du grade de maître ès sciences (M.Sc.)

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1 IMPACT DES LIPIDES SUR LA DIGESTION DES PROTÉINES : UNE APPROCHE IN VZTRO Mémoire Présenté à la Faculté des études supérieures de l'université Laval pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.) Département des sciences des aliments et de nutrition FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION UNIVERSIT* LAVAL NOVEMBRE Jocetine Piché, 1997

2 of Canada du canada Acquisitions and Bibliographie SeMces Acquisitions et services bibliographiques 395 Wellington Street 395. rue Weflington OttawaON K1AON4 OttawaON K1AON4 Canada Canada The author has granted a nonexclusive licence dowing the National Library of Canada to reproduce, loan, distribute or sell copies of this thesis in microform, paper or electronic formats. The author retains ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts fkom it may be printed or otherwise reproduced without the author's permission. L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la fome de microfiche/fïlm, de reproduction sur papier ou sur format électronique. L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimes ou autrement reproduits sans son autorisation.

3 REMERCIEMENTS Au terme de ce cheminement académique, c'est avec une vive émotion que je désire exprimer ma gratitude à ceux et celles sans qui ce projet de recherche aurait été irréalisable. Mes premiers remerciements sont pour le Dr Laurent Savoie, mon directeur de maîtrise, dont j'ai pu apprécier l'intégrité, les compétences professionnelles et la bienveillance. C'est avec beaucoup de compréhension et une constante disponibilité qu'il m'a guidé tout au long de mes études de 2' cycle. Je remercie très sincèrement madame Nahalie Mercier pour sa précieuse contribution à la planification et à la réalisation des protocoles de recherche. Sans son expertise et sa patience, mon séjour dans le monde de la recherche fondamentale aurait été impossible. Je suis aussi redevable de judicieux conseils à Monsieur Guy Parent, dont la diversité des connaissances et l'amabilité ont été grandement appréciées pendant ces années universitaires. Aux étudiantes Marylène, Élyse et Claudia, je tiens à signifier toute ma reconnaissance pour leur collaboration au cours de ce projet. Je profite de l'occasion pour remercier Stéphanie, Hélène, Richard, Amie et Johanne, dont les nombreux encouragements ont ensoleillé les jours difficiles et mes collègues Lucie, Konstantinia et Marthe pour leur gentillesse et leurs conseils. Des remerciements très particuliers vont aux professeurs(es) du département de Nutrition. L'encadrement, la qualité de l'enseignement et l'empathie qu'ils m'ont offerts dès le baccalauréat, font de mes années universitaires une expérience inoubliable. Je ne peux passer sous silence la délicatesse et la générosité de Lise et le support des secrétaires du département; à vous toutes un grand merci. Enfin, je désire exprimer ma reconnaissance et toute mon affection à ma famille qui a encouragé œ retour aux études et à Éric dont le soutien affectif et logistique ont été inestimables. La réalisation de ce projet a 605 rendue possible grâce à un programme de subvention de recherche à incidence industrielle du Conseil de Recherches en Sciences Naturelles et en Génie (octroi no ) et de Effem Foods Ltd. (Canada), de même que de la fondation Joseph-Rhéaume.

4 Les lipides alimentaires entraînent d'importantes modulations al* cours du processus digestif mais leur influence sur la digestion des mmo-nutriments demeure mal connue. Ceae étude visait A mesurer l'impact potentiel des Iipides sur l'hydrolyse enzymanque des protéines à l'aide d'une technique in vitro : la cellule digestion. Nous avons démontré i'absence d'effet des lipides sur h phase peptique de digestion de la caséine. Le maintien de la capacité hydroiytique de la lipase pancréatique a nécessité l'ajout de sels biliaires et la reformulation de la composition du tampon utilisé. La capacité de diffusion des acides aminés & travers la membrane à dialyse et l'activitt5 des enzymes protéolytiques n'ont pas été affkcth par ces modifications dors que la digestiibilité de la caséine a été légèrement (10%)&favori&. La présence de niveaux croissants d'huile de mas n'a causé aucun effet significatif sur la digestibilité protéique et celle des acides aminés de la caséine. Toutefois, étant donne que dans ces conditions expérimentales aucun acide gras n'a été détecté dans le milieu de digestion, des modifications sont suggérées la procédure pour assurer la digestion simultanée des protéines et des triglycérides.

5 TABLE DES MA~RES REMERCIEMENTS... paee i LISTE DES TABLEAUX... vi LISTE DES FIGURES... vii... LISTE DES ABRÉVIATIONS... vil1 INTRODUCTION... x 1.1 Les rnacro-nutriments et le processus digestif Phase gastrique Phase intestinale I GIucides Proteines l. 2.3 Lipides Impact des lipides alimentaires sur le processus digestif Sécrétions homonales et biliopancréatiques Temps de réaction... Il Digestibilité des protéines I 1.3 Bilan de la revue de la litterature Niveaux d'impact des Iipides alimentaires sur la digestion des protéines Impactdirect Impactindirect Mesure de l'impact des lipides alimentaires sur l'hydrolyse #. des proteines Hypothèse et objectifs MATÉRIELET~II~THODES CHAP~II 2.1 Liste des produits chimiques utilisés Digestion in vitro Analyses chimiques... 26

6 Dosage des groupements a-aminés libres Dosage des activités enzymatiques Lipase Trypsine Chymotrypsine Dosage des acides gras libres Détermination du contenu en azote protéique Analyse des acides aminés 29 Analyses statistiques Expérimentation I Mesure de l'impact des lipides sur l'hydrolyse peptique de la caséine Établissement de la concentration de sels biliaires Mesure de l'activité Iipasique... de la pancréatine en présence de sels biliaires Mesure de la capacité d'hydrolyse de la lipase pancréatique Mesure de I'impact des lipides sur la capacité de difision des acides aminés libres Mesure de l'impact des nouveaux paramètres sur I'activité des enzymes protéolytiques et sur la mesure des produits de digestion C. de la caselne Expérimentation II Mesure de l'impact des lipides sur la cinétique d'hydrolyse et le taux de libération des produits de digestion de la caséine Expérimentation Impact des lipides sur I'hydrolyse peptique de la caséine Choix de la concentration de sels biliaires Activité lipasique de la pancréatine en présence de sels biliaires......,...~ Capacité d'hydrolyse lipidique de la pancréatine Impact des lipides sur la capacité de difision des acides aminés libres Impact des nouveaux paramètres sur l'activité des enzymes protéolytiques et sur la mesure des produits de digestion 0... de la caselne Expérimentation II Impact des lipides sur la cinétique d'hydrolyse et le taux de libération des produits de digestion de la caséine CHAPITRE IV DISCUSSION ET CONCLUSION Choix de la technique de digestion... 52

