgM, ce sont des pentamères. Pour les anticorps anti-érythrocytaires, on s'intéresse principalement aux IgG et aux IgM. Les IgG réagissent de préférence à 37 C et en milieu Coombs indirect ou enzymatique, alors que les IgM réagissent très fortement à 4 C ou à 22 C. Les IgM réagissant à 37 C ou en milieu Coombs indirect sont des IgM dits à large spectre thermique. ( 1 ) Système ABO Généralités Le système ABO est le plus connu et le premier respecté pour toute transfusion sanguine de concentré érythrocytaire ou de PFC. Etant un système tissulaire, il est présent sur de nombreuses cellules, ce qui le rend aussi important pour les transplantations. Il peut aussi être présent dans certains fluides corporels, notamment la salive. C'est un système glucidique qui nécessite l'action d'enzymes codées par un gène du chromosome 9. Il y a trois types de gènes, A, B et O, déclinés en nombreux allèles qui codent soit pour une enzyme A, une enzyme B ou sont non codants. Ces allèles donnent lieu à quatre groupes sanguins; A, B, AB et O, A et B étant codominants, et O étant récessif. Sous l'action de l'enzyme A et/ou B, le substrat est transformé en antigène A et/ou B par ajout d'un sucre spécifique. S'il n'y a pas d'activité enzymatique, ce substrat, la substance H de type 2, reste intacte, ce qui correspond à un individu de groupe O. L'enzyme A est une N-acétylgalactosamine transférase, qui ajoute une N- acétylgalactosamine, et l'enzyme B est une D-galactose transférase, qui ajoute un D-galactose sur la substance H de type 2, en position sub-terminale. ( 1 ) Si ce système est aussi primordial à respecter en transfusion, c'est parce que, contrairement aux autres systèmes, l'absence d'un antigène induit naturellement et systématiquement un anticorps contre celui-ci. Ainsi, un individu A développera après quelques mois de vie des anticorps anti-b, et inversement pour un individu de groupe B. Les individus de groupe O développeront à la fois des anti-a, des anti-b, et des anti-ab puisqu'ils n'ont aucun des antigènes, quant aux personnes AB, elles n auront pas d'anticorps relatifs à ce système. Ces anticorps sont appelés anticorps naturels réguliers, hétéroanticorps réguliers ou isoagglutinines. ( 1 ) 6

7 Ces isoagglutinines sont donc présentes chez tous les individus de groupe A, B ou O et se développent après 3 à 6 mois de vie extra-utérine car les antigènes A et B sont présents dans l'environnement et sur les bactéries du tube digestif. Elles sont principalement de type IgM mais sont constituées aussi d'une petite quantité d'iga et d'igg. Ces IgM sont capables d'activer le complément et ont un large spectre thermique, expliquant ainsi leur dangerosité transfusionnelle. ( 1 ) Détermination de groupe La détermination du groupe ABO se fait à l'aide de deux tests: l'épreuve globulaire (test de Beth-Vincent) et l'épreuve sérique (test de Simonin). L'épreuve globulaire fait réagir les érythrocytes du patient avec des anti-séra anti-a et anti-b alors que l'épreuve sérique fait réagir le plasma du patient avec des hématies-tests A, B et O. Ces deux techniques permettent de mettre en évidence d'une part les antigènes présents sur les hématies (épreuve globulaire) et d'autre part les hétéroanticorps correspondants aux antigènes absents (épreuve sérique). Pour valider un résultat de groupe ABO, il faut une concordance entre ces deux épreuves. Par ailleurs, à l'épreuve sérique, l'hématie-test O fait office de contrôle négatif, puisqu'elle ne présente pas les antigènes A et/ou B à sa surface. Pour les groupes qui sont connus, la comparaison avec les résultats antécédents fait office de contrôle de la technique et des réactifs. ( 2 ) Lors d'une discordance ABO, il est tout d'abord important de reprendre le tube primaire afin de vérifier que l échantillon corresponde au bon patient et que les tubes décantés soient issus du même tube. Si l échantillon a été identifié correctement, on peut alors suspecter une erreur de technique; à ce stade il est impératif de répéter l'analyse en respectant le protocole d'analyses. Les temps d'incubation et de centrifugation peuvent aboutir à un résultat faussement positif ou négatif. Les concentrations sont également importantes à respecter pour éviter les effets prozone et postzone qui donneraient un résultat faussement négatif. Quant à la présence de fibrine, celle-ci aboutirait aussi à un résultat faussement positif. ( 3 ) Il y a par contre d'autres facteurs de discordance qui ne dépendent pas de la technique, comme une contamination bactérienne, la présence d'agglutinines froides et de rouleaux érythrocytaires, ainsi que l'affaiblissement des antigènes ou des anticorps ( 3 p. 4). C'est le cas pour certains sous-groupes du système ABO, dont les antigènes affaiblis ne réagissent pas avec les anti-séra, ou qui peuvent développer des anticorps contre ces antigènes affaiblis ( 1 p.49-50). Quant aux anticorps affaiblis, cela peut être physiologique en raison du vieillissement du système immunitaire ou chez les nouveau-nés, ou acquis en cas d'immunosuppression. Une autre situation rencontrée est la discordance suite à une allogreffe. En effet, suite à une allogreffe non isogroupe, le receveur acquiert le groupe globulaire du donneur alors que les isoagglutinines seront celles communes aux groupes du donneur et du receveur. Il est également fréquent que ces patients allogreffés présentent une double population érythrocytaire aux résultats des tests. En cas d allogreffe ABO incompatible, le groupe peut être ininterprétable et les recommandations pour la transfusion de PSL sont établies par les médecins de l'. ( 4 ) 7

