SPECTROFLUORIMETRIE D ABSORPTION EMISSION MOLECULAIRE 1 Principe = aspect qualitatif 1.1 Rappels sur le raynnement visible : 1.2 Principe de la flurescence 2 Aspect quantitatif 2.1 Rendement quantitatif de flurescence 2.2 Intensité de la flurescence 2.3 Expressin des spectres 3 Mlécules cncernées 4 Appareillage 5 Phénmènes parasites 5.1 Phénmènes liés à l appareillage 5.2 Phénmèes liés aux mesures en slutin 5.3 Phénmènes liés à l échantilln (phénmènes internes, externes) 6 Applicatins analytiques de la flurescence 6.1 Applicatins qualitatives 6.2 Applicatins qualitatives 7 Cnclusin
Intrductin La flurescence est définie cmme l émissin de lumière par des mlécules sans dégagement de chaleur. Seln la surce d apprt d énergie, n distingue : La chimiluminescence Energie furnie par une réactin chimique Biluminescence Energie furnie par une réactin enzymatique Flurescence Energie furnie directement par absrptin phtnique / lumière La grande sensibilité et la sélectivité de cette technique nt permis de dévelpper de nbses applicatins, ntamment dans le dmaine de l analyse des médicaments, des substances naturelles et de leurs métablites dans les milieux bilgiques. 1 Principe : aspect qualitatif 1.1 Rappels sur le raynnement visible : Les ndes électrmagnétiques visibles nt une lngueur d nde qui s étant de 400 à 800nm Les ndes UV s étendent de 200 à 400 nm. Ces rayns électrmagnétiques transprtent une énergie E exprimée par la relatin suivante : E = h.υ = h.c / λ Fréquence 1,6.10 15 à 3,8.10 14
Ces énergies crrespndent aux énergies de transitin électrnique de mlécules à T ambiante, la plupart des mlécules snt dans leur état électrnique et leur état de vibratin fndamental, plusieurs états de vibratins peuvent être ccupés cnfrmément à la répartitin de Blztman. 1.2 Principe de l absrptin-émissin de flurescence : La flurimétrie étudie l EMISSION de lumière par des mlécules, en slutin u à l état slide, après excitatin par des phtns appartenant au dmaine du visible u du prche ultravilet. Lrsque qu une mlécule flurescente absrbe un phtn d énergie, les électrns vnt passer de l état fndamental E0 à l état excité E1 (instable). Il vnt ensuite revenir à l état vibratinnel le plus bas de E1 par perte de micrchaleur C est la relaxatin Ils vnt finalement returner à l état fndamental E0 avec émissin d un phtn de flurescence = énergie Seule les transitins π π et n π dnnent lieu à une flurescence. L énergie ainsi émise, est inférieure à l énergie d excitatin (inverse pur la λ). Le spectre d émissin est l image du spectre d absrptin dans un mirir. NB : La phsphrescence passe par une étape supplémentaire l état triplet u il y a returnement de spin (phénmène plus lng). Diagramme de Jablnski et spectre de flurescence
2 Aspect quantitatif 2.1 Rendement quantitatif de flurescence Rapprt du nmbre de phtns émis au nmbre de phtns absrbés : Rendement quantique φ = If / Ia (sans unités) φ est cmpris entre 0 (absence de flurescence) et 1 (flurescence maximale). φ dépend, il est caractéristique : de la mlécule du slvant, du ph de l a T (φ diminue lrsque la T augmente) φ ne dépend pas : de l intensité de la surce lumineuse de la lngueur d nde d excitatin (seuls les phtns absrbés snt pris en cmpte) 2.2 Intensité de flurescence +++ L intensité de flurescence, à lngueur d nde λ, est prprtinnelle à l intensité lumineuse absrbée et au rendement quantique de flurescence. I F = φ x I A = φ x( I I 0 ) Avec I F = intensité de flurescence I A = intensité absrbée (I 0 -I) L intensité absrbée, I A, est dnnée par la li de Beer-Lambert, l intensité de flurescence devient alrs : I F = φ x I 0 x (2,3.ε.l.c) Avec I 0 = intensité incidente Or l appareil ne capte qu une partie de la flurescence, n a dnc : I F = k x (φ x I 0 x (2,3.ε.l.c)) = K x c L intensité est exprimé en Einstein par secndes (1 einstein = 6.1023 phtns) L intensité dépend de : La T ( si T augemnte flu baisse) I 0 de la surce (cntrairement à l UV-visible) De la cncentratin en slutin flurescente De l appareillage (cntrairement à l UV-visible) La λ d excitatin La nature du slvant et du ph
2.3 Expressin des spectres Le spectre d excitatin d une substance est btenu en mesurant la flurescence EMISE à une lngueur d nde fixe et en laissant varier la lngueur d nde d EXCITATION Le spectre d émissin d une substance est btenue en mesurant la flurescence EMISE aux différentes lngueurs d nde d émissin, en EXCITANT avec une lngueur d nde fixe.