7 Page Modifications des paramètres enzymatiques de la technique de la cellule à digestion Impact des modifications apportées à la technique de la cellule à digestion Expérimentation II Impact des lipides sur la digestibilité de la caséine Interprétation des résultats. analyses et rnodifi~cationsubséquentes Conclusion RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES... 63

8 LISTE DES TABLEAUX Tableau 2.1 Tableau 2.2 Tablau 3.1 Tableau 3.2 Tableau 3-3 Tableau 3.4 Tableau 3.5 Tableau 3.6 Tableau 3.7 Tableau 3.8 Tableau 3.9 Liste des produits chimiques et des fournisseurs correspondants Composition en acides aminés de la caséine utilisée Impact des lipides sur l'hydrolyse (groupements a-aminés libérés) de la caséine après 30 minutes de digestion peptique Hydrolyse de l'huile de maïs par la pancréatine en milieu fermé Activité des enzymes protéooiytiques dans les conditions standards et modifiées de digestion in vino Digestibilité protéique et des acides aminés de la caséine dans les conditions standards et modifiées après 6 heures de digestion pandatique Digestibilité cumulative de la caséine en fonction du temps de digestion pancréatique en présence de lipides Digestibilité (%) cumulative des acides aminés de la caséine après 2 heures de digestion pancréatique en présence de lipides Digestibilité (%) cumulative des acides aminés de la caséine après 4 heures de digestion pancréatique en présence de lipides Digestibilité (%) cumulative des acides aminés de la caséine après 6 heures de digestion pancréatique en présence de lipides Activité lipasique de la pancréatine au cours de la digestion de la caséine en présence de lipides

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10 LISTE DES ABRÉVIATIONS Alpha ALA ARG ASP CANA CCK CDA COR CMC DAF DAI GLU GLY HIS ILE LAHPO LEU LSMeans LYS MET MJ N PHE Alanine Arginine Acide aspartique Couche aqueuse non agitée Cholécystokinine Coefficient de digestibilité apparente Coefficient de digestibilité réelle Concentration micellaire critique Digestibilité apparente fécale Digestibilité apparente iléaie Acide glutamique Glycine Histidine Isoleucine Hydroperoxydes d'acide linoléique Leucine Least square rneans Lysine Méthionine Millijoule (4.18 Joules / calorie) Azote Phénylalanine

11 PRO Proline SER SP TGHPO THR TYR VAL Sénne hoduits de dégradation secondaires Hydroperoxydes dliuile de carthame Thréonine Tyrosine Vahe

12 INTRODUCTION Les recommandations quant au pourcentage de l'apport énergétique à ingérer sous forme de lipides ont été relativement variables au fil des ans, passant de 25% en 1967 (Conseil Canadien de la Nutrition, 1967) à au moins 15% en 1983 (Canada. Santé et Bien-être social, 1983) pour être fixées à un maximum de 30% en 1990 (Canada. Santé et Bien-être social, 1990). Les lipides alimentaires ont, par ailleurs, été associés à de nombreux problèmes de santé tels l'obésité, le diabète, le cancer et les maladies cardio-vasculaires (Spiller, 1996). Le sort des lipides alimentaires après leur absorption et particulièrement leur influence sur la composition et le métabolisme des lipides plasmatiques suscitent, depuis des décennies, l'intérêt de la communauté scientifique et plus récemment de la population en général, aimée par leur association avec les maladies cardio-vasculaires. Selon les Recommandations sur la nutrition (Canada. Santé et Bien-être social, 1990) : "La première relation entre régime et maladie à influencer sensiblement les directives sur la nutrition a été l'association entre l'ingestion de lipides et les maladies du coeur". Due à cette étroite relation entre les lipides plasmatiques et les maladies cardio-vasculaires, I'influence des lipides alimentaires sur le métabolisme lipidique a éclipsé l'importance de son impact sur le processus digestif. De nombreux groupes de chercheurs ont pourtant démontré, chez l'humain, que les lipides alimentaires ont une influence majeure sur le processus digestif et, par conséquent, sur la digestion des nutriments : stimulation de la libération de cholécystokinine et de la sécrétion biliopancréatique, inhibition de la vidange gastrique et modulation du temps de transit des aliments dans l'intestin grêle. Cependant, de nombreuses incertitudes subsistent sur les mécanismes impliqués. Il nous est donc apparu nécessaire, étant donné les récentes recommandations visant l'apport lipidique dans le régime et la controverse que suscitent les gras alimentaires, de chercher à mieux comprendre les implications nutritionnelles d'une variation de la quantité ou de la nature des lipides ingérés. Compte tenu de la tendance actuelle à mmer les apports en gras du régime, il est étonnant qu'on ne retrouve pas d'études systématiques menées afin d'évaluer les conséquences potentielles de telles modifications sur les autres nutriments du régime, en I'occurrence, sur les protéines.

13 La littérature o h peu d'études traitant de l'impact des lipides sur la digestion des protéines et les variations observées demeurent inexpliquées. Nous avons choisi d'évaluer cet impact sur la digestibilité des protéines à partir d'un système de digestion in vitro, connu sous le nom de la cellule à digestion. Cette technique mesure spécifiquement la forme et la cinétique d'apparition des acides aminés libérés suite à l'hydrolyse de sources protéiques variées. EUe permet d'analyser l'effet de divers traitements sur la digestibilité des protéines et de differencier les conséquences physiologiques et biochimiques. Cette approche comporte évidemment certaines limites comparativement aux méthodes in vivo, mais elle permet d'isoler chacune des composantes, soit protéique et lipidique, ce qui représente un avantage dans le cadre de la recherche qui nous intéresse. Le chapitre 1 de ce mémoire présente la revue de la iïttérahue traitant de l'impact des lipides sur le processus digestif et la digestibilité des protéines, de même que l'hypothèse et les objectifs. Le chapitre II comprend la description des analyses chimiques effectuées et la méthodologie appliquée à la réalisation des protocoles de l'expérimentation I et II, lesquels correspondent à nos deux objectifs spécifiques. Le premier objectif vise la modification des paramètres enmatiques de la technique de la cellule à digestion afin d'y incorporer des lipides. Le second volet concerne le deuxième objectif, soit l'application de la technique modifiée à un protocole de digestion simultanée des protéines et des lipides. Les résultats de nos travaux sont exposés au chapitre III et le chapitre N porte sur la discussion et la conciusion.

