Professeur Joël LUNARDI

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1 Biochimie - Biologie moléculaire Chapitre 9 : Applications médicales Professeur Joël LUNARDI PCEM1 - Année 2006/2007 Faculté de Médecine de Grenoble - Tous droits réservés.

2 Chapitre 9. APPLICATIONS MEDICALES I. Cartographie du matériel génétique II. Etudes des mutations et polymorphismes III. ADN et thérapeutique

3 I. Cartographie du matériel génétique 1. Carte physique du génome 1.1. Carte chromosomique hybridation in situ sur chromosomes métaphasiques banques spécifiques de chromosomes Locus chromosomique chr 12 chr Carte moléculaire séquençage (génome humain, animaux, plantes, micro-organismes) annotation D19S220 répétition (CA) n exon 1 (nt 1-86) 2006 pb LINE pb gène PCEM1 gène PCEM2 ORF ( nt) (open reading frame) 12 exons protéine PCEM2 156 acides aminés

4 2. Carte génétique, marqueurs polymorphes et études de liaison marqueurs polymorphes microsatellites : ex : -- ( ca ) n -- > / génome répartition sur tous les chromosomes D1S, D17S polyallèliques ( n = 100, 101, 102 ou 103 par ex) D1S1 D1S2 D1S3 D1S4 SNPs : polymorphismes de nucléotide La distance entre deux séquences polymorphes peut être estimée en centi-morgan (cm). Cette unité de distance génétique tient compte des recombinaisons méïotiques ( 60 recombinaisons / 2n chromosomes ) observées dans la population entre les deux séquences. La liaison génétique entre deux locus est estimée à l aide du Lod score Z (score de liaison).

5 Exemple n 1 : établissement d une distance génétique entre deux marqueurs bi-allèliques analyse de N méïoses D1S53 D1S53 D1S53 D1S53 D1S53 D1S54 D1S53? D1S54 D1S54 D1S54 D1S54 D1S54 2n 98 % de gamètes inchangés 2 % de gamètes recombinés La distance génétique entre les marqueurs D1S53 et D1S54 est de 2 cm (2% de recombinaison). Ceci signifie que lors d une nouvelle méïose, il y aura une probabilité de 98% pour que ces 2 marqueurs microsatellites restent associés sur le même chromosome ou inversement de 2% pour qu ils soient recombinés

6 Exemple n 2: étude de la ségrégation de 3 marqueurs situés sur le chromosome 1p allèles possibles m1 = a, b ou c m2 = a, b, c ou d m3 = a ou b a a a d a b b c c b a a a b d c b a a b a c a a a b a c a a a c d b b a a c a b b a recombinaison entre m2 et m 3 selon toute vraisemblance, la distance génétique m1-m2 < m2-m3

7 Exemple n 3: étude de la ségrégation familiale d une maladie à transmission dominante dont le gène responsable est situé dans cette région chromosomique 1p m1 = a, b ou c m2 = a, b, c ou d m3 = a ou b m1 m2 m3 a a a d a b b c c b a a I-1 I-2 a b d c b a II-1 a b a c a a II-2 a b a c a a a c d b b a a c a b b a II-3 II-4 II-5 L haplotype a-a-a est associé à la maladie dans cette famille (sauf II-5 chez qui une recombinaison est observée entre m2-m3) Le fait que la patiente II-5 ne soit pas atteinte indique que selon toute vraisemblance, le gène associé à cette maladie dominante est localisé entre le marqueur m2 et m3.

8 3. Identification de gènes responsables d une pathologie dans la famille «génome humain» je voudrais le gène n 4487 pioche! stratégie génétique directe stratégie dite par génétique «inverse» : le clonage positionnel

9 PATHOLOGIE liaison génétique avec un marqueur anomalie fonctionnelle ou structurale connue localisation chromosomique protéine responsable marche vers le gène GENE prévention diagnostic thérapie

10 II. Identification des variants moléculaires que recherche t on? - macro-lésions : nombre et structure des chromosomes - micro-lésions : variations moléculaires quand? - diagnostic prénatal, pré-implantatoire - caractéristiques génétiques activités diagnostiques soumises à agréments

11 trophocenthèse ( sa) ADN amniocenthèse ( > 16 sa) ADN sang du cordon

12 II. Identification d anomalies génétiques que recherche t on? - macro-lésions : nombre et structure des chromosomes - micro-lésions : mutations quand? - diagnostic prénatal (>10ème S.A.), néonatal, pré-implantatoire pourquoi - aide au diagnostic, conseil génétique - diagnostic présymptomatique - diagnostic de prédisposition - pharmacogénétique

13 II. Identification d anomalies génétiques que recherche t on? - macro-lésions : nombre et structure des chromosomes - micro-lésions : mutations quand? - diagnostic prénatal (>10ème S.A.), néonatal, pré-implantatoire pourquoi - aide au diagnostic, conseil génétique - diagnostic présymptomatique - diagnostic de prédisposition - pharmacogénétique sur quel matériel biologique? - ADN ou ARNm - cellules somatiques, cellules germinales

14 1. diagnostic direct d une mutation connue + diagnostic de l hémochromatose, maladie AR causée par la mutation c.845 G>A du gène HFE et résultant par le remplacement d un résidu cystéine par une tyrosine en position 282 de la protéine gène normal gène muté -----GTGC pb PCR coupure par Rsa I analyse par électrophorèse -----GTAC pb 29 pb site Rsa I 146 pb 117 pb migration 29 pb porteur hétérozygote homozygote muté homozygote sain