8 2.3 Forces d'agglutinations Une des difficultés de ce travail porte sur la standardisation de la quantification des agglutinines, tant en tube qu'en carte. Il existe des critères décrits par l'aabb (American Association of Blood Banks) ( 1 ): Résultat négatif: Résultat faible (+): Résultat + : Résultat ++ : Résultat +++ : Résultat ++++ : "Absence d'agglutination en tube. En gel-test, toutes les hématies sont au fond du microtube." "Minuscules agglutinats, visibles seulement microscopiquement, surnageant trouble-rosé. En gel-test, quelques agglutinats sont visibles au dessus du culot d'hématies au fond du microtube." "Petits agglutinats, juste visibles macroscopiquement, nombreuses cellules libres surnageant trouble-rosé. En gel-test, les hématies sont agglutinées à l'intérieur et au fond du gel." "Agglutinats de taille moyenne, quelques hématies libres, surnageant clair. En gel-test, les hématies sont agglutinées à l'intérieur du gel." "Plusieurs agglutinats de grande taille, peu d'hématies libres, surnageant clair. En gel-test, les hématies sont agglutinées à la surface du gel, et pénètrent partiellement à l'intérieur de celuici." "Un agglutinat solide, sans hématie libre, surnageant clair. En gel-test, toutes les hématies sont agglutinées à la surface du gel." Cependant, dans la pratique, il arrive qu'un résultat soit intermédiaire, et la quantification peut varier d une personne à l autre car elle dépend de l'appréciation du technicien. En plus des résultats qui sont interprétés comme négatifs ou positifs, il peut arriver qu'il y ait une doublepopulation. Ces doubles-populations peuvent être dues à la présence de deux populations d'érythrocytes de groupes différents par exemple en cas de transfusion d un patient A avec des hématies O, une partie des hématies réagiront positivement avec l'anti-a et une autre négativement au groupe globulaire. Cependant ces doublespopulations peuvent aussi être dues à des artéfacts, en présence de fibrine ou d'hyper-protéinémie. La fibrine peut être éliminée en centrifugeant le plasma plus longtemps et à vitesse rapide. 8

9 Voici des photos et images des différentes forces d'agglutinations en carte et en tube: Tubes Résultat: négatif Cartes Résultat: négatif (+) (+) 9

