Développement des membres de vertébrés

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1 Développement des membres de vertébrés

2 INTRODUCTION Se développent à partir des bourgeons de membres 3 axes: proximo-distal, antéro-posterieur, et dorso-ventral Prox. Dors. Ant. Post. Vent. Dist.

3 SPECIFICATION Spécification des membres antérieurs et postérieurs Tbx5 TF qui spécifie le mb antérieur Tbx4 TF qui spécifie le mb postérieur Syndrome de Holt-Oram chez l homme : absence du gène TBX5 caractérisé par des anormalités du cœur et des mb antérieurs.

4 SPECIFICATION Tbx5 Tbx4 Pendant le développement normal du poulet, des hybridations in situ montrent que Tbx5 est exprimé par le mésoderme antérieur de la lame latérale, tandis que Tbx4 par le mésoderme postérieur. Des bourgeons contenant Tbx5 forment des ailes, alors que des bourgeons exprimant Tbx4 forment des pattes.

5 SPECIFICATION Si on induit un nouveau bourgeon en greffant une bille imbibée de FGF le type de membre formé dépend du gène Tbx exprimé dans le bourgeon. Si la bille est placée entre la région d expression de Tbx4 et Tbx5, la bille induira l expression de Tbx4 en postérieur et Tbx5 en antérieur. Le membre qui en résultera exprimera aussi Tbx5 en antérieur et Tbx4 postérieur et va générer un membre chimérique.

6 SPECIFICATION (C) Expression de Tbx5 dans le mb antérieur (w, wing) et dans la portion antérieur d un bourgeon de membre induit par une bille-fgf. (le niveau somitique peut etre déterminé par le marquage de l ARNm de Mrf4 qui est localisé dans le myotome) (D) Expression de Tbx4 dans le mb postérieur (le, leg) et dans la portion postérieure du mb induit par la bille-fgf.

7 (E, F) Un membre chimérique induit par une bille-fgf présente des structures d aile anterieures et des stuctures de patte postérieures SPECIFICATION

8 LES AXES MAJEURS 1. Axe Proximal (près) vers distal (loin) Stylopode Humérus, fémur adjacent du corps Zeugopode Radius-ulnée/ tibia-fibula dans la région médiane Autopode Métacarpe-doigts.

9 LES AXES MAJEURS 2. Axe antérieur (avant) vers postérieur (arrière) Par exemple notre pouce positionne la partie antérieure, le petit doigt, la partie postérieure 3. Axe Dorso ( dessus) vers Ventral (dessous) Par exemple la paume est ventrale la partie supérieure de la main est dorsale

10 LA CROISSANCE DU MEMBRE DORSAL VENTRAL Membre droit

11 CONTRÔLE DIFFERENTIEL DES 3 AXES ZPA Proximal / Distal : temps que les cellules passent dans la zone de progression Antérieur / Postérieur : Gradient de morphogène de la zone a activité polarisante Dorsal / Ventral : Gradient ectodermique

12 Formation de l axe proximo-distal du membre PROXIMAL DISTAL

13 INDUCTION DE LA CRETE APICALE ECTODERMIQUE (APICAL ECTODERMAL RIDGE- AER) Le centre signalisateur majeur pour le développement des membres

14 3 FONCTIONS DE L AER 1. Maintient le mésenchyme sous jacent dans une phase proliférative 2. Maintient l expression des molécules qui génèrent l axe antéro-postérieur 3. Interagit avec les protéines spécifiant les axes antéro-postérieur et dorsoventral, ainsi chaque cellule intègrera les instructions pour se différencier

15 INFLUENCE DE L AER SUR LE MESENCHYME Wing Spécificité régionale Fibroblast Growth Factor [FGF s] 12+ gènes avec plus de 100 isoformes protéiques Fig. 16.9, pg. 511

16 INFLUENCE DE L AER SUR LE MESENCHYME Wing Fibroblast Growth Factor [FGF s] 12+ genes avec plus de 100 isoformes protéiques Fig. 16.9, pg. 511

17 FACTEURS DE CROISSANCE DU FIBROBLASTE (FGF) Greffe de Billes imbibées de FGF sous l ectoderme Quel est le FGF responsable, où?

