Analyses MALDI-TOF. Acquisition des spectres de masse en mode automatique

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1 Analyses MALDI-TOF Acquisition des spectres de masse en mode automatique Etape préliminaire : Afin d optimiser vos analyses en mode automatique, il est nécessaire de réaliser différentes séries d acquisition en fonction de l intensité (bien visible avec la coloration au bleu de coomassie) et des poids moléculaires apparents de vos spots sur les gels. Vous pouvez faire une première série avec des spots intenses et dans une gamme de masse comprise entre 20 et 100 kd. Une seconde série avec la même gamme de masse mais des intensités plus faibles. Enfin, une troisième série avec des spots de faibles intensités et des spots ayant des poids moléculaires inférieurs à 20 kd et supérieurs à 100 kd. Première étape avec le logiciel PS1 Sur le PCrobo (salle 26) Se connecter comme administrateur avec le login «ps1» (mot de passe à demander à Céline ou Alain) But de cette première étape : Création du fichier Excel contenant la liste de vos échantillons et des fichiers nécessaires pour l acquisition en mode automatique. - Cliquer sur l icône PS1 sur le bureau 1) Cliquer sur la première icône - Remplir la feuille Excel : Champs obligatoires : nom de la plaque et nom des l échantillons. - Enregistrer la liste des échantillons au format Excel sur le PC du robot dans : D:Mode auto 2004/Liste echt excell Ex : D:\Mode Auto 2004\Liste echt excell\analyse toto xls 1

2 Champs obligatoires 2 ) Création du fichier séquence (.seq) qui recense la liste des échantillons et des fichiers utilitaires permettant de réaliser l acquisition en mode automatique. - Cliquer sur la seconde icône PS1 conversion utility 2

3 1 Cadres Cadre1 Symbiot spotting layout : Sélectionnée l icône 96 well. Cadre 2 : Sample entry Spreadsheet/SEQ file : - Première ligne Sample entry Spreadsheet : Localisation du fichier Excel que vous venez de créer Sélectionner le en cliquant sur les trois petits points. Ex : D:\Mode Auto 2004\Liste echt excell\analyse toto xls - Seconde ligne Voyager SEQ file : Localisation du fichier séquence (.seq) sur le PC du MALDI : Modifier le nom du fichier sans enlever l extension. seq (nom identique au fichier excell mais avec une extension.seq) et l enregistrer dans le répertoire où seront stockés les spectres de masse (cf ci dessous) Ex : \\Pc526mald\voyagerD\data mode auto 2004\toto 2004\Analyse toto seq 3

4 Cadre 3 : Voyager instrument control panel settings - Première ligne Data file base name : Objectif : Créer le répertoire dans lequel seront stockeés les spectres de masse en cliquant sur les trois petits points (connection réseau au PC MALDI avec le login «voyager»et un mot de passe administrateur : à demander à Céline ou Alain) Stocker de préférence les spectres de masse dans Data mode auto Créer un dossier daté à votre nom - Ajouter echant (nomination des fichiers de masse) Les noms de fichiers échantillons seront stocker et incrémentés automatiquement sous la forme : Echant Axb.dat Ex : \Pc526mald\voyagerD\BSP\ Data mode auto 2004 \Toto \echant - Seconde ligne Instrument settings file for samples (BIC). Adresse du fichier «méthode d acquisition» localisé sur le PC MALDI (ne pas modifier) : \\Pc526mald\voyagerD\Voyager\Methods\Autosammodif.bic - Troisième ligne Instrument settings file for calibrants (BIC) : Sélectionne le mode de calibration : interne ou externe Sélectionner internal si vous avez réalisé une digestion trypsique - Quatrième ligne Calibration file : Fichier référence de calibration externe (Ne pas modifier). \\Pc526mald\voyagerD\Voyager\Calibration\Cal-mariam cal Cadre 4 : Data explorer settings Ne rien modifier dans ce cadre!! - Première ligne Processing settings file for sample (SET) : Localisation du fichier de référence des masses des calibrants (trypsine : ; ) \\Pc526mald\voyagerD\Voyager\DATAPS1\trypsine.set - Deuxième ligne Sample premacro : «Macro 4» qui permet de calibrer le spectre de masse avec les deux peptides d autohydrolyse trypsique) : - Troisième ligne Sample post macro : «macro 5» qui permet d appliquer la calibration : Les deux dernières lignes doivent être en grisée Enfin, Cliquer sur l icône Create files création du fichier séquence Le message Conversion done indique que le fichier a bien été créer 4

5 Seconde étape avec le logiciel Sequence control panel Sur le PC du MALDI (salle 26). Se connecter avec le login «Voyager» - Cliquer sur l icône «Sequence control panel» située sur le bureau. Le logiciel, ouvre automatiquement Voyager instrument control panel 1) Cliquer sur le menu file et ouvrir le fichier séquence (.seq) des échantillons à analyser créer précédemment. Ce répertoire est localisé en principe ( ou bien dans votre lieu de stockage de vos spectres de masse) : Ex : \\Pc526mald\voyagerD\data mode auto 2004\toto 2004\Analyse toto seq Vous allez voir apparaître votre fichier «.seq» qui contient toutes les informations nécessaires à l acquisition des spectres de masse. 5