10 Résultats à + Résultats à ++ Résultats à +++ Résultat à

11 Double-population à l épreuve sérique : Exemples de résultats non interprétables en raison de présence de fibrine (à gauche, double populations dans les puits A 1 et O, à droite double population dans le puits O, qui doit être un contrôle négatif.) 3 But Le but de ce travail est de valider une méthode permettant de déterminer les isoagglutinines des patients en carte. Selon les prescriptions de T-CH CRS, la première détermination de groupe d'un patient doit être complète (épreuve globulaire et plasmatique) et effectuée par deux techniciens différents, ou par un seul en contrôlant le groupe une deuxième fois (nouvelles suspensions ou autre méthode). ( 5 ) À ce jour, le laboratoire de l' détermine le premier groupe des patients en effectuant une épreuve globulaire et plasmatique en tube, mais en carte, seule l'épreuve globulaire est faite. C'est pourquoi il m'a été demandé, dans le cadre de mon travail de diplôme, de comparer plusieurs hématies-tests pour la méthode en gel afin d'introduire et de valider cette méthode dans la routine des analyses. Afin que la comparaison soit cohérente, toutes les analyses ont été effectuées dans les mêmes conditions (volumes, temps d'incubation, centrifugation). 11

12 4 Matériel et méthodes 4.1 Matériel Plasmas: Plasmas frais de 0 à trois jours, conservés à 4 C et anti coagulés à l'edta En accord avec le médecin responsable et la TAB responsable du laboratoire, j'ai comparé au moins 50 tubes de chaque groupe A, B, AB et O. Chaque prélèvement était issu de prises différentes, cependant il est possible qu'un patient ait été pris en compte plus d'une fois. J'ai volontairement pris parmi les échantillons des patients susceptibles de poser un problème de groupe ABO, notamment des patients de plus de 80 ans, des allogreffés et des patients d'oncologie ou en isolement car ces sujets sont souvent immunosupprimés. Il aurait été intéressant d'essayer de déterminer en carte les isoagglutinines de jeunes patients de trois à six mois, mais les rares cas rencontrés n'avaient pas assez de matériel pour pouvoir être comparé avec toutes les techniques. Pour chaque échantillon, j'ai effectué six fois la détermination des isoagglutinines, avec 3 méthodes différentes: en tube, en carte et sur l'automate Erytra. La méthode en carte a été testée avec quatre hématies-tests différentes. En prenant des poches de concentrés érythrocytaires, j'ai réalisé deux séries de dilutions à 0.8%: l'une dans du Diluent-2 et l'autre dans de l'immusol. J'ai également utilisé des hématies-tests commerciales de Grifols et de Biorad. Par ailleurs, après avoir rencontré quelques problèmes d'interprétation dus à la présence de fibrine, j'ai décidé de centrifuger systématiquement les plasmas 5 minutes à 4500 tours/minutes. Hématies-tests GRIFOLS & BIORAD: Hématies-tests A 1, B, O prêtes à l'emploi pour la recherche des isoagglutinines, diluées à 0.8%. Ces solutions contiennent des tampons et des antibiotiques. Elles se conservent à 4 C. GRIFOLS: lot: exp: lot: exp: BIORAD: lot: exp: Poches de concentrés érythrocytaires A1, B, O: Poches de concentrés érythrocytaires du stock de l'. Elles sont utilisées pour préparer les hématies-tests en méthode manuelle. J'ai utilisé deux séries durant ma partie pratique. Ces poches sont stockées dans la chambre froide ou au réfrigérateur à 4 C, jusqu'à leur péremption. 12

13 1) A- : don H X exp: B+ : don H exp: O+ : don H I exp: ) A+ : don H Q exp: B+ : don H exp: O- : don H L exp: Immusol Préparation concentrée pour solution isotonique NaCl 0.9%, conservation à température ambiante. Une bouteille de 500 ml convient à préparer 10 litres de solution isotonique. lot: exp: ID-Diluent 2: Solution de la marque BIORAD servant à diluer les érythrocytes pour les analyses immunohématologiques en carte. Conservation à 4 C. lot: exp: lot: exp: Cartes neutres BIORAD: Cartes gel neutres pour la recherche d'isoagglutinines. Conservation à température ambiante lot: exp: lot: exp: Erytra Automate d'immunohématologie de chez Médion GRIFOLS, Diagnostics AG. 13