14 CHAPITRE I REVUE DE LA LITTÉRATURE 1.1 Les macro-nutriments et le processus digestif La digestion est, à toute fin pratique, l'hydrolyse enzymatique de macromolécules en molécules plus petites pouvant être absorbées. Une série d'étapes séquentielles se produisent selon la progression des aliments dans le tractus gastro-intestinal, de la bouche au côlon. Ces étapes comprennent (1) la réduction de la taille des particules, permettant une augmentation de la surface des matériaux solides, (2) la conversion des aliments en une suspension aqueuse isotonique, (3) l'émulsion des lipides hydrophobes, (4) la digestion enzymatique de larges macromolécules en petits fragments, et (5) I'absorption des produits de digestion de faibles poids moléculaires à travers les cellules épithéliales de l'intestin (Van Dyke, 1989). De nombreux facteurs sont susceptibles d'influencer le taux et le degré d'absorption des nutriments dont le mode d'ingestion, la forme et la composition des aliments, la vidange gastrique, le temps de transit dans l'intestin grêle et la capacité digestive des sécrétions pancréatiques et biliaires Phase eastriaue Dans la bouche, les aliments sont mastiqués et mélangés à la salive qui contient de l'eau, des électrolytes et des protéines dont l'a-amylase salivaire. Ses propriétés sont comparables 2 ceiles de l'a-amylase pancréatique et elle initie la digestion des glucides en hydroiysant les liaisons a-1-4 glucosides des amidons. La contribution de I'amylase salivaire à la digestion est cependant négligeable étant donné qu'elle est inactivée lorsque les sécrétions acides de I'estomac pénètrent le bol alimentaire. Après la déglutition, les aliments entrent dans I'estomac où ils subissent un broyage mécanique et sont solubilisés, acidifiés et homogénéisés. La sécrétion gastrique, sous contrôle nerveux et

15 hormonal, est composée d'eau, d'élec?rolytes, d'acide chlorhydrique et & protéines, dont le pepsinogène. Une sécrétion continue dire «alcaline» est libérée par les cellules muqueuses et joue un rôle important dans la protection de l'estomac. L'acide chlorhydrique (HCI), sécrétk par les cellules pariétales de l'épithélium gastrique permet l'activation du pepsinogène en pepsine et la d6naîuration des molécules protéiques, les rendant plus aptes à l'hydrolyse par la pepsine. Cette protéase gastrique, dont le ph optimum est inférieur à 5, coupe la chaûie polypeptidique au niveau de la fonction amine d'un acide aminé aromatique (Bernier et coll., 1988). Dans les conditions physiologiques normales, les produits de la digestion peptique des protéines sont de larges polypeptides (Matthews, 199 1). L'environnement acide de l'estomac favorise egalement l'activité des lipases acides soit la lipase linguale et la lipase gastrique. Ces enzymes hydrolysent plus efficacement les triglycérides à chaîne courte et moyenne que ceux à chaîne longue et leur ph optimum s'étend de 3 à 6 (Tso, 1994). Les lipases acides jouent un rôle important dans la digestion des lipides chez le nouveau-né, étant donné que I'activité de la lipase pancréatique n'est pas complètement développée chez ce groupe, de même que chez l'adulte atteint de fibrose kystique (Tso, 1994). Les produits de la digestion gasmque des lipides (des diglycérides et des acides gras), de même que les ondes péristaltiques de I'estomac aident à I'émulsification des lipides alimentaires, étape essentielle à leur hydrolyse subséquente par la lipase pancréatique Phase intestinale Le chyme acide quitte I'estomac de façon intermittente de la vidange gastrique, graduelle et coordonnée, laquelle dépend du type de repas et d'aliments : ceux qui sont dissous spontanément dans l'eau, les solides nécessitant un broyage et les lipides qui sont évacués plus lentement (Bernier et coll., 1988). Le rythme de la vidange gastrique est également influencé par le réflexe inhibiteur gastro-intestinal. En effet, l'évacuation gastrique est sensible à certains facteurs pouvant la ralentir dont I'hyper- ou Ibypo-osmolarité, le contenu en lipides ou le ph du contenu luminal du duodénum (Alpers, 1994). Lorsque le chyme acide entre dans le duodénum, il est mélangé avec les sécrétions intestinales et biiiopancréatiques. La sécrétion pancréatique, qui est sous l'influence d'un contrôle vagal et hormonal (Alpers, 1987), contient de l'eau, des chlorures de sodium et de potassium, des bicarbonates de même que les enzymes pancréatiques. Son ph, qui varie entre 7.6 et 8.2 (Bernier et coll., 1988) permet de neutraliser le chyme acide qui quitte I'estomac et de fournir un milieu intralurninal fonctionnel pour l'action des enzymes pancréatiques dont les amylases, les endo- et exopeptidases et les Iipases. Par

