Techniques d'étude en cytogénétique

Transcription

1 22/10 ROUBIN Alexandre L2 CR : Victor CHABBERT Génétique médicale H ZATTARA 16 pages Techniques d'étude en cytogénétique Plan : A. Introduction B. Cytogénétique conventionnelle C. Cytogénétique moléculaire I. FISH II. CGH III. Puces à ADN D. Conclusion A. Introduction La cytogénétique est l'étude morphologique du matériel chromosomique qui se présente sous la forme de chromosome. Chromosome : khroma (la couleur) et soma (l'élément) Le chromosome correspond à la molécule d'adn et à d'autres protéines, c'est le support de l'information génétique. Le nombre de chromosome est caractéristique de l'espèce (46 chez l'humain sauf dans les gamètes où il y en a que 23) Les études du caryotype vont permettre l'analyse globale du génome et de détecter des anomalies soit de nombre, soit de structure. Jusqu'à quelques années auparavant, la cytogénétique correspondait à l'étude des chromosomes uniquement, c'est ce qu'on appelle cytogénétique conventionnelle. Elle regroupe le caryotype standard et le caryotype à haute résolution. Depuis une vingtaine d'années, de nouvelles techniques permettent de faire le pas entre l'adn et le chromosome. C'est ce qu'on appelle les techniques d'hybridation in situ en fluorescence (FISH). Encore plus récemment, il y a eu le caryotype moléculaire qui est l'analyse des chromosomes par des puces à ADN (CGH micro-arrays ou ACPA). 1/16

2 B. Cytogénétique conventionnelle Comment fait-on un caryotype? Génétique médicale Techniques d'étude en cytogénétique On a besoin de matériel cellulaire. On peut prendre des fibroblastes, des lymphocytes T, des amniocytes, des cellules trophoblastiques ou des échantillons d'autres tissus (tumeur, la moelle osseuse). Pour réaliser un caryotype, il faut que les chromosomes soit en métaphase, il faut donc que les cellules se divisent et pour cela, on effectue des cultures cellulaires. Dans certains cas, on peut avoir des cellules en division spontanée ou en culture cellulaire. La durée est variable en fonction du tissu : Le sang : 72h - 96h. Les amniocytes : 10 jours Les fibroblastes : 3 semaines Les cellules trophoblastiques : spontanée ou 10 jours. Dans tous les cas, on va essayer de bloquer la cellule en métaphase grâce à un poison (la colchicine) qui empêche la division des cellules. Ensuite, il va falloir faire éclater les cellules à l'aide d'un choc hypotonique. Après avoir fixé les chromosomes, il faut les recueillir et les étaler puis les colorer. Le colorant le plus utilisé est le Giemsa. Enfin, pour les petites translocations, on a des techniques de dénaturation des chromosomes qui font apparaître des bandes sur les chromosomes. Puis on analyse le résultat avec un microscope à contraste de phase. Technique de marquage : Principe : Il repose sur une succession de bandes claires et sombres, longitudinales et caractéristiques de chaque paire de chromosome. Le nombre de bandes est variable en fonction de la condensation de la chromatine. En général, on a une résolution de bandes/lot haploïde de chromosomes 2/16

3 Rappel : Les chromosomes sont composés de deux chromatides, de télomères d'un centromère. longueur dubras court Indice centromérique= longueur totale Coloration au Giemsa : C'est un colorant ayant une affinité particulière pour l'adn. Il permet de faire apparaître les chromosomes en noir. Cela permet de calculer l'indice centromérique de chaque chromosome et de les classer en différents groupe (A, B, C, D, E, F, G) mais aussi d'identifier des anomalies chromosomiques de nombre. On distingue trois types de chromosome : Métacentrique : bras court et long de taille identique Submétacenrtique : taille du bras cours < taille du bras long Acrocentrique : le bras court est quasi inexistant (sur lequel il n'y a pas d'adn codant pour des gènes mais uniquement pour de l'adn ribosomale) 3/16