14 4.2 Méthodes Dilutions Toutes les analyses en tubes se font avec des hématies-tests diluées à 3% dans une solution isotonique de chlorure de sodium, dite "solution framboise", alors que les analyses en carte se font généralement avec des dilutions à 0.8%. Pour la dilution à 3%, j'ai procédé de la manière suivante: - Distribuer quelques gouttes d'hématies A 1, B et O de concentrés érythrocytaires dans des tubes en verre. - Laver 1x dans du NaCl 0.9% en centrifugeant 1min. à 2500 tours/min. - Décanter. - Pipeter 150 μl d'érythrocytes lavés et ajouter 4850 μl de NaCl 0.9%. Comme dit précédemment, j'ai également dilué des hématies manuellement pour la méthode en carte, dans une solution isotonique d'une part, et dans du Diluent-2 d'autre part. Pour la dilution à 0.8%, j'ai procédé comme suit: - Distribuer quelques gouttes d'hématies A 1, B et O de concentrés érythrocytaires dans des tubes en verre. - Laver 1x dans du NaCl 0.9% en centrifugeant 1min. à 2500 tours/min. -Décanter. - Pipeter 30 μl d'érythrocytes lavés et ajouter 3720 μl de NaCl 0.9% ou de ID-Dilent2. Différence en tube entre une solution à 0.8% et à 3% 14

15 4.2.2 Méthode en tube La méthode en tube est la méthode de référence. Une fois les solutions à 3% réalisées, j'ai procédé de la manière suivante pour l'analyse des isoagglutinines: - Pipeter 2 gouttes de plasma de chaque échantillon pour 1 goutte d'hématies-tests. - Centrifuger les tubes après une minute à température ambiante. - Quantifier les agglutinations au dessus d'une lampe, en décollant le culot et en l'étirant. Cette étape est la plus délicate car elle n'est pas standardisée; en effet il est impossible d'avoir à chaque fois exactement le même mouvement et la même dynamique en décollant le culot érythrocytaire. Cela étant dit, la variation de quantification n'est probablement pas significative, sauf pour les résultats très faibles Méthode en carte J'ai procédé de la manière suivante pour toutes les hématies-tests: - Pipeter 50 μl de chacune des hématies-tests dans des cartes neutres Biorad. - Ajouter 50 μl de plasma du patient - Laisser incuber à température ambiante pendant 15 minutes - Centrifuger 10 minutes à 910 tours/minutes - Lire et quantifier l'agglutination à la lumière. 15

16 4.2.4 Méthode Erytra La comparaison avec la méthode Erytra n'est pas nécessaire, néanmoins nous l'avons testée par intérêt, étant donné qu il sera mis en route à l' dans le courant de l'année 2014 pour toutes les analyses qui ne seront pas jugées urgentes. L'Erytra est un automate effectuant le groupe complet ABO ainsi que d'autres analyses immunohématologiques. Le principe repose sur la détection de la réaction antigène-anticorps dans les puits, qui est filtrée par la centrifugation selon la taille des agglomérats. ( 6 ) Les forces d agglutinations sont comparables à la méthode manuelle en carte Interprétation des résultats Cet automate est muni d'une caméra haute résolution qui lui permet de détecter une différence de couleurs entre les globules rouges et le reste du puits, et interprète l'intensité des réactions selon un algorithme interne. Si une réaction est faiblement positive, s'il y a présence d'une forte hémolyse ou d'autres artéfacts comme de la fibrine dans la micro-cupule, l'automate indiquera un message d'erreur qui devra être validé par un technicien. ( 7 ) 5 Coûts Afin d'obtenir des prix comparables, j'ai calculé pour chaque hématie-test le prix pour 10ml de solution à 0.8%, comme elles sont vendues commercialement. Le prix des cartes neutres et du petit matériel tel que les pipettes ou les embouts n'ont pas été prix en compte, car il est utilisé pour toutes les méthodes. 5.1 Hématies-tests faites «maison»: Hématies-tests diluées dans de l'immusol: Produit Volume d'une unité Prix d'une unité Concentré érythrocytaire Volume dans la solution à 0.8% Prix pour la solution à 0.8% 275 ml CHF 0.08 ml 0.06 CHF Immusol 10'000 ml CHF 9.92 ml 0.02 CHF Total 10 ml 0.08 CHF 16