16 ailleurs, les échanges constants d'eau et d'électro'oiytes à travers l'epithélium intestinal assurent I'isotonicité du contenu luminai et des produits de digestion absorbés par l'intestin. Quant à la sécrétion biliaire, également sous contrôle vagal et hormonal, elle fournit, entre autres, les sels biliaires qui jouent un rôle majeur dans la digestion des lipides. Les sels biliaires possèdent une face iipophile et une face hydrophile et ils agissent comme détergents en se déposant tangentiellement aux interfaces huileeau, ce qui les stabilisent (Bernier et COL, 1988). La progression du chyme alimentaire dans l'intestin est assurée par les mouvements péristaltiques, contractions successives des fibres longitudinales et circulaires du grêle, et par le complexe migrant interdigestif. Celui-ci naît sous la forme d'une onde péristaltique dans l'estomac, se propage jusqu'au caecum mais est intenompu par la prise alimentaire (Bernier et coll., 1988). De plus, les mouvements de brassage des fibres circulaires permettent le mélange du chyme avec les enzymes pancréatiques et facilitent l'absorption intestinale des produits de digestion Glucides Les glucides digestibles représentent quotidiennement environ 50% de l'apport énergétique total du régime occidental et se composent principalement d'amidon, de saccharose, de lactose et de fructose (Alpers, 1994). Dans la lumière intestinale, I'a-amylase pancréatique coupe les chaînes de glucose de l'amidon en hydrolysant les liaisons a-1-4, produisant du maltose, du maltotriose et des a-dextrines-limites. Les produits de digestion de l'amidon de même que les oligosaccharides du régime tels le saccharose et le lactose sont hydrolysés par les oligosaccharidases de la bordure en brosse : la glucamylase, la sucrase-isomaltase, la lactase et la tréhalase. Les monosaccharides ainsi produits sont absorbés par simple diffusion et, plus efficacement, par différents systèmes de transports actifs spécifiques situés sur les membranes apicales et basolatérales des entérocytes (Van Dyke, 1989) Protéines Les protéines alimentaires fournissent les acides aminés nécessaires il la synthèse et au maintien des protéines corporelles et leur importance pour la survie des organismes supérieurs est indiscutable. Les protéines alimentaires doivent foumir les acides aminés essentiels, c'est-à-dire ceux ne pouvant être synthétisés par l'organisme. La digestibilité, la quantitd et la qualité des acides aminés constituants déterminent la valeur nutritive des protéines du régime (Freernan et Kim, 1978). Selon Galibois (1987), "la digestibilité réfêre au degré potentiel d'hydrolyse d'une protéine alimentaire ou au degré potentiel de libération de ses acides aminés". Par ailleurs, tous les acides aminés, en

17 proportion adéquate, doivent être présents dans les différents organes au même moment pour une synthèse protéique efficace (Savoie, 1991). De fait, la capacité des acides aminés à assurer cette synthèse dépendra non seulement de leur potentiel de libération mais aussi du moment relatif, les uns par rapport aux autres, où ils arrivent dans la lumière intestinale et éventuellement dans le sang. La digestion intestinale des protéines comprend la phase intraluminaie et la phase cellulaire (Matthews, 1991). L'entrée des produits de la digestion gastrique dans le duodénum stimule la sécrétion de cholécystokinine. Cette homone amène la libération par le pancréas d'un suc riche en proteases pancréatiques dont l'activité est initiée par l'entérokinase, une enzyme de la bordure en brosse qui agit sur le trypsinogène. Les enzymes protéolytiques du pancréas se divisent en deux groupes selon le site des liens hydrolysés; les endo- et les exopeptidases. Leur action est spécifique et complémentaire. La seule hydrolyse séquentielle est celle accomplie par les enzymes pancréatiques suivant l'action de la pepsine; les processus protéolytiques subséquents étant plus ou moins simultanés (Savoie, 1994). La trypsine, la chymotrypsine et I'élastase sont des endopeptidases qui hydrolysent les liens peptidiques à l'intérieur des chaînes. Les carboxypeptidases A et B sont des exopeptidases qui hydrolysent les liens peptidiques à l'extrémité carboxyle des chaînes. La trypsine coupe les liens peptidiques à I'extrémité carboxyle des acides aminés basiques, soit la lysine et I'arginine. La carboxypeptidase B complète l'action de la trypsine en libérant la lysine et I'arginine de la chaîne peptidique (Matthews, 1991). La chymotrypsine favorise l'hydrolyse des liens peptidiques dont le groupement carboxy 1 appartient à un acide aminé aromatique (phénylalanine, tyrosine, tryptophane) (Erickson et Kim, 1990). L'élastase hydrolyse I'élastine et coupe les liens peptidiques ayant des résidus aliphatiques neutres en position carboxyle (alanine, leucine, glycine, valine, isoleucine) (Erickson et Kim, 1990). La carboxypeptidase A Libère les acides aminés aromatiques et aliphatiques des peptides produits par l'action de la chymotrypsine et de I'élastase. L'action combinée des protéases pancréatiques convertit les protéines en un mélange d'acides aminés libres et d'oligopeptides. La séquence d'apparition des produits de digestion est variable dans le temps et fonction de l'acide aminé et de la protéine d'origine. Savoie et coll. (1988) ont observé qu'avec la caséine, la digesti bilité in vitro de certains acides aminés (arginine, tyrosine, lysine, méthionine, leucine, phénylalanine) était supérieure à 40 et 95% après 3 et 18 heures de prott5olyse respectivement. Avec le colza, la digestibilité de ces acides aminés était inférieure à 30% après 3 heures et seule la tyrosine et la méthionine présentaient 95% de digestibilité après 18 heures. La digestibilité de I'arginine et de la cystine qui s'élevait à 54 et 22% avec la caséine n'était que de 22 et 4% avec le