18 ROLE DU MESODERME INTERMEDIAIRE DANS L INDUCTION DU BOURGEON DE MEMBRE Barrière imperméable entre le mésoderme intermédiaire et le mésoerme des plaques latérales pas d induction de bourgeon de membre Suppression du mésoderme intermédiaire -> croissance du membre sévèrement réduite Le mésoderme intermédiaire joue un rôle important dans l induction source de signal diffusible (toutefois l inducteur doit être restreint au niveau axial puisque le mésoderme intermédiaire s étend le long de l embryon) paraxial intermediate La lame latérale prolifère pour générer le bourgeon

19 EXPRESSION DES CANDIDATS FGFs INDUCTEURS DES MEMBRES Kawakami et al, Expression de Fgf8 : - BM précoce dans le mésoderme intermédiaire - BM tardif, dans l ectoderme quand le membre commence sa croissance Expression de Fgf10 : - Mésoderme de la lame latérale

20 FGF10 ET FGF8 INDUISENT DES MEMBRES ECTOPIQUES Billes FGF8 implantées au st 24 Membre chimérique aile/patte ectopique Flèche patte ectopique Vogel et al, 1996 Ohuchi et al, 1997

21 PHENOTYPE DES SOURIS MUTANTES FGF10 +/+ -/- Pas d humérus, scapula + Ceinture pelvienne rudimentaire Min et al, 1998

22 Exposition à la Thalidomide pendant la grossesse (J20 & J36) Glutamic acid derivative Phocomelia

23

24 EXPERIENCES GAIN DE FONCTION Ohuchi et al, 1997 Rat FGF10 cells B - 17h expression ectopique de FGF8 dans l ectoderme du flanc C - 36h expression ectopique de FGF10 dans le mésenchyme du flanc D- Expression ectopique de Shh Flèche + astérix cellules greffées E - 17h expression ectopique de FGF10 dans le mésenchyme F - 17h pas d expression ectopique de FGF8 (bleue - cellules lacz) G - 28h expression ectopique de FGF8 dans l ectoderme du flanc

25 BOUCLE D INDUCTION FGF8/FGF10 FGF8 FGF10 FGF8 FGF8 du MI signale la MLL pour induire la formation de membre FGF10 médie l effet inducteur de FGF8 Probablement l expression restreinte de FGF10 dans le MLL est l événement clé

26 LA ZONE DE PROGRESSION (PROGRESS ZONE PZ) Est située sous l AER. PZ Produit la croissance initiale du membre : les cellules mésenchymateuses se divisent rapidement. Les cellules commencent à se différencier seulement après avoir quitté la zone de progression. Le processus de différenciation se poursuit dans la partie distale alors que le membre croit - la destinée cellulaire est déterminée par le temps passé dans la zone de progression.

27 LA ZONE DE PROGRESSION : LE COMPOSANT MESODERMIQUE C est une zone de division cellulaire Le bourgeon de mb s allonge par la prolifération des cellules du mésenchyme sous l AER. C est l AER qui garde les cellules du mésenchyme à l état prolifératif (FGF).

28 Vue dorsale d un squelette après ablation complète de l AER d un bourgeon de membre droit à différents stades. La dernière photo (E) est celle d un squelette d aile normal.

29 CONTRÔLE DE LA SPECIFICATION PROXIMO-DISTALE PAR LES CELLULES DE LA ZONE DE PROGRESSION (A) Ulnée et radius supplémentaires sont formés quand des cellules de PZ jeunes sont transplantées à un aile vieille qui a déjà formé ulnée et radius (B) Perte de structures intermédiaires observées quand une vieille PZ est transplantée à une jeune aile.

30 Limb Field Forelimb expression de FGF10 dans le mésoderme latéral Somitic mesoderm Hindlimb FGF10 stabilisé par Wnt8c (mb postérieur) and Wnt2b (mb antérieur) Fig. 16.6, Pg. 509

31 HOX ET SPECIFICATION DE L AXE PROXIMO-DISTAL Gènes équivalents sur chaque chromosome Hoxa1, Hoxb1 appelés paralogues 4 chromosomes résultent de duplication chromosomique

32 HOX ET SPECIFICATION DE L AXE PROXIMO-DISTAL Rôle des gènes Hox : Spécifient la place où les membres sont formés Spécifient à une cellule mésenchymateuse son devenir en stylopode, zeugopode, ou autopode.

33 DELETION DES OS PAR DELETION DES GENES HOX PARALOGUES (A)Patte avant de souris sauvage. (B) Patte avant de souris double mutante pour les gènes Hoxa-11 and Hoxd-11. L ulnée et le radius sont absents.

34 DELETION DES OS PAR DELETION DES GENES HOX PARALOGUES C) Synpolydactylie humaine (fusion de nombreux doigts), syndrome résultant d une homozygotie au locus HOXD-13. Le syndrome humain inclut aussi des malformations du système urogénital qui exprime aussi HOXD-13.

35 HOX : GENES QUI REGULENT LA DIFFERENTIATION PROXIMO-DISTALE (D) Hypothèse que les gènes 5 Hox spécifient des régions particulières du mb antérieur.