17 5.1.2 Hématies-tests diluées dans du Diluent2: Produit Volume de l'unité Prix d'une unité Concentré érythrocytaire Volume dans la solution à 0.8% Prix pour la solution à 0.8% 275 ml CHF 0.08 ml 0.06 CHF Diluent2 500 ml 75 CHF 9.92 ml 1.49 CHF Total 10 ml 1.55 CHF 5.2 Hématies-tests commerciales : Hématies GRIFOLS: Produit Volume de l'unité Prix d'une unité Hématies-tests prêtes à l'emploi Volume dans la solution à 0.8% Prix pour la solution à 0.8% 4x10 ml 28 CHF 10 ml 7 CHF Total 10 ml 7 CHF Hématies BIORAD: Produit Volume de l'unité Prix d'une unité Hématies-tests prêtes à l'emploi Volume dans la solution à 0.8% Prix pour la solution à 0.8% 3x10 ml 25 CHF 10 ml 8.33 CHF Total 10 ml 8.33 CHF 17

18 5.3 Discussion Sachant que pour 10 ml de solution d'hématies-tests on effectue environ 200 déterminations d'isoagglutinines, le prix pour une seule analyse devient presque nul avec les hématies-tests préparées manuellement: 0.04 centimes avec les hématies-tests dans l'immusol, 0.8 centimes avec les hématies-tests dans le Diluent2. Bien que les méthodes avec les hématies-tests commerciales ne soient pas trop onéreuses, la comparaison entre les résultats BIORAD et les hématies-tests «maison» diluées dans l'immusol, révèle une différence de coût d un facteur 100 entre elles. 6 Résultats 6.1 Présentation Les 215 résultats bruts ont été retranscrits sur un tableau en annexe. Les résultats ayant une force d'agglutination entre +++ et ++++ toutes méthodes confondues sont considérés comme concordants. En revanche, tous les résultats ayant des intensités < +++ ou avec 2 intensités de différence sont considérés comme non-conformes. Ces résultats non conformes ont été classés par catégorie de la manière suivante: Résultats discordants ou très faibles ((+) ou +) Isoagglutinines faibles (++) ou avec une différence 2 intensités selon la technique Résultats entre ++ et +++ Résultats très faibles ((+) ou +) ET avec une différence 2 intensités Sur l'ensemble des résultats, il y a 21% des résultats qui sont non conformes, la plupart étant des échantillons particuliers : 29% sont des patients de plus de 80 ans, 21% sont en isolement ou en oncologie et 7% sont des patients allogreffés. 21% 79% Résultats conformes Résultats non conformes 18

19 24%. Résultats non conformes Résultats discordants ou très faibles ((+) ou +) Isoagglutinines faibles (++) ou avec une différence 2 intensités Résultats entre ++ et +++ Résultats très faibles ((+) ou +) ET avec une différence 2 intensités 9% 28% 39% 24% Les résultats qui présentent une discordance ABO entre le groupe globulaire connu et les isoagglutinines ou qui présentent des isoagglutinines très faibles représentent 28% des résultats non conformes. Parmi eux seul un résultat présentait une telle discordance avec la méthode en tube (cf. discussion) et un seul résultat reste inattendu et nonexplicable. Les résultats qui présentaient une différence égale ou supérieure à deux intensités entre la méthode en tube et les différentes méthodes en carte s'élèvent à Les résultats dont l'intensité des isoagglutinines étaient entre ++ et +++ comptent le plus gros pourcentage, qui est de 39%. Ceux qui ont à la fois des isoagglutinines affaiblies et des intensités variables selon les techniques représentent 9% des résultats non conformes. 19