6 2) Réglage des différents paramètres d acquisition en mode automatique ou manuel Avec le logiciel Voyager instrument control panel - Cliquer sur file pour ouvrir la méthode Autosammodif.bic Localisation : \\Pc526mald\voyagerD\Voyager\Methods\Autosammodif.bic - Vérifier que la gamme de masse qui va être étudiée est bien adaptée à vos analyses > Classiquement de 700 à 4000Da Automatic control Paramètres d acquisition Gamme de masse 6

7 Vérifier les différents paramètres d acquisition Accélérating : V Paramètres de la méthode reflector 20 Hz Grid : 62 % Delay time 120 ns Vérifier les paramètres d acquisition automatique - Cliquer sur Automatic Control Mode de réglage de l intensité du laser : Use Automated Laser Intensity Adjustement - Soit en fixant la valeur du laser manuellement : > Décocher cette fonctionnalité Dans ce cas l ajustement de l énergie du laser est à fixé une fois pour toute et pour l ensemble des échantillons à analyser Cet ajustement est à réaliser sur des échantillons différents : faiblement et fortement concentrés en protéines, de manière à régler l intensité du laser au minimum pour obtenir un rapport signal/bruit le plus élevé possible et une mesure de masse précise. - Soit en fixant une fourchette d intensité laser (min et max) > cocher la case Use Automated Laser Intensity Adjustment Dans ce cas le réglage de l intensité du laser sera ajusté automatiquement avec un pas à fixer Step size. > Classiquement 50 7

8 A décocher si vous souhaitez travailler avec une intensité de laser fixe Ne pas modifier ce cadre A modifier. Ne pas modifier ces cadres 8

9 Accès à d autres paramètres : automatic control (Pour public averti!) Il y a deux façons de régler l intensité du laser. Soit fixer la valeur comme en mode manuel sur la fenêtre «Manual laser intensity», à ce moment là vous ne devez pas cocher la case «Use Automated Laser Intensity Adjustment». Soit donneer une fourchette d intensité laser (réglage automatique : cocher la case «Use Automated Laser Intensity Adjustment» et donner une fourchette d intensité et le pas pour l augmentation du laser). Si vous n utilisez pas le mode «Use Prescan» (expliquer ci dessus), le laser commencera avec une intensité intermédiaire entre le max et le min que vous aurez donné et on a directement les acquisitions. Si vous avez cocher la case «Use automated Laser Intensity Adjusment» et que vous avez choisi de travailler en «Use automated sample positionning», le mode «Use Prescan» est disponible. Ce mode permet de faire un ajustement de l intensité du laser avant le début des acquisitions. Vous pouvez utiliser ce mode pour la première position sur le spot ou bien que pour toutes les positions. 1)Le système commence alors par une intensité laser max sur la première position défini dans le «search pattern file». - Si le signal est trop faible (en dessous de la valeur donnée dans le «spectrum acceptance Criteria») alors le système passe à la seconde position sur la plaque. - Si le signal est trop fort avec le laser au max, alors le système repart avec le laser ayant une intensité mini. (cf 2) -Si le signal est correct (répond au critère du «spectrum acceptance Criteria»), l acquisition démarre. 2) Laser mini - Si le signal est de nouveau trop faible, alors le système part sur une intensité laser intermédiaire entre la valeur max et la valeur mini. (cf 3) - Si le signal est trop fort, le sytème commence l acquisition. -Si le signal est correct (répond au critère du «spectrum acceptance Criteria»), l acquisition démarre. 3) Laser avec une intensité intermédiaire 9

10 Cadre à modifier «spectrum acceptance laser intensity adjustment» Acceptance / Adjustment criteria Ce sont les conditions minimales requises pour que votre spectre de masse soit stocké. Plusieurs types de filtres peuvent être employés : - Intensité min /max - Rapport signal/bruit - Résolution minimum Cadre 1 : Acceptance criteria - Spécifier : l intensité minimum requise pour que le signal spectral soit considérée comme correcte > classiquement Spécifier : l intensité maximum requise pour que le signal spectral soit considéré comme correcte > classiquement Cadre 2 : Criteria Evaluation Mass Range - Spécifier : la gamme de masse sur laquelle la qualité du signal spectral va être évaluée classiquement entre 1000 et 2500 Da - Enregistrer vos modifications sous la méthode Autosammodif.bic 10

11 3) Lancement de l acquisition - Retourner dans le logiciel Voyager sequence control panel - Cliquer sur l icône noire (bien vérifier que les icônes«run» soient cochées). 4) En fin d acquisition, la colonne Acquisition Status, permet de visualiser les échantillons à problèmes. Pas de problème d acquisition : Success Avec problème d acquisition : Processing error : Le spectre de masse n a pas été calibré avec les deux peptides d autohydrolyse trypsique. Vous devrez donc calibrer ce spectre manuellement. Data no created : Le signal de masse est trop faible (inférieur à 900) et aucun spectre de masse n a été stocker à partir de cet échantillon. Cause probable : - Pas assez de matériel biologique - Cristallisation hétérogène - Pas de peptide dans la gamme de masse étudiée Dans ce cas de figure, il convient de réaliser une acquisition manuel du spectre de masse. 11

12 A la fin de votre acquisition, veuillez ranger votre répertoire contenant vos spectres dans votre dossier. Ne rien laisser dans le répertoire DATA MODE AUTO 2004 qui est un lieu de rangement temporaire! 12