36 CARACTERISTIQUES DES GENES HOX Souris et hommes possèdent 4 clusters Hox (au total 39 gènes chez l homme ) localisés sur 4 chromosomes différents. Chez l homme : HOXA, HOXB, HOXC, HOXD Sont exprimés chez l embryon selon la position qu ils occupent sur le chromosome Tous les gènes d un cluster hox sont homologues entre eux (en particulier dans leur homéodomaine) mais montrent une très forte homologie avec les gènes équivalents de Drosophile. HoxB7 diffère d Antp de seulement 2 acides aminés, HoxB6 par 4. Le gène de souris HoxB6 inséré chez la Drosophile peut se substituer à a place du gène Antennapedia en produisant des pattes à la place des antennes Conclusion?

37 GENES HOX Ces gènes sélecteurs ont été gardés, pendant des millions d années d évolution, leur fonction étant d assigner des positions particulières chez l embryon. Les structures construites dépendent de différents combinatoires de gènes pour une espèce particulière. Spécificité génétique

38 L EXPRESSION DES GENES HOX CHANGE PENDANT LA FORMATION DU MEMBRE (A) Pendant la formation du stylopode (phase I), Hoxd-9 and Hoxd-10 sont exprimés dans le membre naissant. (B) Pendant la formation du zeugopode (phase 2), il y a une expression emboitée des gènes Hoxd tel que Hoxd-9 à Hoxd-13 sont exprimés dans la partie postérieure du membre, tandis que seul Hoxd-9 est exprimé dans les parties antérieures et postérieures. (C) Inversion de de l expression des gènes hox pendant la formation de l autopode. Hoxd-13 et Hoxa-13 sont exprimés en antérieur et postérieur, tandis que Hoxd-10 à Hoxd-12 et Hoxa-12 sont exprimés en postérieur. ( Shubin et al )

39 Spécification de l axe antéropostérieur ANTERIEUR POSTERIEUR

40 LA ZONE A ACTIVITE POLARISANTE : ZONE OF POLARIZING ACTIVITY - ZPA Quand une ZPA est greffée dans la partie antérieure d un membre, il se produit une duplication des doigts en miroir par rapport aux doigts normaux. ( Honig and Summerbell 1985.)

41 LA ZONE A ACTIVITE POLARISANTE : ZONE OF POLARIZING ACTIVITY - ZPA 2eme centre organisateur La ZPA est une petite zone de tissu mésodermique située à côté de la jonction postérieure du bourgeon et du corps de l embryon. Produit un morphogène diffusible qui spécifie la position des cellules le long de l axe antéro-postérieur (A/P) ; par concentration de morphogène ou par des signaux diffusibles La protéine Sonic Hedgehog (SHH) est le composant clef ZPA Qu est-ce-qui active son expression?

42 FONCTION DE SONIC HEGGEHOG (SHH) Fig , pg. 516

43 QUE FAIT SHH APRES ETRE EXPRIME? SHH ne diffuse pas en dehors de la ZPA. En revanche, il initie et maintient une série de cascades en activant d autres protéines: 1- SHH régule l expression des gènes 5 HoxD 2- SHH régule l expression de BMP2 et BMP7 qui vont former un gradient de la ZPA et vont spécifier les doigts.

44 (A) -Gli3 ( facteur de transcription répresseur) est exprimé en antérieur -dhand (facteur de transcription activateur) est exprimé en postérieur - Sous le contrôle de l enhancer ELCR, les gènes HoxD sont exprimés dans la région postérieure (HoxD13 étant le moins étendu) Fig , pg. 518

45 (B) -Shh est exprimé dans la région postérieure du mésenchyme, région où sont exprimés les gènes Hox. Cette région est la ZPA initiale Fig , pg. 518

46 (C) -Sous l influence de Shh, un nouvel enhancer (GCR) est activé, et il réverse l expression des gènes Hox. HoxD13 est exprimé sur tout le mésenchyme distal du membre, HoxD12 est un peu moins distal. Fig , pg. 518

47 Shh active un antagoniste d un répresseur de l expression de FGF4 pour réguler l AER de façon positive Fig , pg. 519

48 REGULATION DE L IDENTITE DES DOIGTS Souris a) Les progéniteurs du doigt 4 (vert) et 5 (rouge) sont dans la ZPA et expriment SHH b) Les cellules du doigt 5 expriment encore Shh dans la ZPA, pas celles du doigt 4 c) Quand les doigts se forment, le doigt 5 a été exposé plus longtemps a plus de protéine SHH par rapport au doigt 4 d) Représentation schématique où les doigts 4 et 5 sont exposés à Shh selon un mode autocrine; le doigt 3 selon un mode autocrine + paracrine; le doigt 2 selon un mode paracrine. Fig , pg. 520