20 6.2 Discussion Résultats discordants ou très faibles: Sur les 13 patients testés, il y a 3 patients allogreffés non iso-groupe, dont la discordance est expliquée par le phénomène de l'allogreffe (voir p.7) Les 9 échantillons suivants sont principalement des malades séjournant en oncologie ou en isolement. Il s'agit de patients souffrant de cancers ou de maladies hématologiques sous traitement chimio-thérapeutique pouvant avoir un dysfonctionnement immunitaire. Parmi eux se trouve le résultat discordant avec la méthode en tube susmentionné, qui est un patient d'oncologie. Les isoagglutinines de ce malade ne sortent avec aucune méthode. J'ai donc essayé de modifier les conditions pour améliorer l'agglutination. Les isoagglutinines étant de nature IgM, elles réagissent mieux à froid. Par conséquent l'incubation s'est déroulée à 4C et non à température ambiante: Patient GRH tube GRH Carte ISO maison avec NaCl GRH Carte ISO maison avec Diluent 2 GRH Carte ISO Grifols GRH Carte ISO BIORAD ERYTRA A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O Groupe A (+) / / / A / / / A+ Commentaires ONM1 (oncologie) Procédure normale centrifugation après 15 min d'incubation à 4 C centrifugation après 30 min d'incubation à 4 C Comme on peut le remarquer, l'incubation à 4 C a eu un effet sur la méthode en tube, mais la méthode en carte en revanche est restée négative. La méthode ERYTRA ne peut pas subir de changement, car elle est totalement automatisée. Il nous reste un dernier prélèvement nous posant un problème, dont la discordance reste inexpliquée: Patient GRH tube GRH Carte ISO maison avec NaCl GRH Carte ISO maison avec Diluent 2 GRH Carte ISO Grifols GRH Carte ISO BIORAD ERYTRA A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A- Groupe Commentaires 1977, chirurgie et traumatologie Il s'agit d'un jeune patient traité pour une fracture du tibia. Y a t-il eu un problème préanalytique tel qu'une dilution dû à une perfusion? 20

21 6.2.2 Isoagglutinines faibles ou avec une différence 2 intensités selon la technique: La plupart des résultats présentent une agglutination constante en carte entre +++ et ++++, ce qui n'est pas le avec la méthode en tube qui est plus faible. Cela provient sûrement de mon appréciation. En effet comme dit précédemment, il est parfois difficile de quantifier de manière précise l'agglutination en tube, car ce n'est pas une lecture uniformisée et dépend de l'évaluation de la technicienne. Un des patients présente des isoagglutinines légèrement affaiblies de manière constante avec toutes les méthodes. Il est probable que ce soit dû à un problème préanalytique ou à une pathologie, mais nous ne disposons pas de plus amples informations Résultats entre ++ et +++: Ces résultats ont été considérés comme non conformes mais on peut tout de même voir une très bonne cohérence entre les différentes méthodes. En effet, en analysant les résultats, c'est essentiellement les résultats en tube qui sont un peu plus faibles, ce qui est probablement dû à la quantification manuelle. Après étude de ces résultats, nous décidons de les intégrer aux résultats conformes, ce qui ramène les proportions comme suit: 13% 87% Résultats conformes Résultats non conformes 21

22 6.2.4 Résultats très faibles ((+) ou +) et avec une différence 2 intensités: Seuls des patients de groupe O ont été testés. Ces résultats présentent une différence d'intensités entre les différentes méthodes ainsi qu'entre les isoagglutinines A et B. Sur les 4 résultats, un est une récente autogreffe suite à un lymphome malin non hodgkinien ce qui explique l'affaiblissement du résultat. Deux sont des personnes de plus de 80 ans, ce qui peut produire une baisse de synthèse des isoagglutinines. Quant au dernier, il reste inexpliqué. 6.3 Synthèse des résultats: Afin de comparer les résultats, nous avons décidé de la règle suivante pour les analyser; séparer les résultats concordants des non concordants à partir d'une intensité de moins de +++. De manière générale, nos résultats sont tout à fait concluants. Nous avons pu observer que selon les intensités, la comparaison entre les forces d'agglutination en tube et en carte n'est pas toujours identique. En effet, lorsque les résultats en tube sont à inférieurs à ++, ils ont tendance à être discordants et affaiblis en carte tandis que les résultats ++ en tube ont tendance à être renforcés en carte et induisent fréquemment une différence d'intensités sans pouvoir être réellement expliqués. Après analyse, nous pouvons dire que les résultats entre ++ et +++ sont à considérer comme concordants, car les résultats ++ concernent uniquement la méthode en tube et comme dit précédemment, la quantification visuelle par une technicienne n'est pas constante. De plus il est difficile de quantifier avec exactitude la lecture des résultats en tube, car dans la routine il s'agit plus d'une appréciation positive ou négative qu'une réelle quantification. Sur les 215 tests réalisés, nous arrivons à 87% de résultats conformes et 13% de non conformes. Par ailleurs seuls 2 résultats restent inexpliqués au vu des informations dont nous disposons. 22

