Université 20 Août Skikda (ALGERIE) MEMOIRE Présenté à la faculté des sciences Département des sciences fondamentales

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1 Ministère de l enseignement supérieur et de la recherche scientifique Université 20 Août Skikda (ALGERIE) MEMOIRE Présenté à la faculté des sciences Département des sciences fondamentales Pour l obtention de diplôme de MAGISTER Spécialité : Chimie Option : Pollution chimique et environnement M elle Sarah BATTAZ THEME Soutenu le : 18/03/2009 Devant la commission d examen : Mr Mahmoud SOLTANE M.C. Centre universitaire de TAREF Président Mr Ahmed MEGHEZZI Prof. Université de BISKRA Examinateur Mme Rachida ZAGHDOUDI M.C. Université de SKIKDA Examinateur Mr Fayçal DJAZI Prof. Université de SKIKDA Rapporteur Année Universitaire : 2008/2009

2 Remerciements Ce travail de recherche a été mené au laboratoire central de la raffinerie de Skikda, à la direction de l environnement de Skikda, au secteur sanitaire d El Harrouch et à l office national des aliments du bétail d El Harrouch (ONAB). Monsieur Djazi Fayçal, professeur à l université de Skikda, a encadré ces travaux de recherches. Je le remercie d avoir accepté mon projet et de m avoir prodigué tous les conseils indispensables. Je le remercie aussi d avoir suivi, guidé, soutenu et fait confiance à mon travail. Je tiens à remercier Monsieur Mahmoud SOLTANE, maître de conférence au centre Universitaire de Taref, d avoir accepté de présider le jury de ce mémoire.. Je remercie, également, Monsieur Ahmed MEGHEZZI, professeur à l université de Biskra, ainsi que Madame Rachida ZAGHDOUDI, maître de conférence à l université de Skikda d'avoir accepté d examiner ce travail et faire partie de ce jury. Je remercie monsieur Babori Omar, PDG de l ACTIM, d avoir guidé mes pas au niveau de la zone industrielle de Skikda et de m avoir facilité l accès à la raffinerie et aux différents services. En dépit de sa santé fragile il n a jamais hésité à répondre à mon appel et à me porter assistance. J adresse tous mes remerciements à messieurs : Gas, Aoued, Boualeg, Bekkouche, Boudekhana, exerçant au niveau du laboratoire central de la raffinerie de Skikda, qui ont mis à ma disposition tous les échantillons et les produits chimiques nécessaires à mon travail. Je les remercie du bon accueil qu ils m ont réservé. Monsieur bouhayene, chef de département de biologie, a été pour moi d un grand secours en ce qui concerne la disponibilité de la documentation en rapport avec le thème que j ai choisi. Je le remercie d avoir mis à ma disposition tout le matériel pédagogique indispensable. Je tiens aussi à remercier madame Maachia et mademoiselle Mouat de m avoir initié dans l étude bactériologique et de m avoir autorisé d assister à leurs cours qui m ont énormément aidée dans la compréhension des phénomènes bactériologiques. Je remercie monsieur Azzouz, chef de département d agronomie, de m avoir ouvert les laboratoires pour que je puisse effectuer les analyses physiques de mon échantillon. Je tiens aussi à remercier mesdemoiselles Sabrina et Warda, ingénieurs exerçant aux laboratoire d agronomie, pour la patience et l amabilité qu elles ont eues à mon égard durant tout mon séjour.

3 Monsieur Harbi Youcef, chef de département moyens généraux à l ONAB d El Harrouch, m a permis d effectuer le stage au sein de l ONAB, je le remercie de m avoir introduit au près des services, particulièrement celui qui gère le laboratoire, au sein duquel j ai pu effectuer une série d analyses. Par ailleurs, je tiens à remercier le personnel du laboratoire pour avoir mis à ma disposition le matériel et les produits nécessaires à mon travail. Je remercie, également, monsieur Rached Ammar, chef de service laboraoire du secteur sanitaire d El Harrouch, de m avoir guidé dans mon travail, soutenu et donné confiance en moi. Ces encouragements m ont permis de supporter le stress du travail. Je le remercie pour sa disponibilité et sa gentillesse. Je remercie madame Boughayoute et monsieur Bouhouche Sami de la direction de l environnement de Skikda pour l accueil chaleureux qu ils m ont réservé et pour m avoir facilité le travail en mettant à ma disposition tout le matériel que nécessite le déroulement de mes analyses. Cela été un véritable plaisir de travailler avec eux dans une atmosphère laborieuse et fraternelle.