3 Mlécules cncernées Pur que la flurescence se manifeste, pls caractéristiques snt nécessaires : Absrptin dans l UV (mais seulement 5% des substances absrbantes dans l UV snt flurescentes). Frte prbabilité maximale d absrptin (εmax) Faible énergie de transitin électrnique Absence d atmes u de gpts favrisant les phénmènes nn radiatifs dans la mlécule. Les mlécules les plus flurescentes snt : Des plycycles armatiques structure planes et rigides Les substituants rth u para directeurs (-NR > -NH> -OR > -OH) snt activateurs de la flurescence Les substituants méta-directeurs (-COOH, -COOR, --CHO, -COR, -NO2, -NO) et les atmes, snt désactivateurs de la flurescence. Gpts alkyls et acide sulfnique n nt pas d effet Ex : Les flurchrmes : Flurescéine = FITC Rhdamine Ruge Texas Phycerythrine Vitamines Cathéchlamines Médicaments : Aspirine, amphétamine, barbiturique, quinine, quinlnes, fursémide AA : Tyrsine, tryptphane 5HT NB : pssibilité aussi de dser des ins minéraux après chélatin. 4 Appareillage Une surce lumineuse : Lampes à arc au xénn : Emissin cntinue entre 220 et 700 nm Leurs énergies varient en fct de la lngueur d nde Ce snt les plus perfrmantes Les lampes à vapeur de mercure : N émettent qu un spectre discntinu (raies entre 254 et 366 nm) Ne snt utilisables que pur des cmpsés absrbants dans l UV Les surces lasers : Apparitin récente Encre peu utilisées Un mnchrmateur d excitatin (prisme u réseau) Une cuve (en quartz) Un mnchrmateur d émissin : Permet la sélectin d une bande étrite de lngueur d nde d émissin (car après excitatin, l éch émet dans tutes les diectins) Semblable au mnchrmateur d excitatin Un phtmultiplicateur (transfrme la lumière émise en curant électrique). Un système de lecture du signal
NB : Flurimètre = 2 filtres (pas de mnchrmateur) Analyse uniquement quantitative 5 Phénmènes parasites 5.1 Phénmènes liés à l appareillage 5.2 Phénmèes liés aux mesures en slutin 5.3 Phénmènes liés à l échantilln : La flurescence est mdifiée en raisn de phénmènes prvenant de la mlécules elle-même (phénmènes internes) u d une interactin avec les mlécules du slvant (phénmènes externes). 6 Applicatins analytiques de la flurescence 6.1 Applicatins qualitatives Méthde sensible (identificatin de traces) et spécifique (/ interférences) Déterminatin du spectre d absrptin d une substance dans les cnditins u la spectrph UVvisible est inadapté /sensibilité Permet de tracer le spectre d excitatin d une mlécule à très faible cncentratin u en présence de substances absrbantes interférantes. 6.2 Applicatins quantitatives Analyse des médicaments u de substances naturelles à cncentratin svt faible dans les milieux bilgiques. Analyse après excitatin à une lngueur d nde déterminée Analyse directe de substances naturellement flurescentes (ex : quinine, quinidine) Les mlécules peu flurescentes snt amplifiées par hétércyclisatin. Les mlécules nn flurescentes peuvent être rendues flurescentes par dérivatin de flurescence. Parmi ces cmpsés de dérivatin, la flurescamine et la brmméthxycumarine peuvent interagir avec certains gpts fct d AA, amines bigènes, prstaglandines La flurimétrie est également utilisable dans le cadre des méthdes immunlgiques en phase hmgène u hétérgène, le traceur étant cnstituer par la mlécule à dser marquée par un fluchrme.
Ex : le micrscpe à flurescence 7 Cnclusin Méthde sensible, sélective et pssédant un large éventail d applicatins en bilgie et pur le dsage des médicaments. L appareillage est cependant néreux et la mise en œuvre de ces techniques assez délicate.