4 Les différents types des techniques de marquage : Bandes G Génétique médicale Techniques d'étude en cytogénétique C'est une digestion enzymatique ménagée avec ensuite une coloration au giemsa. Les bandes sombres correspondent à des régions d'adn riches en A-T correspondant à des régions condensées précocement lors du cycle cellulaire, à réplication tardive, pauvres en gènes actifs. On voit une alternance de bandes claires et sombres. Cependant, il y a un inconvénient. Les extrémités sont très claires et il arrive qu'il y ait des délétions dans ces zones là pouvant passer inaperçu. Bandes R (reverse band) C'est le «négatif» de la bandes G. C'est une dénaturation thermique ménagée avec une coloration au giemsa. Les bandes sombres correspondent à des régions riches en GC condensées tardivement au cours du cycle cellulaire, correspondant à des régions à réplication précoces, riches en gènes actifs. On voit sur ce chromosome que les bandes R sont l'inverse des bandes G. Bandes C C'est une coloration de l'hétérochromatine constitutive, c'est à dire : les centromères, les constrictions secondaires présente sur le chromosome et sur le bras long du Y et du 12 et les bras courts des chromosomes acrocentriques. Coloration NORs C'est une coloration des organisateurs nucléolaires (NOR, ADNr) qui va mettre en évidence de façon spécifiques les bras courts des chromosomes acrocentriques. 4/16

5 Caryotype en haute résolution : Génétique médicale Techniques d'étude en cytogénétique Les chromosomes sont beaucoup plus étirés. Or, plus un chromosome est étiré, plus on pourra mettre en évidence des lésions plus petites. Caryotype normal : Sur un caryotype normal, le classement des chromosomes se fait par taille décroissante, en fonction de l'indice centromérique et des données des bandes R ou G. Les cellules somatiques humaine ont 46 chromosomes : 22 paires d'autosomes : 1-22 et 1 paire de gonosome XX ou XY. La formule chromosomique selon l'iscn 2013 est 46,XX ou 46,XY. La localisation sur le chromosome (par exemple pour une anomalie) est indiquée par : n du chromosome bras (p ou q) n région n de bande n de sous-bande 5/16

6 Résolution de l'analyse : Caryotype standard : bandes/lot haploïde de chromosomes 1 bande chromosomique = pb Identification de remaniement de 10 Mb Caryotype à haute résolution : bandes/lot haploïde de chromosomes 1 sous-bande chromosomique : pb Identification de micro-remaniement de 4-5 Mb La déspiralisation induit une augmentation du nombre de bandes et donc a une augmentation de la résolution. Ici, l'image de 3 chromosomes 7 en fonction du nombre de bandes Ici les chromosomes 1, 2 et 3 avec 3 types de résolution. 6/16

7 C. Cytogénique moléculaire Génétique médicale Techniques d'étude en cytogénétique Ces techniques vont être le 1er pas entre le chromosome et l'adn. Principe : I. Le FISH Le FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) repose sur l'hybridation de séquences spécifiques marquées sur un génome entier : centromères, régions sub-télomériques, loci spécifiques et teintures. Cette technique permet de détecter des délétions et identifier des translocations ou d'autres réarrangement chromosomiques. Il y a 2 types d'approche en FISH : l'approche ciblée qui est concentrée sur une région et une approche globale qui va tester tout le génome La cible de cette technique va être le chromosome ou le noyau inter-phasique. Pour cela, on va utiliser des sondes d'acides nucléiques complémentaires d'une séquence donnée, soit sur des noyaux interphasiques, soit sur chromosomes ou des panchromosomiques en métaphase, soit par des techniques de mband FISH, qui vont, sur un chromosome, créer un banding en couleur. Le principe de la technique d'hybridation in situ en fluorescence avec des sondes froides (FISH) est basé sur le fait que l'adn est une molécule double hélice formée de deux brins complémentaires. 1/ Étape de dénaturation : Ces deux brins peuvent être séparés par la chaleur et/ou par un traitement acide alcalin. 2/ Étape d'hybridation : Une sonde d'acides nucléiques contenant une séquence complémentaire au simple brin d'adn, peut alors former un hybride spécifique avec l'adn simple brin. 3/ Étape de révélation : Cette sonde est marquée directement ou indirectement avec un ou plusieurs fluorochromes, l'hybridation des séquences nucléiques complémentaires peut être visualisée en fluorescence après contre coloration du support (chromosome ou noyaux). 7/16