4 Liste des abréviations BTX : Benzène, toluène, xylène BTS : Basse teneur en soufre HTS : Haute teneur en soufre GPL : Gaz du pétrole liquéfier COV : Composé organique volatil MO : Matière organique COT : Carbone organique total Lac : Lactose Glu : Glucose PCA : Plat count agar UFC : Unité formant colonie HC : Hydrocarbure L/S : Rapport Liquide/Solide K OW : Cœffcient de partage octanol-eau HAP : Hydrocarbure aromatique polycyclique US-EPA : Agence pour la protection de l environnement américaine IARC : Centre international de recherche sur le cancer PPP : Principe pollueur/payeur CVI : Valeur de constat d impact PLNA : Phase liquide non aqueuse ZNS : Zone non saturée MOF : Matière organique fraîche C/N/K : Rapport Carbone/azote/phosphore POA : Procédé d oxydation avancée UV : Ultra violet

5 INTRODUCTION Chapitre I : Généralités sur les hydrocarbures

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7 I Généralité sur les hydrocarbures L objectif de ce premier chapitre est de présenter les caractéristiques générales permettant d appréhender l évolution des hydrocarbures dans les milieux souterrains. I.1 Définition et caractéristiques D origine organique, les hydrocarbures se forment à partir de débris d algues, de résidus de la faune marine et de plancton. Alors le vieillissement, la température et la pression (qui s exerce sur les fonds marins) transforment cette substance organique en hydrocarbures [1]. Les hydrocarbures (pétrole brut et gaz naturels) sont des molécules composées uniquement d atomes de carbone et d hydrogène. Selon l architecture de la liaison entre l atome du carbone et d hydrogène, on distingue trois séries: Les alcanes ; Les hydrocarbures aromatiques ; Les hydrocarbures aromatiques polycycliques [2]. Dans ce qui suit on va présenter les caractéristiques des différentes classes d hydrocarbures ainsi que leur abondances dans un brut pétrolier. I.1.1 Les alcanes Parmi lesquels, on distingue Les alcanes linéaires (n-alcanes, C n H 2n+2 ), dont la longueur de chaîne varie de 7 à 40 atomes de carbone, constituent une des classes les plus abondantes car ils constituent 10 à 40 % des hydrocarbures totaux d'un brut pétrolier. Par contre le pétrole brut d origine fossile ne contient en général pas d alcènes ou d alcyne. Ils sont obtenus par distillation destructive de substances naturelles complexes, telles que la houille, et sont formés en grande quantité par vapocraquage au cours du raffinage du pétrole. Les alcanes ramifiés: les plus abondants sont les iso-alcanes (groupement méthyle en position 2), les autres composés ramifiés antéiso (groupement méthyle en position 3) ou polyramifiés tels que les isoprénoïdes (exemple: pristane, phytane) sont beaucoup moins nombreux. Ces composés se trouvent dans le pétrole brut dans des proportions sensiblement égales à celles des n-alcanes. Les cycloalcanes: renferment des composés cycliques (à 5 ou 6 atomes de carbone) saturés et le plus souvent substitués. Quelques dérivés polycycliques sont aussi présents et certains d entre eux tels les stéranes et les triterpanes sont caractéristiques d un pétrole brut. Cette famille peut représenter entre 30 et 50 % des hydrocarbures totaux d un pétrole brut [3]. 3

