UTILISATION DU SPINNING DISK CSU10

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1 UTILISATION DU SPINNING DISK CSU10 Observer aux oculaires en transmission 5 Observer aux oculaires en fluorescence 6 Observer au Spinning disk 7 Echantillonnage spatial, dynamique des images 8 Enregistrer les images 10 Acquérir une image 11 Acquérir plusieurs couleurs 13 Acquérir une série Z 15 Acquérir un timelapse 16 Acquérir plusieurs positions de platine 19 Eteindre le système 20 1

2 Allumage du système 1. Allumer la lampe à fluorescence. 2. Allumer la multiprise marquée "SPINNING", sur le bureau. Le piezzo, la caméra, le pilote des roues d'émission, la platine motorisée, la tête du spinning y sont reliés indirectement. La "mise en marche " de cette multiprise allume tous ces éléments. 3. Au niveau du boîtier de commande laser : a). Mettre la clef sur ON (tourner dans le sens inverse des aiguilles d'une montre) b). Allumer les lasers dont vous avez besoin. c). Appuyer sur le bouton "Laser output ON" (la led rouge s'allume) b c a 4. Visser l objectif dont vous avez besoin dans le piezo sans forcer. Vérifier l ouverture numérique de l objectif (bague). Ranger en les vissant, les objectifs non utilisés dans leurs boites 5. Sur le PC, «Loggez» vous en utilisant la session de votre groupe. S il n en existe pas, adressez vous à l équipe de la PF 2

3 6. Lancer Metamorph Vérifiez que l objectif est baissé au maximum. Au message «Would you like to home the stage now», faire NON sauf si vous souhaitez enregistrer des positions de platine. 8. Vérifier que la barre de journaux est apparente, sinon l afficher en allant dans le menu : Journal/Show Taskbar (ou F4) 9. Cliquer sur LASER_ON (émission des lasers) et sur MODE LENT 10. Lancer la boite Multidimensional acquisition (Apps/Multidimensionnal Acquisition) 3

4 11. Sur la droite du microscope, mettre l optovar dans la position 1X : 12. Mettre en place l échantillon en utilisant le support universel (sans oublier l huile ou l eau pour les objectifs à huile ou à eau!!) 4

5 Observer aux oculaires en transmission 1. Sur le côté droit du microscope, se mettre en position oculaires en poussant délicatement la tirette. Tirette 2. Sur le côté gauche du microscope, fermer le shutter de fluorescence en poussant délicatement la tirette. 3. Vérifier que la roue de filtres est en position vide (pos2) Shutter Roue de filtres 4. Sur le côté gauche du microscope, allumer la lampe halogène (bouton orange sur la gauche du microscope), et régler l intensité avec la molette. 5. Mettre au point l échantillon en utilisant les molettes du microscope 5

6 Observer aux oculaires en fluorescence 1. Sur le côté gauche du microscope, éteindre la lampe halogène (bouton orange sur la gauche du microscope), et régler l intensité avec la molette. 2. Sur le côté gauche du microscope, tourner la roue de filtres jusqu à la position voulue. Shutter Roue de filtres 3. Sur le côté gauche du microscope, ouvrir le shutter de fluorescence en tirant. 4. Fermer le shutter de fluorescence quand vous n observez pas votre échantillon afin de le préserver du photoblanchiment. Remarques : Ne pas hésiter à fermer le diaphragme de champ pour diminuer l intensité de fluorescence. 6

7 Observer au Spinning disk 1. Sur le côté gauche du microscope, tourner la roue porte filtre en position vide. Shutter Roue de filtres 2. Sur le côté gauche du microscope, fermer le shutter de fluorescence en poussant délicatement la tirette. 3. Sur le côté droit du microscope, se mettre en position caméra en tirant délicatement. Tirette 7

8 Echantillonnage spatial, dynamique des images Echantillonnage spatial XY Valeur de binning à utiliser en fonction de l objectif et Optovar utilisés. Objectif NA Immersion Binning Optovar 100x 1.4 huile X 100x 1.4 huile 2 1 X 63x 1.32 huile 1 1 X 63x 1.2 eau 1 1 X 40x 1.25 huile 1 1 X 20x 1.25 Huile ou eau 1 1 X Binning pour la fonction Snap Binning pour la fonction Live Optovar Remarques : Ces valeurs de binning sont choisies pour numériser de façon optimale l image en fonction du pouvoir résolutif de l objectif utilisé. La sensibilité de détection de la caméra et sa rapidité de lecture augmentant selon le carré du binning, il peut être intéressant dans certains cas (signaux faibles, besoin de rapidité) de sous échantillonner le signal en travaillant à un binning plus élevé. N hésitez pas à demandez conseil aux ingénieurs de la plate-forme! Echantillonnage spatial Z La meilleure valeur de Step Size à appliquer est fonction de l objectif utilisé : Objectif Step Size optimum 100x ou 63x à huile 0.25 µm 63x à eau 0.35 µm 40x à huile 0.35 µm 20x multi immersion 1.3 µm 8