18 colza après trois heures. Savoie et cou. (1989) ont également étudié m Mm la séquence d'apparition des acides aminés de 19 sources protéiques végétales et animales. Ils ont observé, globalement, que les acides aminés cibles des enzymes pancréatiques (la tyrosine, la phénylalanine, la lysine et I'arginine) étaient plus facilement hydrolysés. Par ailleurs, en comparant les saucisses à déjeuner et la caséine, la digestibilité de I'acide glutamique a montré une variation de 19 à 35% et celie de la glycine de 19 à 52% après 6 heures de digestion. La cystine et la thréonine, deux acides aminés essentiels, ont été libérés plus faiblement mais à des degrés variés pour les différentes protéines. La phase inûaluminale de la digestion des protkines par les enzymes pancréatiques est une étape importante qui fournit des substrats adéquats pour l'absorption par les entérocytes ou pour l'hydrolyse subséquente par les peptidases de la bordure en brosse ou de la fraction cytoplasmique de I'entérocyte; c'est la phase ceilulake de la digestion des protéines. La fonction principale de la bordure en brosse de l'épithélium intestinal, en ce qui concerne l'assimilation des protéines alimentaires, est de recueillir le mélange d'acides aminés et d'oligopeptides produits par la digestion intraluminale. Trois mécanismes distincts sont impliqués dans ce processus : les acides aminés sont captés par les systèmes de transport des acides aminés; les di- et tripeptides sont captés par les systèmes de transport des peptides; les oligopeptides ayant plus de trois résidus d'acides aminés sont hydrolysés par les peptidases en produits absorbables (Adibi, 1985). Les systèmes de transport et les mécanismes d'absorption des acides aminés libres font encore l'objet de nombreuses controverses dans la littérature, reflétant la complexité du sujet. De nombreux auteurs ont tenté de classifier ces systèmes de transport présents dans la membrane de la bordure en brosse mais aucun consensus n'a encore été atteint (Munck, 198 1; Christensen, 1984; Hopfer, 1987; Ganapathy et coll., 1994). Selon Webb (1990), le nombre prkis de transporteurs d'acides aminés présents dans l'intestin n'est pas encore connu. Matthews (1991) a complété une analyse et une critique élégante de I'absorption des protéines. Il décrit six systèmes de transport des acides aminés : (1) un transporteur sodium-dépendant à haute affinite pour les acides aminés neutres qui refuse les acides aminés basiques, non a-aminés et iminés; (2) un transporteur sodiumdépendant à haute affinid pour les acides aminés neutres et basiques et qui accepte les acides non a-aminés et iminés; (3) un transporteur sodium-indépendant celui-là, ii haute affinité pour les acides aminés neutres et basiques, qui refuse les acides non a-aminés; (4) un transporteur sodiumdépendant, mais à faible affiiité pour les acides aminés neutres et basiques et qui refuse les acides non a-aminés et iminés; (5) un transporteur sodium-dépendant dont It&inité pour les acides imnés est intermédiaire et qui montre une faible affinité pour les acides aminés neutres, mais n'accepte pas les acides aminés basiques et les non a-aminés; (6) enfin, toujours selon Matthews,

19 Corcelli et co11.(1982) et Berteloot (1 984) ont montré que les acides arninés acides utilisaient un système de transport actif, commun aux acides aspartiques et glutamiques et couplé au sodium. Bien qu'on ait longtemps présumé que les protéines devaient être hydrolysées en acides aminés libres avant leur absorption. les travaux de Newey et Smyth (1959, 1960) ont apporté la première évidence de l'absorption des peptides. Ce concept est maintenant accepté grâce aux études de Adibi et Phillips (1968) et de Manhews et coll. (1968) qui ont observé que les dipeptides étaient absorms plus rapidement que les acides aminés libres. Les di- et tripeptides seraient pris en charge par un système de transport actif, indépendant de celui des acides aminés libres et commun aux peptides neutres, basiques et acides (Adibi et Kim, 198 1). L'hydrolyse des oligopeptides ayant plus de trois résidus d'acides aminés s'effectue grâce aux peptidases de la bordure en brosse et de la fraction cytoplasmique de I'entérocyte. De nombreuses peptidases ont été identifiées dans les cellules de la muqueuse intestinale. Dans la membrane de la bordure en brosse on retrouve : les aminooligopeptidases ou aminopeptidases NT les aminopeptidases A, 1 et III, la dipeptidyl aminopeptidase IV et la gamma-glutamyltranspeptidase. L'activité celluiaire totale des peptidases de la membrane de la bordure en brosse serait respectivement de 90 et 98% pour les tétrapeptides et les peptides ayant plus de quatre résidus d'acides aminés. Cette activité se situerait entre 5 et 12 % pour les dipeptides et entre 10 et 60% pour les tripeptides. Les peptidases de la fraction cytoplasmique sont la dipeptidase, l'aminotripeptidase et la proline dipeptidase (Adibi et Kim, 198 1). L'activité cellulaire des peptidases cytoplasmiques differe considérablement de celle des peptidases de la bordure en brosse, étant très importante pour les di- et tripeptides, très faible pour les tétrapeptides et nulle pour les peptides de plus grande taille (Adibi et Kim, 1981). Les enzymes cytoplasmiques semblent donc spécialisées pour compléter l'hydrolyse des peptides absorbés. Ainsi, après leur absorption, les peptides subissent une dernière hydrolyse par les peptidases cytoplasmiques. Dans I'entérocyte, le sort des acides aminés libres produits par la digestion inaaluminale et cellulaire dépend des besoins de l'organisme. Ils peuvent être dégradés, convertis en d'autres acides aminés, incorporés à des protéines ou dirigés vers la circulation portale. La membrane basolatérale de l'intestin posséderait au moins cinq systèmes de transport pour les acides aminés dont deux sodium-dépendants et trois sodium-independants (Ganapathy et coll., 1994). Lorsque le contenu luminal atteint la jonction i16ocaecaie, I'absorption des protéines est presque complète. Bien que l'assimilation des protéines requière tout l'intestin grêle, la capacité de digestion et d'absorption varie selon les sites. Les travaux de Adibi et Mercer (1973) ont montré que lacapacité de transport pour les acides aminés libres est plus impo&inte dans le jéjunum que

20 dans l'iléon alors que celle pour les oiigopeptides est distribuée uniform6ment dans tout l'intestin grêle. Selon Ganapathy et co11.(1994), l'activité des peptidases de la bordure en brosse est beaucoup plus importante dans l'iléon que dans Ie jéjunum. Difftrents facteurs sont susceptibles d'influencer la digestion des protéines ingérées. En général, les protéines végétales sont digérées moins rapidement que les protéines animales (Matthews, 1991). Les traitements thermiques prolongés ou les mauvaises conditions d'entreposage peuvent rendre les protéines résistantes à l'hydrolyse enzymatique (Matthews, ; Freeman et Kim, 1978). La réaction de Maillard, qui se produit entre un sucre réducteur (ex.fnictose, maltose, lactose) et le groupement aminé libre de la lysine, amène la formation de produits intermédiaires qui diminuent la valeur nutritionnelle des protéines (Wapnir, 1990). Les inhibiteurs d'enzymes protéolytiques et les composés phénoliques tels les tannins peuvent diminuer la digestibilité protéique (Matthews, ; Silano, 1 977). D'autre part, la présence des autres constituants alimentaires tels les glucides ou les lipides (sujet que nous aborderons dans la section 1.2.3) peuvent modifier l'efficacité de la protéolyse (Freeman et Kim, 1978). Plus de 95% des lipides ingérés dans le régime occidental sont des triglycérides à chaîne longue (plus de 12 carbones). En plus de fournir les acides gras essentiels, ils sont une importante source d'énergie (9 kcal / g). Les lipides «mineurs» du régime sont : les phospholipides et les stérols dont le cholestérol. Nous nous intéresserons particulièrement à la digestion des triglycérides, lesquels sont formés d'une molécule de glycérol dont chacune des trois fonctions alcool est estérifiée par un acide gras, ce qui rend cette molécule totalement hydrophobe. Toute la complexité de la digestion intestinale des lipides vient de ce caractère hydrophobe des triglycérides qui doivent être hydrolysés par des enzymes hydrophiles. Suite à la mastication, l'émulsification des gras par certains produits de la phase gastrique de digestion (des diglycérides et des acides gras) et les mouvements péristaltiques de l'estomac augmentent grandement l'aire de surface des lipides. L'émulsion entre dans le duodénum sous la fome de fines gouttelettes dont le diamètre est inférieur à 0.5 pm (Tso, 1994). La digestion des lipides dans l'intestin grêle implique l'hydrolyse des esters d'acides gras suivie de la dispersion des produits hydrolysés en une forme absorbable (Patton, 198 1). La lipase et la colipase, essentiels à l'hydrolyse des lipides, sont fournies par le suc pancréatique. La colipase, sécrétée sous forme inactive, est activée par la trypsine. Dans l'intestin, le chyme alimentaire contenant les émulsions de

