GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire. Cytogénétique Moléculaire

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1 10/12/2013 GUIMERA Jordan L2 Génétique Médicale Pr. LEVY Relecteur n 3 10 pages Plan A. Introduction B. Hybridation in situ en fluorescence I. Principe II. Les Sondes III. Les Cibles IV. Les étapes V. Utilisation de la FISH VI. Les limites VII. Multi-fish Cytogénétique Moléculaire C. Hybridation génomique comparative métaphasique (CGH) D. CGH sur microréseau d'adn : ACPA I. Principe II. Les sondes III. Analyse IV. Interprétation V. Intérêts VI. Limites Génétique et société : Levy nous remercie pour le téléthon!!! A. Introduction Ce cours fait suite au cours de génétique chromosomique du 06/11. Dans celui-ci on avait parlé des anomalies chromosomiques et des différents caryotypes qui avaient une résolution de 5 Mb maxi, ici nous allons voir les autres techniques qui permettent d'augmenter la résolution pour détecter de plus petites anomalies. La cytogénétique conventionnelle étudie le caryotype standard et le caryotype à haute résolution et on est à 5 Mb au maximum. En cytogénétique moléculaire, on sera à des résolutions de l'ordre de la centaine de kb, et c'est tout ce qu'on ne voit pas au niveau chromosomique dans un caryotype standard. B. Hybridation in situ en fluorescence FISH. I. Principe Elle est basée sur l'hybridation moléculaire. L'hybridation moléculaire est le principe le plus extraordinaire jamais découvert en biologie, et on ne sait toujours pas comment il fonctionne. Elle possède 2 propriétés : Dénaturation = séparation des 2 brins d'une molécule d'adn, c'est pour que la sonde simple brin reconnaisse sa séquence cible. Renaturation : ré-association spécifique d'une molécule d'adn simple brin avec sa séquence complémentaire. 1/11

2 Cela se fait dans certaines conditions de température, de ph et de salinité. Dans l'hybridation moléculaire, les molécules sont dénaturées, dé-associées, et à ce moment là, on obtient un support où toutes les molécules sont simples brins, et notre fragment d'adn va pouvoir ainsi s'hybrider. Si la sonde que l'on veut voir s'hybrider est reconnue par une sonde fluorescente, on aura une hybridation in situ en fluorescence car cette sonde marquée sera visible en microscopie à l'aide de filtres spéciaux. II. Les Sondes Ce sont des séquences d'acides nucléiques marquées par un ou plusieurs fluorochromes : Différents types : Séquences spécifiques d'adn répétées (ex : centromère ou les télomères (TTAGGG) ou les séquences des chromosomes acrocentriques correspondant aux séquences ribosomales) Séquences uniques : locus spécifique (analyse d'une petite partie du chromosome, un point) ou peintures chromosomiques (permettant de marquer et d'analyser la totalité d'un chromosome). Marquage : introduction des fluorochromes dans un fragment d'adn. Random priming Nick translation Les deux derniers noms n'ont pas été traités mais étaient sur la diapo. Les sondes centromériques sont de type ADN satellite. Il existe aussi des sondes télomériques et acrocentriques. III.Les Cibles Les cibles peuvent être plusieurs choses : Les chromosomes métaphasiques (les mêmes que ceux des caryotypes) Les noyaux (donc chromosomes interphasiques) Les fibres d'adn étirées (peignage moléculaire) Selon la cible que l'on choisit d'analyser, on ne recherche pas les mêmes choses : - Sur les chromosomes métaphasiques, on va rechercher des anomalies de structure et des anomalies locus spécifiques. - Sur les chromosomes interphasiques, on va pouvoir repérer des anomalies de nombre car l'on peut quantifier la quantité de fluorescence mais aussi des anomalies de structure comme des translocations mais également les translocations réciproques. De plus, il faut avoir en tête qu'une sonde peut s'hybrider de façon non spécifique avec une cible non voulue : pour remédier à ça, on fait des lavages afin d'éliminer tout ce qui n'est pas spécifique. (Je suppose qu'au moins c'est spécifique, au moins l'accrochage est solide) IV. Les étapes 4 étapes : Dénaturation ADN simple brin Hybridation appariement si séquences complémentaires Lavage et révélation avec des conditions et paramètres de stringence particuliers pour éviter justement ces problèmes d'hybridation non spécifique. Analyse avec un microscope équipé de filtres à fluorescence. On peut avoir par exemple des sondes rdna qui vont marquer alors la totalité des chromosomes acrocentriques 2/11

