Plateforme. DArT (Diversity Array Technology) Pierre Mournet

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1 Plateforme DArT (Diversity Array Technology) Pierre Mournet Lundi 8 avril 203

2 Pourquoi des DArT? Développement rapide et peu onéreux de marqueurs : Pas d information de séquence nécessaire. Pas de pré-requis pour commencer le développement. Utilisation des marqueurs DArT aussi bien sur des populations de cartographie que pour des populations de diversité. Possibilité de mener des études sur des plantes orphelines. Possibilité de developper des marqueurs de la méthylation. Capacité d analyses en parallèle de centaines ou de milliers de marqueurs. Coût réduit, quelques centimes d euros par point de données. Automatisation de la lecture des données Evaluation de la qualité des marqueurs et score individuel de confiance

3 DArT: Comment ça marche Developpement des puces (Création de Banques Dart, Design de puces) Analyses de routine Genepool Individu ADN génomique individu2 Représentation génomique Clone Hybridation DArT chip Profil Profil 2

4 DArT: Diversity Array Technology. Marqueurs dominants révélant un polymorphisme de restriction par hybridation sur microarray. Principe:. Création d une banque de clones représentant la diversité de l espèce, digestion par une enzyme de restriction à coupure «rare» (5-6 pb) et une enzyme à coupure «fréquente» (4 pb) et amplification par réaction PCR: Méthode de Réduction de la complexité du génome. Site PstI CTGCAG GACGTC Site PstI CTGCAG GACGTC Site BstnI TCGA AGCT Site PstI CTGCAG GACGTC ADN génomique Double restriction PstI/BstnI Amorces PstI Site PstI ATGCA G T ACGTC Site PstI C TGCAG T G ACGTC A Amorces PstI Amplification PCR avec des amorces PstI + Ligation d adaptateur PstI Site BstnI CGA T ATGCA G T ACGTC Site PstI C TGCAG T G ACGTC A T AGC Aucune amplification PCR ATGCA G T ACGTC ATGCA G T ACGTC ATGCA G T ACGTC C TGCAG T G ACGTC A C TGCAG T G ACGTC A C TGCAG T G ACGTC A Réduction de la complexité du génome X

5 DArT: Diversity Array Technology. Marqueurs dominants révélant un polymorphisme de restriction par hybridation sur microarray. Principe: 2. Préparation des puces: Dépôts des clones (produits PCR) sur lames de verre (environ 6000 clones par lames) 3. Génotypages de 96 individus : - Traitement des ADNs par le même système de réduction de la complexité que pour la banque (Restriction/Ligation/PCR ). - Hybridations de 96 lames / Lavages des lames/ Scan des lames. ADN génomique Etape : Préparation de le représentation génomique Morceau de vecteur marqué avec un fluororchrome FAM (signal de référence pour la normalisation) Etape 2: Marquage des cibles avec un fluorochrome Cy3/Cy5 Etape 3: hybridation des génotypes sur puce (puce=génotype) Etape 4: Lavage et scan des puces Analyse des hybridations: ratio bleu/vert pour chaque spots

6 DArT: Diversity Array Technology. Marqueurs dominants révélant un polymorphisme de restriction par hybridation sur microarray. Principe: 4. Analyse des images, détection automatique des spots hybridés, lecture présence/absence. Trie des marqueurs sur des seuils de qualité P et Q. (en moyenne 7 à 0% de marqueurs polymorphes) Analyse des images et Positionnement des grilles de lecture

7 DArT: Diversity Array Technology. Marqueurs dominants révélant un polymorphisme de restriction par hybridation sur microarray. Détection du polymorphisme Individu Individu n seuils de qualité P et Q 2 P= 8.2 Q= P= Q=

8 Etude de la contribution de la voie asexuée dans la création de variabilité au sein des systèmes de cultures du Vanouatou Sélection clonale importante au sein de la grande igname Dioscorea alata!!!! Figure. NJTree de la structure de la diversité de la grande igname D.alata calculé à l aide de l indice de dissimilarité de Dice à partir de 38 marqueurs DArT. Les valeurs de bootstrap (00 répétitions) sont représentées à partir de 50 %. Doctorant: Henri Vandenbroucke

9 Ressources sur le plateau Espèces Projets Banques Utilisation Bananier Musa L. GCP 6 plaques PstI/BstnI Diversité Bananier Musa L. GCP 6 plaques PstI/TaqI Diversité Sorgho Sorghum bicolor GCP 6 plaques PstI/BanII Diversité Sorgho Sorghum bicolor GCP 6 plaques PstI/taqI Diversité Citrus genre Citrus GEPETOS 6 plaques PstI/HpaII méthylation et diversité Citrus genre Citrus GEPETOS 6 plaques BstY/HpaII méthylation et diversité Sorgho Sorghum bicolor GEPETOS 6 plaques PstI/BanII Diversité Blé Triticum aestivum L. AIP INRA/Cirad 40 plaques PstI/TaqI carto génétique/ diversité Palmier à huile Elais oleifera SAMPC Palmelit/Cirad 6 plaques PstI/BstnI diversité Palmier à huile Eleais guinensis /Elais oleifera SAMPC Palmelit/Cirad 6 plaques PstI/BstnI Carto Cacaoyer Theobroma cacao Cirad séquençage Cacaoyer 6 plaques HindIII/TaqI Carto Riz Oryza sativa Projet européen Eurigen/ GCP 6 plaques PstI/TaqI Diversité Arachide Arachis duranensis GCP 6 plaques PstI/TaqI carto Arachide Arachis ipaensis GCP 6 plaques PstI/BanII carto Igname Dioscorea alata/esculenta ANR végéculture 6 plaques Diversité Taro Colaucasia esculenta ANR végéculture/fstp taro 6 plaques Diversité/Carto Kava Piper methysticum G.Forst ANR végéculture 6 plaques Diversité Dactyle Dactylis glomerata glomerata L. AIP INRA/Cirad 40 plaques PstI/TaqI Diversité Luzerne Medicago sativa L AIP INRA/Cirad 40 plaques PstI/TaqI Diversité Fétuque Genre Festuca AIP INRA/Cirad 40 plaques PstI/TaqI Diversité Ray-grass d'italie Lolium multiflorum Lam Privé /JD 20 plaques PstI/TaqI Diversité Ray-grass anglais Lolium perenne L. AIP INRA/Cirad 40 plaques PstI/TaqI Diversité Hévéa Hevea brasiliensis Cirad 20 plaques PstI/TaqI Diversité/carto

10 Merci