21 gras, la lipase, la colipase et les sels biliaires, forment un mélange qui modifie radicalement les rapports entre l'eau et les constituants lipidiques (Bernier et coll., 1988). D'abord, la lipase pancréatique est progressivement inactivée aux interfaces hydrophobes incluant celle d'une émulsion de triglycérides, son substrat naturel, et son activité est fortement inhibée par les composés amphiphiles tels les protéines hydrophobes, les phospholipides ou les sels biliaires qui se distribuent entre les phases aqueuse et non aqueuse (Lanon et Erlanson-Albertsson, 1983; Borgstfim, 1982). Cependant, les sels biliaires ont aussi un effet détergent et permettent de balayer de ces substances I'interface des substrats glycérides, séparant par le fait même la lipase de son substrat. L'activation de la lipase en présence des sels biliaires n'est possible que grâce à son cofacteur, la colipase, dont la force de liaison avec I'interface triglycérides / eau est plus impottante que celle des sels biliaires (Bernier et coll., 1988). La colipase, qui se lie à la lipase dans un rapport 1 : 1, agirait comme une «ancre» permettant à la lipase de se rapprocher de l'interface sans être inactivée (Shiau, 1987). De plus, la présence simultanée des sels biliaires (au dessus de la concentration micellaire critique) et de la colipase permet de stabiliser la lipase et d'optimiser son activité (Borgstrom, 1982; Larson et Erlanson-Albertsson, 1983). Par ailleurs, les sels biliaires, lorsqu'i 1s atteignent la concentration micellaire critique (CMC), forment des agrégats sphériques appelés micelles. Le centre de ces micelles est non polaire et permet de solubiliser les rnonoacylglycérols et les acides gras, formant ainsi des micelles mixtes; c'est la solubilisation micellaire (Shiau, 1987). Les produits finaux de la digestion des triglycérides par la lipase pancréatique sont des acides gras (partiellement ionisés par le bicarbonate du suc pancréatique) et des sn 2- monoacylglycérols; la lipase pancréatique agissant principalement sur les positions sn-1 et sn-3 des triglycérides (Borgstrom, 1985a). Ces produits sont ensuite incorporés aux micelles mixtes. Le processus implique un équilibre dynamique entre plusieurs phases dû à l'évolution constante des rapports entre l'eau, les lipides et les sels biliaires d'une part, et les produits de digestion des lipides et leur absorption continuelle d'autre part (Borgstrom, 198Sa; Bemier et coll., 1988). L'absorption des acides gras à chaîne courte et moyenne n'est pas dépendante des micelles étant donné leur caractère soluble. Leur vitesse d'absorption, relativement rapide, est limitée par la membrane de la bordure en brosse. Les acides gras et les monogiyc&ides produits par la digestion des triglycérides à chaîne moyenne (C8 à C 12) ne nécessiteraient pas la présence des micelles pour vaincre la résistance de la couche aqueuse non agitée (CANA) (Borgstrom, 1985a). L'absorption des triglycérides à chaîne longue est plus complexe. Elle nécessite la présence des micelles et sa vitesse est limitée par la présence de la CANA (Thomson et coll., 1993). De plus, les acides gras et

22 les monoglycérides doivent se séparer des micelles avant d'être absorbés. Le modèle qui suscite le plus d'intérêt actuellement est celui de la dissociation, laquelle se produirait près de la membrane de la bordure en brosse, à l'intérieur d'un microclimat pouvant faire partie de la CANA et partiellement dfi i la présence de mucine acide (Thomson et coll., 1993; Shiau et Levine, 1980; Shiau et coll., 1990). Le transport des produits de la digestion des triglycérides, dissociés des micelles, se ferait par diffusion passive a travers les villosités de la membrane (Borgstrorn, l985a). Ockner et Manning (1 974) ont isolé la «fatty acid binding protein» (FABP), laquelle capterait les acides gras libres pour les diriger vers le réticulum endoplasmique. Selon Borgstrom, (1985a) l'importance de cette protéine n'est pas claire et il n'y a pas d'information quant à la migration des monoglycérides jusqu'au site d'estérification. La resynthèse des acides gras et des monoglycérides en triglycérides s'effectue à l'intérieur du réticulum endopiasmique à partir du 2-monoacylglycérol et grâce à la triglycéride synthétase (Tso, 1994). Cette voie assure environ 70% du transport cellulaire des lipides (Bernier et coll., 1988). L'autre voie est celle de l'a-glycérophosphate (Tso, 1994) qui permet la synthèse des triglycérides et des phospholipides (Bernier et coll., 1988). Les triglycérides quittent la cellule épithéliale de l'intestin sous la forme de lipoprotéines, principalement des chylomicrons (Borgstrom, 1985a). Le centre des chylornicrons renferme des triglycérides, des esters de cholestérol et autres lipides nonpolaires, recouverts par les phospholipides, le cholestérol et les apoprotéines. Les principales apoprotéines associées aux chylomicrons sont I'apo 1, A-IV et B-48. L'apo E et C y sont également associées mais après interaction avec les autres lipoprotéines plasmatiques (Tso, 1994). Le sort des lipides alimentaires après leur entrée dans la circulation sanguine et leur influence sur le métabolisme des lipides plasmatiques dépassent le cadre du présent travail. Notre objectif est plutôt de faire ressortir l'influence que peuvent exercer les lipides alimentaires sur le processus de digestion et d'absorption des nutriments, particulièrement des protéines. 1.2 Impact des lipides alimentaires sur le processus digestif Les lipides et certains de leurs produits de digestion, lorsque présents dans la lumière intestinale, sont des stimulateurs critiques de la sécrétion pancréatique exocrine et de la contraction biliaire (Malagelada et coll. 1973, 1976) et d'importants inhibiteurs de la vidange gastrique (Hunt et Knox, 1968). Ces fonctions biologiques, qui sont des étapes critiques des processus de digestion et d'absorption des nutriments, sont régularisées via des facteurs neuraux et hormonaux dont on connaît encore mal la contribution relative.