23 7 Conclusion L'étude de ce travail porte sur la validation d'une méthode d'isoagglutinines en carte à introduire au sein du laboratoire. Au vu des résultats, il n'y a pas de différence significative entre les diverses hématies-tests en carte. D'un point de vue organisationnel, les hématies-tests commerciales sont plus pratiques à utiliser, car elles sont prêtes à l'emploi. En revanche, au niveau financier, les méthodes de dilutions manuelles sont nettement plus avantageuses, puisque les 10 ml d'hématies-tests diluées manuellement dans l'immusol reviennent à 0.08 CHF contre 7 CHF pour GRIFOLS et 8.33 CHF pour BIORAD. Compte tenu de la comparaison effectuée dans ce travail et des coûts, nous décidons d'instaurer la méthode avec les hématies-tests diluées dans l'immusol. Toutefois, si cette technique devait surcharger l'organisation du laboratoire, nous déciderions alors d'utiliser des hématies-tests commerciales BIORAD. Celles-ci sont les plus onéreuses, mais travaillant déjà avec des cartes gel BIORAD, nous uniformiserions notre méthode avec des hématies-tests du même fournisseur. Du point de vue personnel, ce travail a été très intéressant à faire car j ai pu effectuer les analyses de manière autonome tout en pouvant compter sur l aide de mes collègues en cas de besoin. De plus, le fait que cette validation va être utilisé en routine est très valorisant. Il est vrai que j ai rencontré quelques difficultés, comme la présence de fibrine dans certains échantillons, mais j ai aisément pu y remédier. En revanche, le fait que les tests utilisent beaucoup de plasma a été problématique dans le sens où les cas de patients de 3 à 6 mois n ont pas pu être testés comme il était prévu. 8 Remerciements Je tiens à remercier la Doctoresse Giorgia Canellini et Sandrine Bouquet, TAB responsable de l, qui m ont suivi dans l élaboration de ce travail de diplôme, ainsi qu aux représentants de GRIFOLS et de BIORAD qui m ont fourni la formation Erytra et les hématies-tests nécessaires, Marika Vuillemier et Domenico Camarda. Un grand merci aussi à mes responsables de stage, Marie Kissling et Yvette Magnenat ainsi qu à toute l équipe de l qui ont su répondre à toutes les éventuelles questions que j ai eues et avec qui j ai beaucoup aimé travaillé ces six derniers mois. 23

24 9 Bibliographie 1 Tissot, J.-D. (Prof.), Canellini, G. (Dr) et Waldvogel, S. (Dr) (5ème édition, mise à jour août 2011). Immunohématologie, bases de médecine transfusionnelle. (p.19, 21, 25-26, 30-31, 47-48, 51, 56, 126) 2 Conne, J. (octobre 2007). IT - RE - Groupes ABO & Rhésus D. - CHUV. (p.4) 3 Tissot, J.-D. (Prof.) (Janvier 2007). IT - RE - Interprétation des résultats en immuno-hématologie. - CHUV. (p.4) 4 Toutsurlatransfusion (09 avril 2013). Difficultés, défaut de Simonin, créé par Stivionade. Consulté le 10 mars URL: 5 ASMT. ( ). ANALYSES DE MÉDECINE TRANSFUSIONNELLES CHEZ LE PATIENT - Recommandations de l ASMT et de T-CH CRS. Consulté le (p.16) URL : 6 Bouquet, S. (mars 2014). IT-RM-Automate Erytra. CHUV.(p.1) 7 GRIFOLS. Guide d'utilisation de l'erytra - Caractéristique de l'automate.(p.3) Les illustrations sont des photos que j'ai prises au laboratoire. 24