9 Remarques : Ces valeurs sont choisies pour numériser de façon optimale l image en fonction du pouvoir résolutif de l objectif utilisé. Il peut être intéressant dans certains cas de sous échantillonner ou de sur échantillonner le signal. Dynamique des images Afficher la boite Scale Image (Display/Scale Image) Le maximum de l image ne doit jamais atteindre Plus la dynamique de l image est importante (différence entre intensité maximum et intensité minimum ; dans cet exemple : =1457 niveaux) meilleure est l image. Si la dynamique de l image est trop faible, augmentez le temps d exposition, ou la puissance du laser Attention! Plus on éclaire un échantillon, plus on le détruit. Choisissez le bon compromis entre qualité du signal et préservation de l échantillon. N hésitez pas à demander conseil à un ingénieur de la plate-forme. 9

10 Enregistrer les images 1. Cliquer sur l onglet Saving de la boite Multi Dimensional Acquisition 2. Cliquer sur Select Directory et choisir le dossier dans lequel enregistrer les images Sélectionner le chemin suivant : dossier Users sur le bureau ( users / «année» / «mois en cours» / «jour de la manip» / «dossier à votre nom») 3. Dans la fenêtre "Base Name", indiquer le nom de l expérience, de préférence terminée par un chiffre. Lorsque la case" Increment base name if file exists" est sélectionnée l incrémentation du nom de fichier se fait automatiquement (exemple : si "Serie" existe, Metamorph appellera le fichier suivant "Serie_01", puis le suivant "Serie_02" etc). 4. Les images sont sauvegardées automatiquement à la fin de leur acquisition. Remarque : Pour les stacks, l'image est sous format tif, mais porte l extension.stk (stack). Attention! Les images sauvées dans un autre répertoire ou datant de plus de 15 jours sont détruites automatiquement et sans préavis. 10

11 Acquérir une image 1. Dans l onglet Main de la boite Multi Dimensional Acquisition, vérifier que rien n est sélectionné 2. Cliquer sur l onglet Wavelength de la boite Multi Dimensional Acquisition a). Dans la fenêtre Illumination, choisir le fluorophore d intérêt (GFP, RFP, Cy5). Les différentes valeurs indiquées à coté du nom du fluorophore correspondent au pourcentage de puissance laser. Sélectionner la puissance optimum en fonction de l intensité du marquage. Lors d un double marquage GFP + RFP, sélectionner l illumination «GFP_select» pour l acquisition de la GFP. 11

12 b). Dans la fenêtre Exposure, choisir le temps d exposition (200 ms) c). Vérifier que les fonctions d Auto-focus et d Auto-exposure ne sont pas activées (No Auto Expose, No Auto Focus) d). Cliquer sur Live et trouver le plan d intérêt avec les flèches montante et descendante. 3. Cliquer sur Snap 4. Vérifier le nombre de niveaux de gris dans l image (boite Scale Image). 5. Cliquer sur Acquire pour acquérir l'image. 12

13 Acquérir plusieurs couleurs 1. Dans l onglet Main de la boite Multi Dimensional Acquisition sélectionner Multiple Wavelengths 2. Cliquer sur l onglet Wavelengths de la boite Multi Dimensional Acquisition et choisir le nombre de fluorophores à observer (2, 3 ou 4). 3. Pour chaque onglet (W1, W2) créé : 13

14 a). Dans la fenêtre "Illumination", choisir le fluorophore d intérêt (GFP, RFP, Cy5). Les différentes valeurs indiquées à coté du nom du fluorophore correspondent au pourcentage d AOTF, et donc de puissance laser. Il est donc nécessaire de sélectionner la puissance optimum en fonction de l intensité du marquage. b). Dans la fenêtre "Exposure", choisir le temps d exposition (200 ms) c). Vérifier que les fonctions d Auto-focus et d Auto-exposure ne sont pas activées "No Auto Expose, No Auto Focus" d). Cliquer sur "Live" et trouver le plan d intérêt avec les flèches montante et descendante. e). Cliquer sur "Snap" f). Vérifier le nombre de niveaux de gris dans l image "boite Scale Image". Lancer l acquisition en cliquant sur "Acquire" 14