23 1.2.1 Sécrétions hormonales et biliopancréatiaues Pendant longtemps, la sécrétion d'enzymes pancréatiques a été utilisée comme système de bioessais pour mesurer la sécrétion de cholécystokinine (CCK). Go et coll. (1970) ont ainsi observe que certains produits de la digestion des Lipides sont des stimulants de la dcrétion de CCK. Hopman et coll. (1985) ont confirmé, à l'aide des techniques récentes de radioimmunoessais, que l'ingestion de Lipides induit une augmentation significative de la concentration plasmatique de CCK. Plus récemment, l'utilisation d'antagonistes de la CCK (ex. proglumide, loxiglumide) a pexmis de mesurer la réponse pancréatique et biliaire en l'absence de CCK. Shibbs et Stabile (1985) ont montré, chez le chien, que l'infusion intraduodénale d'acides aminés et de lipides induit une réponse significative et dose-dépendante de la sécrétion pancréatique; cette réponse étant presque totalement inhibée par l'infusion de proglumide. Aujourd'hui, les données obtenues permettent de considérer la CCK comme un régulateur physiologique majeur de la sécrétion pancréatique et de la contraction biliaire induites par les repas (Walsh, 1994). La stimulation de la sécrétion pancréatique et biliaire, via la libération de CCK, par certains produits de la digestion des lipides semble dépendre de plusieurs facteurs. Meyer et Jones (1974), dans une étude détaillée de la pefision intestinale de différents types de lipides, ont observé, chez le chien, que I'acide oléique dispersé dans des micelles de sels biliaires était un meilleur stimulant de la sécrétion de bicarbonate et de protéines pancréatiques que l'acide oléique non dispersé. ils ont aussi observé que les acides gras dont la chaîne contient plus de 9 carbones (Cg) stimulent la sécrétion pancréatique et que le rapport bicarbonate : protéines varie avec la longueur ou la saturation de la chaîne. Les travaux de Malagelada et coll. (1976). effectués chez l'humain, ont démontré que les acides gras Cl8 étaient de meilleurs stimulants de la sécrétion d'enzymes pancréatiques (trypsine, lipase) et de bilirubine que les C 12, les deux étant plus efficaces que les C8. Ces auteurs ont également observé une codation entre la quantité moyenne d'acides gras non absorbés dans le jéjunum et l'augmentation de la libération d'enzymes pancréatiques. La longueur des chafnes et la quantité d'acides gras, de même que la concentration d'acides biliaires peuvent influencer la sécrétion pancdatique et biliaire en déterminant la surface d'intestin exposée à la stimulation par les acides gras et par conséquent la quantité de CCK libérée et la réponse des organes cibles. Wicker et Puigserver (1987) se sont intéressés à la réponse pancréatique exocrine chez des rats dont les régimes contenaient entre O et 30% d'huile de tournesol, au détriment des glucides. Ces auteurs ont rapporté une augmentation de I'activité (1.5 x) de la chymotrypsine avec les régimes

24 contenant de 5 B 20% de lipides. Avec 25 et 30% d'huile de toumesol, ils ont observé une augmentation de l'activité de la lipase (2.5 et 24 x) et de la colipase (2.3 et 1.9 x) de même qu'une augmentation de la synthèse des procarboxypeptidases (1-6 et 1.7 x). Dans une étude chez le porc, Juste et coll. (1983) ont observé une augmentation de 49% de la libération d'acides biliaires lorsque le régime contenait 10% de lard comparativement à 2%. Baiiesta et coll. (1990) ont analysé, sur une période de 8 mois, la réponse pancréatique et le contenu en enzymes du suc pancréatique chez des chiens dont les régimes différaient uniquement dans le type de lipides utilises; l'huile de toumesol et huile d'olive représentant respectivement 32 et 3445 de l'apport énergétique total. Dans les conditions de repos, le débit de lipase et d'amylase & même que la concentration en amylase, en protéines et en bicarbonate étaient significativement plus élevés chez le groupe tournesol. Chez le groupe olive, la prise alimentaire n'a pas causé de changement important dans la vitesse de débit ou le contenu en élecirolytes ou en protéines. L'activité de l'amylase et le débit de l'amylase et de la lipase etaient plus faibles chez ce groupe alors que les activités totale et spécifique de la chymotrypsine étaient plus élevées que chez le groupe toumesol. D'après les auteurs, la réponse postprandiale plus faible des chiens noums avec le régime contenant de l'huile d'olive serait le résultat d'une balance entre les facteurs qui stimulent et qui inhibent la sécrétion pancréatique. Un équilibre serait atteint entre l'effet stimulateur de la libération de CCK (Hopman et coll. 1985) et de sécrétine (Fink et coll. 1983a) par l'acide oléique et l'effet inhibiteur de la libération du peptide YY (Pappas et coll. 1985) et du polypeptide pancréatique (Fink et coll. 1983b) par ce même acide gras Tem~s de réaction La sécrétion pancréatique exocrine et son contenu en enzymes digestives représentent, pour les nutriments présents dans l'intestin grêle, une étape cruciale du processus d'hydrolyse. Cependant, la vitesse d'entrée et le temps de transit des aliments dans l'intestin sont susceptibles d'influencer la du& du contact entre les enzymes et leurs substrats et, conséquemment, le processus d'hydrolyse et d'absorption des nutriments. Les lipides présents dans l'intestin et particulièrement leurs produits de digestion sont considérés comme d'importants inhibiteurs de la vidange gastrique et leurs effets sur le temps de transit dans l'intestin suscitent un intérêt grandissant. Hunt et Knox (1968) ont étudié, chez l'humain, la relation entre la longueur de la chaîne d'acides gras et le ralentissement de la vidange gastrique. En augmentant la longueur des chaînes de 2 à 10 carbones, ils n'ont obtenu qu'un faible ralentissement de la vidange gastrique. Les sels d'acides gras contenant de 12 à 18 carbones se sont avérés en moyenne 4 fois plus efficaces que ceux à