3 ou alors une sonde télomérique. V. Utilisation de la FISH La FISH permet de faire des analyses ciblées : GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire Selon une orientation clinique, c'est à dire basée sur une anomalie clinique, un syndrome observé lors de la consultation, et en fonction du diagnostic recherché, on va chercher telle ou telle anomalie. Cela peut être : Recherche d'une aneuploïdie en prénatal ou en postnatal (ex trisomie 21) Syndrome microdélétionnel/microduplication (il a dit tout plein de noms de maladie compliqués, mais on s'en fou, car ils sont fous ces généticiens) Recherche de remaniement subtélomérique (avec des sondes spécifiques) Selon une orientation cytogénétique : on fait suivre un caryotype standard/à haute résolution par une FISH pour faire des analyses plus fines : Caractérisation d'une anomalie chromosomique Identification d'un chromosome surnuméraire Identification et évaluation d'une mosaïque cellulaire (si l'anomalie chromosomique clonale est faiblement représentée) Contrôle des données issues de l'acpa (Analyse Chromosomique sur Puce à ADN): mécanique chromosomique à l'origine du CNV (Copy Number Variation) observé. VI. Les limites Expertise clinique, on ne connait pas la totalité des syndromes, et lorsqu'on est pas en mesure de porter un diagnostic, dans ce cas là, on ne peut pas cibler l'analyse. Cette situation est très fréquente (presque tous les jours) car il y a beaucoup de maladies rares. Connaissance des régions minimales critiques des syndromes suspectés. Etudes des régions subtélomériques : délicat car la composition chimique des séquences subtélomériques ne permet pas de faire une analyse aisée, en plus, c'est coûteux technique abandonnée au profit de l'acpa Microduplication ( pb) : identification délicate, nécessite l'utilisation de techniques ayant une résolution encore plus fine (on passe dans la génétique moléculaire ) VII. Multi-fish (note du prof : je l'ai mis parce que c'est joli) Même si vous n'aurez pas les couleurs sur le ronéos hihi Hybridation simultanée et spécifique de 24 peintures chromosomiques. Combinaison de 5 fluorochromes. Numérisation successive des différents signaux émis par les sondes et superposition de l'ensemble des signaux. On obtient une couleur spécifique pour chacun des chromosomes. Si on remarque que sur un même chromosome il y a plusieurs couleurs, c'est qu'il y a une anomalie (type translocation). 3/11

4 Avantages : Analyse globale du génome avec une meilleure résolution que le caryotype standard Remaniements chromosomiques complexes Insertions chromosomiques Marqueurs chromosomiques Limites : Niveau de résolution : 1,5-2 Mb au mieux Coût (les consommables sont chers : «En GM, on génère du déficit, et on le sait!» ) On s'en fou de cette diapo. Le caryotype haute résolution peut trouver des anomalies de 4 à 5 Mb donc des microdélétion sou des microduplications. FISH : Résolution : 40 à 100 kb. Inconvénient : analyse ciblée Orientation clinique Orientation cytogénétique => Nécessité de développer d'autres techniques d'identification d'anomalies chromosomiques de petite taille. Sur cette image, on peut voir une trisomie 18 (3 chromosomes 18 sont marqués). Le marquage simultané des chromosomes X a une valeur de CONTRÔLE (on marque un autre chromosome dont on sait qu'il a de très faibles risques d'être anormal) : il fait office de témoin, de contrôle interne. 4/11

5 C. Hybridation génomique comparative métaphasique (CGH) Il ne nous en a pas trop parlé, car c'est plus trop utilisé. Elle est basée sur de l'hybridation moléculaire. Le principe est qu'on mesure le rapport de fluorescence entre l'adn du patient et l'adn témoin, et ceci en chaque point du chromosome. Le tout est sur un support solide, c'est-à-dire une lame où sont étalés les chromosomes (avant on le faisait aussi sur des chromosomes métaphasiques). D'un coté, on a l'adn d'un témoin qui va être utilisé comme sonde que l'on va marquer en rouge. On prend l'adn du malade que l'on marque d'une autre couleur. On va les combiner, et on va comparer le nombre de copies des segments chromosomiques entre le patient et la référence. On procède ainsi à la détection d'une perte ou d'un gain de matériel chromosomique. - Lorsque le rapport de fluorescence est égal à 1, il y a la même quantité d'adn, il n'y a ni perte ni gain, il y a autant d'adn chez le témoin que chez le patient. - Lorsque le rapport P/T est égal à 0,5, il y a une perte de matériel génétique chez le patient, on a affaire à une délétion. - Lorsque le rapport P/T est égal à 1,5, il y a un gain de matériel génétique chez le patient, on a affaire à une duplication. Les délétions/duplications peuvent être visibles ou alors on peut s'aider de logiciels pour les repérer. 5/11