8 8/16

9 Image 1 : On voit 2 spots rouges. Il s'agit probablement de 2 sondes centromériques. S'il y avait eu 3 spots, on aurait eu une trisomie. Image 2 : On utilise 2 sondes spécifiques d'un locus donné. On a un spot rouge, un spot vert et un spot rouge et vert. Il y a donc eu une translocation qui a mis à coté les deux séquences rouge et verte. Image 3 : On utilise des sondes télomériques (on est donc en métaphase). Image 4 : On utilise des sondes de peinture chromosomique qui permettent de peindre tout un chromosome. Sondes centromériques : ici du chromosome X (le grand, en vert) et Y (le petit, en rouge) Quand il y a 2 verts, on a une fille. Quand il y a 1 vert et un rouge, on a un garçon Sondes locus spécifiques : Elles sont intéressantes pour mettre en évidence des translocations. 9/16

10 Sondes break apart : Ce sont deux sondes qui sont situées sur le même chromosome sur un même gène. Lorsqu'il y a un réarrangement du gène, les sondes vont se retrouver séparées. Applications cliniques : Quel examen cytogénétique prescrire à bon escient? Il faut une bonne corrélation entre le clinicien et le biologiste. La place de la FISH par rapport aux autres techniques : Est ce que c'est du domaine de la recherche clinique ou du diagnostic en routine? Anomalies cryptiques au caryotype : C'est une anomalie que l'on ne voit pas sur le caryotype car il y a une intersection entre les chromosomes de 2 bandes de même taille et de même couleur. Ici, la translocation du chromosome 12 à 21 passe inaperçu. FISH : avantages et inconvénients : Avantages Technique sensible (marche pour les noyaux et en métaphase) Grand choix de sondes (commerciales ou «fait maison») Inconvénients Technique lourde nécessitant des traitements différents selon la nature de l'échantillon à analyser (métaphases, noyaux, tissus) Analyse ciblée : nécessité d'avoir une idée préalable de la région chromosomique ou du gène à étudier 3 cibles maximum par test 10/16

11 Multi FISH : C'est une technique permettant de colorier tous les chromosomes. On utilise 5 fluorochromes différents et grâce à diverses combinaisons, chaque mélange va être spécifique de chaque paire chromosomique. Technique du mband FISH : On a une combinaison unique de fluorochromes spécifiques de chaque banding d'un chromosome donné. On a donc un mélange de sondes sur un chromosome qui permet de marquer toutes les séquences du chromosome. C'est une technique assez peu utilisée. II. Le CGH métaphasique C'est une approche complètement différente, on extrait l'adn du patient et aussi de l'adn de référence, on va utiliser des métaphases standards et on va hybrider l'adn de référence mélangée à l'adn du patient en sachant que l'un et l'autre sont marqués de couleurs différentes. Il va donc y avoir une compétition pour la fixation sur les chromosomes. On marque ici l'adn de référence en rouge et l'adn du patient en vert. S'il n'y a pas d'anomalie, les chromosomes seront uniformément rouges et verts. S'il y a une anomalie, il n'y aura que du rouge si on a une perte et que du vert si on a un gain. 11/16

12 Le CGH mesure le rapport de fluorescence en chaque point du chromosome et va permettre de comparer le nombre de copies de segments chromosomiques entre un patient et une référence. Avantages et inconvénients du CGH métaphasique : Avantages Analyse globale du génome Inconvénients Faible niveau de résolution (il faut au moins 5 à 10 Mb) => 3Mb Détecte mal les mosaïques cellulaires, le seuil de détection est supérieure à 50% Ne détecte pas des remaniements chromosomiques équilibrés FISH et CGH : limites des techniques Comment faire une analyse globale du génome et augmenter la résolution? Hybrider de nombreuses sondes sur un échantillon? Hybrider un échantillon sur de nombreuses sondes? 12/16