25 chaîne courte; l'acide myristique (C14) iétant le plus efficace. Selon les auteurs, ce ralentissement de la vidange gastrique s'effectuerait via la stimulation de récepteurs présents dans le duodénum. Kroop et coll. (1979) ont observé plus tard qu'un repas solide-lipide inhibait la vidange gastrique chez des sujets normaux et des patients dont le duodénum était dévié suite un Bilhoth II (vagotomie troncdaire, antrectomie et gastrojéjunostornie). Iis ont donc suggéré que des récepteurs étaient aussi présents dans le jéjunum. Read et coll. (1984) ont rapporté que l'infusion dans l'iléon de protéines et particulièrement de lipides émulsifiiés causait un ralentissement significatif du temps de transit dans l'intestin grêle, indépendernment du rythme de la vidange gastrique. Cet effet n'a pas été observé lors des infusions de lipides ou de protéines dans le jéjunum ou le côlon. Ceci démontrerait l'existence d'un mécanisme de rétroaction permettant un temps de contact plus long entre le contenu luminal et l'épithélium absorbant. Ils ont également montré que l'infusion de lipides dans I'iléon entraînait un important délai de l'évacuation gastrique de même qu'un ralentissement du transit intestinal d'un repas solide. L'importance possible du <deal break» serait celle d'un mécanisme pour signaler que l'intestin grêle est surchargé de nutriments et que l'arrivée de nouveaux aliments provenant de l'estomac doit être réduite. L'étude menée par Cunningham et coll. (1991) met en perspective l'adaptation gastrointestinale à des régimes plus ou moins élevés en gras. Ils ont montré. chez l'humain, que la vidange gastrique et le temps de transit de la bouche au caecum d'un régime élevé en lipides (19.26 MJ) sont plus rapides qu'avec un régime faible en lipides (9 MJ) après 14 jours d'adaptation; aucune différence significative n'a été observée lorsque les régimes étaient consommés pendant seulement 4 jours. Ils postulent qu' un régime élevé ou faible en lipides résulte respectivement en une désensibilisation et une sensibilisation des mécanismes par lesquels les nutriments régularisent le transit gastrointestinal Di~estibiiité des rotéi in es Nous avons vu que les lipides alimentaires modulent de façon importante les fonctions physiologiques gastro-intestinales et que de telles modulations sont susceptibles d'affecter le processus de digestion et #absorption des macro-nutriments. La nature et la quantité de lipides du régime peuvent avoir un effet sur la digestibilitd des protéines, tel que mentionné par den Hartog et coll. (1989). Cependant, la Littérature compte relativement peu d'études sur le sujet et les résultats rapportés sont souvent contradictoires. Dans la présente section, nous ferons une description

26 sommaire des protocoles de ces principaux tmvaux en faisant ressortir les résultats qui concernent lfnfluence des lipides du régime sur la digestibilité des protéines. Marshail et coll. (1959) ont conduit une expérience sur 65 rats pendant 200 jours. Les 4 régimes, administrés ad libitum, étaient composés de : nourriture d'élevage moulue contenant 4% de gras ou additionnée de 1 1.5% d'huile de maïs, d'huile végétale hydrogénée ou de lard. L'augmentation de la quantité de gras du regime n'a pas eu d'effet consistant sur la digestibilité apparente (76.5 %) de la mafière azotée. La rétention d'azote n'a pas semblé êîre reliée à la nature ou à la quantité des lipides du régime. Dans une autre série d'expériences menée sur 35 rats pendant 200 jours, les 4 régimes contenaient de la lactalbumine comme seule source protéique et 3 ou 15% d'huile de maïs, 15% d'huile végétale hydrogénée ou 15% de lard. Le niveau de lactalbumine étaient de 26% dans le régime contenant 3% de lipides et de 308 dans Ies autres. Ils n'ont observé aucune différence signif~cative sur le pourcentage de digestibilité apparente de l'azote. Asplund et coll. (1 960) ont mesuré la digestibilité des protéines chez 12 porcelets noums ad libitum pendant trois semaines avec des régimes à base de maïs et de tourteau de soya additionnés de 0, 10 ou de graisses stabilisées. Le contenu en protéines de chacun des trois régimes était de L 8.7,2 1.8 et 23% respectivement. Avec les régimes contenant 10 et 20 % de graisses, ils ont obtenu une digestibilité apparente des protéines de 84 et 83 % comparativement à 77 % avec le régime témoin. Trente porcs en croissance (Lowrey et coll., 1962) ont reçu un régime à base de maïs, de tourteau de soya, de tourteau de Menhaden et de glucose. Trois groupes de 5 porcs recevaient un régime contrôle contenant 13, 16 ou 19 % de protéines et O % de suif alors que les trois autres recevaient l'un de ces trois régimes additionné de 10 % de suif au détriment du glucose. L'addition de suif n'a eu aucun effet significatif sur le pourcentage de digestibilité apparente des protéines. Chez 20 porcs en croissance, Greeley et co11.(1964) ont déterminé l'effet de trois types et niveaux de gras sur, entre autres, la digestibilité des protéines. Les porcs étaient noums deux fois par jour et le régime de base contenait du maïs moulu, du tourteau de soya et de I'amidon de mais auquel était ajouté 0, 5, 10 ou 15 % d'huile de maïs, de lard ou de suif au détriment de l'amidon. Le contenu en protéines brutes des régimes variait de 16.2 h 16.5 %. Deux porcs étaient assignés au hasard à un régime pendant 14 jours puis à un différent du premier pendant la même période; quatre observations pour chacun des 10 r6gimes ont été effectuées. La source et le niveau de lipides des différents régimes n'ont pas afexté le coefficient de digestibilité apparente (CDA) des protéines.