6 Avantages : Analyse globale du génome : visualisation + analyse ADN génomique, chromosomes du cas index inutile Limites : Faible niveau de résolution : 5-10 Mb jusqu'à 3 Mb. Seuil de détection des mosaïques cellulaires (il doit y avoir au moins 50% de cellules anormales) Remaniements chromosomiques équilibrés (ni gain ni perte) Technique délicate D. CGH sur microréseau d'adn : ACPA I. Principe Même technique de départ, c'est à dire le rapport de fluorescence. Le support devient une lame de verre où est positionné le génome entier mais de façon fragmenté analyse complète. Ces lames contiennent des dizaines de millions de spots correspondant chacun à une séquence du génome. Ces séquences font de 16 pb à quelques dizaines de kb. Elles ont donc beaucoup plus courtes que pour le CGH classique. Les sondes utilisées sont de l'adn témoin plus l'adn du malade. Les rapports de fluorescence sont toujours de 1, 1,5 ou 0,5. On est obligé d'utiliser un logiciel qui fait toutes les analyses car les délétions/duplications sont invisibles à l'oeil nu : celui-ci va nous donner le rapport P/T de chaque région et va faire un pointage où il y a une anomalie. 6/11

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8 Chaque carré rassemble plusieurs milliers de séquences, et sur toutes ces lames, on a la totalité du génome. 8/11

9 L'exemple ci-dessus, c'est une ACPA avec des cellules tumorales : c'est très couramment pratiqué. Il peut y avoir des délétions et des duplications, y compris en même temps. Même lorsqu'on fait des analyses sur l'adn constitutionnel de l'individu, on va avoir des pertes et des gains de matériel génétique. C'est très important car ceci montre que toutes les pertes et les gains de matériel chromosomique ne sont pas pathogènes. II. Les sondes On utilise des lames où sont fixés des séquences génomiques, les sondes BACs/PACs (Chromosome Artificiel Bactérien, ce sont des chromosomes bactériens, des vecteurs dans lesquels on met de l'adn humain qui peut faire jusqu'à 200 kb) kb Il y a des puces ciblées qui contiennent entre 3200 et 3500 clones (résolution 1 Mb), clones (tiling path array) Oligonucléotides pb Densités élevées : 44K 2,1M, résolution jusqu'à 1 kb, donc repère mieux les petites anomalies. Puces ciblées ou pangénomiques On peut aussi demander des puces qui nous intéresse, les faire préparer sur-mesure. La résolution est fonction de : la sonde : type (taille), nombre, distance la spécificité et la sensibilité de la réaction d'hybridation sur chaque sonde (rapport signal/bruit) 9/11

10 III. Analyse Utilisation d'un support bioinformatique : Calcul du ratio de fluorescence (différents algorithmes) On enlève tout ce qui n'est pas spécifique, comme par exemple les centromères. Visualisation graphique des résultats 1 point = valeur du ratio de fluorescence au niveau d'une sonde Observation de variations du nombre de copies (CNV) entre P et T. CNV : segment d'adn >1kb dont le nombre de copies varie par rapport à un ADN de référence, sans préjuger du caractère pathogène ou pas. On se réfère à notre expérience et aux bases de données pour déterminer ce caractère pathogène. IV. Interprétation Critères d'interprétation : Taille (pathogène si > 400kb) Caractère de novo ou hérité, c'est très important, lorsqu'on a un CNV, et que l'on fait l'analyse et qu'aucun des 2 parents sains ne l'ont, c'est un critère supplémentaire de pathogénicité. Type Contenu génique Phénotype clinique associé : sain/pathologique Description dans la population générale (d'où l'utilisation de base de données) Description de patients présentant le même phénotype clinique Puis validation et interprétation. Vérification des résultats obtenus grâce à différentes techniques de biologie moléculaire ou de FISH. Signification du CNV observé : Ne pas préjuger de sa pathogénicité mais il peut être pathogène avec une possibilité de pénétrance incomplète et d'expressivité variable, il peut être bénin, ou alors de signification complètement inconnue. V. Intérêts (retenir que les indications sont multiples) Pour les patients présentant un retard mental avec plus ou moins des malformation congénitales à caryotype normal : identification d'un CNV pathogène dans environ 17-19% (versus 3-4% pour le caryotype) CNV répartis sur l'ensemble du génome, il y a plus de délétions que de duplications. Localisation interstitielle 2 à 3 fois plus élevée qu'au niveau subtélomérique Récurrence faible des CNV (sauf architecture «particulière» du génome) Taux de détection d'anomalie 5 fois plus élevé que les techniques cytogénétiques conventionnelles. Les mosaïques cellulaires : taux de détection de 20%, mais il n'y a pas de biais lié à la culture cellulaire. Description de nouveaux phénotypes cliniques. Caractérisation d'anomalies chromosomiques fines (taille inférieure à 5 Mb) Etude des remaniements chromosomiques apparemment équilibrés mais avec phénotype anormal : représente 20% des déséquilibres identifiés. Identification de gènes. Il n'a fait que passer rapidement ces diapos, sans trop les détailler mais il en aurait parlé pendant le cours... 10/11

11 VI. Limites de l'acpa Polyploïdie Remaniements chromosomiques équilibrés car il n'y a ni gain, ni perte Mécanisme à l'origine du déséquilibre observé, pour le conseil génétique (intérêt du contrôle par FISH si possible) Il faut toujours faire un contrôle, c'est capital. Ca se fait par la FISH ou par génétique moléculaire. 11/11