15 1. diagnostic direct d une mutation inconnue maladie monogénique : analyse de la séquence des exons par séquençage analyse de la séquence du transcrit après synthèse d ADNc maladie multigénique : liaison ou exclusion génique analyse de la séquence des exons par séquençage analyse de la séquence du transcrit après synthèse d ADNc

16 2. diagnostic indirect : le gène ou les mutations responsables ne sont pas connus, un cas «index» sera nécessaire pour établir une «liaison génétique» entre la maladie et des marqueurs polymorphes le risque d erreur dépend de la probabilité de survenue d une recombinaison entre les marqueurs utilisés + exemple du diagnostic de mucoviscidose - maladie récessive, gène CFTR sur le chr 7, > 400 mutations -1 er niveau d exploration : recherche des 30 mutations les plus fréquentes -2 ème niveau d exploration : séquençage du gène -3 ème niveau d exploration : diagnostic indirect par étude de liaison à l aide de marqueurs polymorphes (IVS8, 17TA, ) IVS8 : (CA)n avec 85 < n < 95 17TA: (CA)n avec 90 < n < 11O

17 IVS8 : (CA)n avec 85 < n < 95 17TA: (CA)n avec 90 < n < 11O analyse du microsatellitte IVS-8 I.1 I.2 I.1 I.2 II.1 II.2 possibilités pour II ? II.1 II.2 II.3 89 enfant atteint allèle 1 allèle 2 I.1 : I.2 : II.1: II.2: 85 86

18 IVS8 17TA sain? malade ou porteur & haplotypes «CF»

19 3. Polymorphismes et médecine légale Extraction de l ADN, amplification de plusieurs VNTR, analyse et comparaison ADN du suspect jeans pull ADN extrait du sang retrouvé sur les vêtements du suspect parka ADN de la victime VNTR : variable number terminal repeats

20 3. Polymorphismes et médecine légale Extraction de l ADN, amplification de plusieurs VNTR, analyse et comparaison ADN du suspect jeans VNTR spécifiques VNTR commun pull ADN extrait du sang retrouvé sur les vêtements du suspect parka ADN de la victime VNTR : variable number terminal repeats

21 3. Polymorphismes et médecine légale Extraction de l ADN, amplification de plusieurs VNTR, analyse et comparaison ADN du suspect jeans pull ADN extrait du sang retrouvé sur les vêtements du suspect parka ADN de la victime VNTR : variable number terminal repeats

22 4. Identification de génomes exogènes bactériologie, virologie, parasitologie caractère pathogène, virulence, résistance charge virale et suivi thérapeutique exemple : caractérisation des papillomavirus (HPV) - > 80 types d HPV : HPV-1, HPV-2, HPV-3 - diagnostique biologique difficile car culture in vitro impossible - types à risque faible (tumeurs bénignes) : HPV-6, HPV-11, - types à haut risque (cancers ano-génitaux): HPV-15, HPV-18,... typage par hybridation avec des sondes moléculaires ou par PCR lysat cellulaire sondes moléculaires spécifiques de chacun des types HPV HPV 11

23 II. ADN ET THÉRAPEUTIQUE 1. protéines recombinantes thérapeutiques expression dans une bactérie gène d intérêt transfert dans la bactérie culture des bactéries expression dans un animal transgénique protéine «médicament» : facteur de croissance, interféron...

24 2. ADN médicament : thérapie par les gènes absence totale ou partielle du produit du gène protéine recombinante compensation thérapie génique ex: SCID : 0 % de protéine ADA fonctionnelle prélèvement de moelle osseuse et mise en culture in vitro rétrovirus portant le gène normal Intégration de la séquence génétique du gène normal dans le génome cellulaire ré-introduction des cellules transformées dans l organisme

25 prolifération anormale des cellules le produit du gène muté induit la prolifération des cellules destruction directe ou assistée des cellules : introduction du gène de la thymidine kinase et action du Ganciclovir présence d un produit «anormal» du gène chorée de Huntington et produit du gène IT15 le produit du gène muté est toxique pour la cellule neutralisation du produit anormal correction du gène muté

26 Merci de votre attention & bon courage!!!

27 L'ensemble de ce document relève des législations française et internationale sur le droit d'auteur et la propriété intellectuelle. Tous les droits de reproduction de tout ou partie sont réservés pour les textes mais aussi pour l'ensemble des documents iconographiques, photographiques, vidéos et sonores. Ce document est interdit à la vente ou à la location. La diffusion de ce document, sa duplication, sa mise à disposition du public à sa demande ou non, sa mise en réseau, sa communication publique, partielle ou totale, sous quelque forme ou support que ce soit, est formellement interdite et strictement réservée à la Faculté de Médecine de Grenoble et de l auteur du document original.. L utilisation de ce document est strictement réservé à l usage privé et non marchand aux fins de représentation sur écran monoposte des étudiants inscrits à la Faculté de Médecine de Grenoble et non destinées à une utilisation collective, gratuite ou payante. L utilisation de ce document à titre d enseignement est strictement réservé à la Faculté de Médecine de Grenoble et à ses contributeurs. Ce document a été réalisé par la Cellule TICE Médecine de la Faculté de Médecine de Grenoble. PCEM1 - Année 2006/2007 Faculté de Médecine de Grenoble - Tous droits réservés.

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