15 Acquérir une série Z 1. Dans l onglet "Main" de la boite "Multi Dimensional Acquisition" sélectionner "Z Series" 2. Cliquer sur l onglet "Z Series" de la boite "Multi Dimensional Acquisition" 3. Cliquer sur "Live" 4. Vérifier que la valeur 150µm est bien indiquée et choisir un incrément de déplacement (par exemple 0.25µm). 15

16 5. En utilisant les flèches montantes et descendantes déplacer l objectif jusqu à la limite supérieure de la région de l échantillon à imager. 6. La définir comme Top en cliquant sur la touche "Set Top to Current" 7. Procéder de façon identique pour définir la limite inférieure de la région d acquisition.cliquer sur "Set Bottom to Current" 8. Définir la distance entre deux coupes optiques "Step Size". Le nombre de plans est défini automatiquement en cliquant sur la case "Number of Steps" 9. Lancez l acquisition en cliquant sur "Acquire" Remarques : -Les réglages de temps d exposition et de puissance laser doivent être effectués dans le plan le plus intense de l échantillon. -Les paramètres de la série peuvent également être définis en cochant la case "Range Around Current". Dans ce cas, indiquer l épaisseur dans la fenêtre "Range", puis le "Step Size" et le nombre de plans à effectuer "Number of Steps". -En cas d'acquisition de séries Z multi-couleurs sur des échantillons fixés, cocher les cases" Acquire Z series for one wavelength at a time" et "Keep shutter open between steps". -En cas d'acquisition de séries Z multi-couleurs sur des échantillons vivants, cocher la case "Acquire wavelength set at each Z". 16

17 Acquérir un timelapse Mode classique 1. Dans l onglet "Main" de la boite "Multi Dimensional Acquisition" sélectionner "Timelapse" 2. Dans l onglet "Timelapse" de la boîte "Multi-Dimensional Acquisition" sélectionner le nombre de point de temps à réaliser ainsi que l intervalle de temps souhaité. Vérifier que l intervalle de temps choisi n est pas inférieur au temps d acquisition (temps d acquisition ms de lecture d image au maximum) Pour plus d information sur le délai minimum entre deux points de temps, adressez vous aux ingénieurs de la plate-forme. 3. Cliquer sur" Live" et trouver le plan d intérêt avec les flèches montante et descendante 4. Cliquer sur Snap 5. Vérifier le nombre de niveaux de gris dans l image "boite Scale Image" 6. Lancer l acquisition en cliquant sur "Acquire". 17

18 Mode rapide (stream) Dans le mode "Stream", les acquisitions s enchaînent en continu. Pendant qu une image est acquise, la précédente est lue. Les acquisitions sont plus rapides mais la qualité des images est un peu inférieure. Pour savoir comment réaliser ce type d'acquisition, prenez contact avec un ingénieur de la plate-forme. 18

19 Acquérir plusieurs positions de platine 1. Dans l onglet "Main" de la boite "Multi Dimensional Acquisition" sélectionner "Multiple Stage Positions" 2. Dans l'onglet "Stage" de la boîte "Multi-Dimensional Acquisition": Le numéro de la position est affiché dans la fenêtre Position Label. Pour ajouter une nouvelle position, cliquer sur Le nom de la position ainsi que ses coordonnées X, Y et Z apparaissent alors dans la fenêtre Positions. Attention, si une précédente position est sélectionnée (surlignée en bleu), celle-ci sera écrasée par la nouvelle. Pour insérer une position entre 2 positions déjà existantes, cliquer sur L'acquisition est réalisée en fonction de leur ordre dans la liste. Pour modifier l'ordre d'acquisition des positions, utiliser les flèches et Pour supprimer une position, la sélectionner et cliquer sur 19

20 Eteindre le système Vérifier sur le planning, si le système est utilisé après votre session. Si le système est utilisé après : 1. Quitter MetaMorph (File/Close) 2. Transférer vos données 3. Nettoyer l objectif sur le dessus et les côtés ainsi que le support de l échantillon. Si le système n est pas utilisé : 1. Quitter MetaMorph (File/Close) 2. Transférer les données 3. Nettoyer l objectif sur le dessus et les côtés ainsi que le support de l échantillon. 4. Au niveau du boîtier de commande laser : a). éteindre les lasers (diodes rouges éteintes) b). Mettre la clef sur OFF (tourner dans le sens des aiguilles d'une montre) a b 5. Eteindre la prise multiple marquée "SPINNING" sur le bureau. 6. Eteindre la lampe à fluorescence. 20