25 10 Lexique Agglutination : Allogreffe : Anti-sérum : B.L : Carte gel : Épreuve globulaire : Épreuve sérique : Hématie-test: Isoagglutinine: Post/prozone : Formation d agrégats suite à la fixation d un anticorps sur un antigène correspondant. Opération chirurgicale ayant pour but de remplacer un organe défaillant par un organe sain provenant d un autre individu (En l occurrence, concerne des greffes de moelle épinière). Réactif contenant un anticorps spécifique afin de rechercher la présence d un antigène donné. (Pluriel : anti-séra) Bon de livraison. Matériel de laboratoire. Carte contenant des microbilles soit imprégnées d anti-sérum pour la recherche d un antigène, soit neutre pour la recherche d un anticorps. Leur milieu dépend du type d anticorps à rechercher (milieu salin, enzymatique, Liss-Coombs). Analyse visant à mettre en évidence les antigènes du système ABO. Met en contact les hématies du patient avec des anti-séra spécifiques anti-a et anti-b. Technique aussi appelée test de Beth-Vincent. Analyse visant à mettre en évidence les anticorps du système ABO. Met en contact le plasma du patient avec des hématies-tests A 1, B et O. Technique aussi appelée test de Simonin. Solution contenant des globules rouges diluée à une concentration précise, selon la technique. Dilution à 0.8% pour les techniques en carte-gel et à 3% pour les techniques en tube. Anticorps du système ABO produit spontanément en l'absence de l'antigène correspondant. Concentration à laquelle il y a trop ou pas assez d anticorps pour produire une réaction antigène-anticorps positive. 25

26 11 Annexes 11.1 B.L des concentrés érythrocytaires utilisés: 1) 26

27 2) 27

28 11.2 Résultats bruts : Date Patient GRH tube NaCl Diluent 2 GRIFOLS BIORAD ERYTRA Groupe Commentaires A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O O A O O B A A A O A A O O A+ MINK O B O O O O O O+ 28

29 Date Patient GRH tube NaCl Diluent 2 GRIFOLS BIORAD ERYTRA A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O Groupe Commentaires A A O A A A AB O B O A A O B O A A A O O O+ légère DP en carte B B+ 29

30 Date Patient GRH tube NaCl Diluent 2 GRIFOLS BIORAD ERYTRA A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O Groupe Commentaires B+ ONMH B+ MINK B B AB AB AB AB B B B B B B AB B B AB B (OBS) AB B B B (GYN) 30

31 Date Patient GRH tube NaCl Diluent 2 GRIFOLS BIORAD ERYTRA Groupe Commentaires A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O AB B (GYN) B B B (GYN) AB B B B B (+) (+) B B- ONMH (+) (+) /- - - B+ MINK AB B AB B AB AB AB B (OBS) A- Patient AB+ allogreffé O+ puis A B (SEN) 31

32 Date Patient GRH tube NaCl Diluent 2 GRIFOLS BIORAD ERYTRA A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O Groupe Commentaires B B (OBS) B AB B A- Patient AB+ allogreffé O+ puis A B B AB /- - - B B O AB AB A AB A AB AB A AB A O

33 Date Patient GRH tube NaCl Diluent 2 GRIFOLS BIORAD ERYTRA A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O Groupe Commentaires AB+ MINK A A AB AB O AB+ MINK A O+ MINK A+ MINK AB AB AB AB AB AB AB AB O+ mai B O+ avril AB O

34 Date Patient GRH tube NaCl Diluent 2 GRIFOLS BIORAD ERYTRA A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O Groupe Commentaires (+) (+) - - (+) A O O A+ ONMH (1941) O A O A O- légère DP en carte O O A A+ MINK AB+ MINK O A O B+ ONMH A O+ MINK O+ MINK AB AB+ 34

35 Date Patient GRH tube NaCl Diluent 2 GRIFOLS BIORAD ERYTRA Groupe Commentaires A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O AB AB A AB A A / O O O O AB AB B O A A AB (+) - - (+) - - (+) - - (+) B+ MINK O+ MINK A AB+ ONMH O AB+ patient B + allogreffé AB+ 35

36 Date Patient GRH tube NaCl Diluent 2 GRIFOLS BIORAD ERYTRA A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O A 1 B O Groupe Commentaires A A AB A A O O A A A B- ONMH A (GYN) (+) (+) (+) O A O A B O O A+ ONM1 (oncologie) A AB A+ ONM1 (1939) 36