13 III. Les puces à ADN Ce sont des petites surfaces solides dans lesquelles un grand nombre de sondes ont été fixées. Il existe différents types de puces à ADN (DNA arrays, DNA chips, DNA micro-arrays ou micro arrays) : BAC-array = sondes de BACs (= chromosomes artificiels de levures) DNA-array de faible densité (quelques centaines à quelques milliers de sondes) et de haute densité (plusieurs milliers de sondes) Puces «pangénomiques» qui vont tester l'ensemble du génome. Puces «à façon» qui ciblent une fonction biologique ou une pathologie. Principe du CGH-array : C'est un principe biochimique d'hybridation complémentaire ADN/ ADN ou ARN/ARN On va co-hybrider des séquences d'adn (ou ARN) test et témoin que l'on va marquer par fluorescence sur un grand nombre de locis spécifiques présents sur un support solide (lame de verre). L'identification de pertes ou de gains d'adn au niveau des loci spécifiques est connu sur un génome entier. Comme tout à l'heure, on marque l'adn de référence en vert et celui du patient en rouge et on va calculer les ratios de gains ou de pertes de chromosomes. Mais ici, on va utiliser des séquences beaucoup plus petites 13/16

14 Sondes : Ce sont des BACs/ PACs qui ont une résolution de kb. On a des puces ciblées, 3200 à clones (résolution 1 Mb), environ clones (tiling path array). On peut aussi utiliser des sondes d'oligonucléotides qui ont une taille entre 20 et 60 pb avec une densité très élevée. La résolution va dépendre du type et du nombre de sondes ainsi que de la distance entre chaque sonde (plus elles sont proches, plus la résolution va être bonne). Elle dépend aussi de la spécificité et la sensibilité de la réaction d'hybridation sur chaque sonde (rapport signal/bruit). Il existe 2 types de plate-forme : Plate-forme acgh Marquage double couleur (Cy3-Cy5) Comparaison de 2 ADNs (patient et référence) et identification de changement du nombre de copies (CNV) Marquage simple couleur Plate-forme SNP Absence d'adn de référence Identification de région de perte d'hétérozygotie (délétion) ou absence d'hétérozygotie (DUP, consanguinité) On utilise en service la sonde fléchée, le tableau n'est pas à apprendre 14/16

15 Analyse : L'analyse se fait grâce à un support bio-informatique qui va calculer le ratio de fluorescence (à l'aide de différents algorithmes) On a ensuite une visualisation graphique des résultats par l'observation de variations du nombre de copies (CNV) CNV : segment d'adn supérieur à 1 kb dont le nombre de copies varie par rapport à un ADN de référence, sans préjuger du caractère pathogène ou pas. Intérêts : Elle ne nécessite pas de mise en culture des cellules à analyser. Elle permet d'analyser l'adn de tout type de tissus. C'est une technique hautement résolutive (<150kb). Elle permet une analyse pangénomique qui ne nécessite pas d'avoir une idée préalable de chromosomes impliqués. Applications : Corrélation du nombre de copies aux conséquences biologiques. Compréhension de certaines maladies. Comparaison entre un tissu sain et un tissu tumoral. Étude du génome des patients atteints d'une même pathologie et compréhension des mécanismes géniques. Inconvénients : Les anomalies chromosomiques équilibrées ne sont pas détectables. Le polymorphisme : on voit une anomalie mais on ne peut pas savoir si cette anomalie est pathogène ou non. Elle ne détecte pas les mosaïques très faibles. Ce sont des plateaux techniques onéreux. Indications post-natal : Caryotype conventionnel +/- FISH Infertilité masculine Fausses couches spontanées répétées Aménorrhée primaire, ménopause précoce Retard de croissance Retard pubertaire Ambiguïté sexuelle Enquête familiale Caractérisation d'un CNV Maladies cassantes de l'adn (cassure spontané ou en présence d'agents, très liées au cancers ou prédisposant pour le cancer) 15/16

16 ACPA Retard mental avec ou sans malformation, dysmorphie faciale Malformation sans retard mental (cardiaque, rénales, squelettiques...) TED, troubles neuropsychiatriques Indications cytogénétiques Remaniement chromosomiques apparemment équilibré de novo Chromosomes surnuméraires euchromatiques Caractérisation d'anomalies chromosomiques. D. Conclusion 16/16