49 REGULATION DE L IDENTITE DES DOIGTS Shh pourrait agir via les BMP s pour l identification des doigts Ablation de l espace interdigital (ID) en rouge. L espace ID exprime BMP. (B,C) Addition de billes-noggin, un inhibiteur de BMP.(D) Souris homozygote pour Gli3 et Shh (G) - Pas d ordre Fig , pg. 521

50 L axe Dorso-ventral du membre DORSAL VENTRAL

51 L AXE-DORSO-VENTRAL La polarité dorso-ventrale est déterminée par l ECTODERME qui entoure le mésenchyme du membre. Une rotation de 180 degrés de l ectoderme a pour conséquence un retournement des éléments distaux Wnt7a spécifie cette polarité ( = exprimé dans l ectoderme dorsal)

52 L AXE-DORSO-VENTRAL Wnt7a Lmx1b En1: facteur de transcription Reprime l expression de Wnt7a dans l ectoderme ventral (B) Wnt7a Souris mutante pour Wnt7a --- Duplication des tendons ventraux et des coussinets Fig , pg. 521

53 Résumé des évènements proposés dans la formation des membres Induction Fgf-10 Maintenance

54 Maintient de l expression de Shh par Wnt7a (dans l ectoderme dorsal) Détermination de la taille de l AER par Wnt7a Shh (ZPA) induit Gremlin qui va induire les FGF (dans l AER) Formation de la ZPA (Shh) par l AER (FGF8) et dhand Fig , pg. 522

55 APOPTOSE ET FORMATION DES DOIGTS ET DES LIGAMENTS Le programme de mort cellulaire (apoptose) joue en rôle en sculptant les membres. Régions sculptées par mort cellulaire : Zone Interdigitale Zone interne nécrotique (séparant radius and ulnée) Zones Antérieures & postérieures (modelage de l extrémité des membres). Le mésoderme détermine la destinée cellulaire

56 BONE MORPHOGENETIC PROTEINS (BMP) Les signaux de mort cellulaire dans l autopode sont BMP2, BMP4 et BMP7 Ils sont exprimés dans le mésenchyme interdigital Le blocage de la signalisation BMP empêche l apoptose interdigitale NOGGIN

57 PATRON DE MORT CELLULAIRE CHEZ LE CANARD ET LE POULET Expression de Noggin Pas d expression de BMP 4 À cause de l expression de Noggin Expression de BMP 4 Fig , pg. 522

58 L INHIBITION DU RECEPTEUR AUX BMP EMPECHE L APOPTOSE (A) Patte gauche = contrôle. La patte droite est infectée par un virus exprimant un récepteur dominant négatif pour BMP. Ce récepteur mutant bloque la signalisation BMP dans la patte droite et empêche l apoptose et la croissance des doigts. ( Zou et Niswander 1996) (B) Expression de noggin dans les doigts en formation. La protéine est expimée dans les régions de condensation du cartilage et est absente des régions interdigitale d apoptose et des ligament à ce stade. ( Merino et al. 1998,)

59 IMPLCATION POSSIBLE DES BMP DANS LA STABILISATION DU CARTILAGE ET DES LIGAMENTS (A, B) Expression de BMP7 (A) et BMP2 (B) dans 2 sections des doigts III et IV pendant la période tardive de développement des membres. Les astérisques en (A) et les fleches en (B) montre l endroit où les ligaments vont se former. (C, D) Les effets of Noggin. (C) Expression de GDF5 dans un autopode de 16.5j de souris sauvage montrant l expression de GDF5 (bleu) dans les ligaments. (D) Souris mutant pour noggin au même stade montrant ni joint, ni expression de GDF5.Probablement en absence de noggin, BMP7 peut convertir presque tout le mésenchyme en cartilage.

60 Limb bud specification 8.0dpc mouse 20days human Hox genes Retinoic acid

61 Forelimb (upper) appears earlier than hindlimb (lower) Limb bud consists of ectodermal cap covering mesenchymal core Proliferation/apoptosis mesenchyme Limb bud initiation 9.0dpc, 17-20s 23 days human

62 Limb bud outgrowth dpc 25-30s 10.0dpc 30-35s

63 Limb bud outgrowth 11.5dpc 45-50s

64 Handplate and footplate Handplate 12.5dpc dorsal surface Footplate

65 Handplate and footplate Handplate 13.5dpc Footplate

66 Handplate and footplate 14.5dpc 15.5dpc