8 Les alcanes, en général, sont caractérisés par une densité inférieure à 1, une faible polarité (log K ow = 3,5-5) donc une certaine hydrophobicité, une bonne volatilité pour les alcanes de 5 à12 carbones (température d ébullition comprise entre 40 et 200 C) et une volatilité un peu plus modérée pour les alcanes de 12 à 26 carbones (température d ébullition comprise entre200 et 300 C). Dans l environnement, les alcanes présentent une stabilité assez élevée, surtout les alcanes ramifiés dont le carbone tertiaire ou quaternaire conduit à une certaine récalcitrance vis-à-vis des micro-organismes. Cependant, grâce à leur faible solubilité et leur hydrophobicité, les alcanes ne se trouveront qu en faible quantité dans la phase aqueuse et seront stabilisés dans la phase solide du sol ou dans les sédiments [4]. I.1.2 Les hydrocarbures aromatiques Les hydrocarbures aromatiques sont d excellents solvants pour les laques et les peintures. Le benzène est de loin le plus utilisé des hydrocarbures benzéniques. Il est en effet à la base de la fabrication de nombreux composés tels que les matières plastiques, résines, colorants, explosifs, détergents, insecticides, textiles, etc [5]. Les hydrocarbures aromatiques se distinguent des autres par un rapport C/H très élevé. Ils sont constitués d un cycle hexagonal de carbone, chacun étant lié a un unique atome d hydrogène (cycle benzénique). Le plus simple d entre eux est le benzène (C 6 H 6 ). On peut aussi citer les TEX qui sont, en plus du benzène, les hydrocarbures aromatiques les plus rencontrés dans l environnement. Le terme BTEX correspond donc aux quatre substances suivantes : le Benzène, le Toluène, l Ethylbenzène et les Xylènes. Le tableau-1 résume les principales caractéristiques des BTEX [4]. Tableau I.1: Grandeurs caractéristiques des BTEX 4

9 Grandeurs Benzène Toluène Ethylbenzène Xylène Ortho : 0,18 Solubilité (g/l) Méta : 0,15 1,83 0,52 0,15 à20 C Para : 0,18 (à25 C) Ortho : 0,88 Densité à 20 C 0,88 0,88 0,87 Méta : 0,86 Para : 0,86 Ortho : 663 Pression de vapeur Méta : 790 à 20 C Para : 758 Constante d Henry à 25 C (Pa.m 3.mol -1 ) Ortho : 523 Méta : 758 Para : 758 Densité de vapeur 2,7 3,2 3,7 - Log Kow à 20 C 2,13 2,69 3,15 Ortho : 3,01 Méta : 3,21 Para : 3,15 De manière générale, les hydrocarbures aromatiques, comme le montre le tableau I.1, sont moins dense que l eau, peu solubles et peuvent être considérés volatils (tension de vapeur supérieure à 0,2 KPa à 20 C). Ils ont une densité qui varie entre 0,86 et 0,9 et présentent une certaine hydrophobicité légèrement moins élevée que dans le cas d un hydrocarbure aliphatique, avec une valeur de log K ow comprise entre 2 et 4. Dans l eau, ces hydrocarbures, en plus des hydrocarbures aliphatiques, peuvent concentrer des micropolluants peu solubles (pesticides) et permettre alors leur absorption par les organismes vivants. Ils peuvent aussi modifier le comportement des êtres vivants en perturbant les relations écologiques des chimiomédiateurs [1,4]. Jusqu en, 1988, on croyait la biodégradation des hydrocarbures aromatiques uniquement possible en conditions aérobies. Il se trouve en fait qu une biodégradation anaérobie est possible pour le benzène, le toluène et l ethylbenzène. Toutefois, cette biodégradation est généralement insignifiante. Des conditions aérobies sont donc très favorables à une biodégradation des hydrocarbures aromatiques. Le benzène, le toluène et le xylène sont facilement biodégradables s ils sont présents en faibles doses dans le milieu [1]. 5

10 I.1.3 Les hydrocarbures aromatiques polycycliques Plusieurs familles d'hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques dont le nombre de noyaux varie de 2 à 6 sont présentes dans les pétroles bruts. Ces composés sont dominés par des composés mono-, di- et tri-aromatiques. En général, les hydrocarbures aromatiques sont moins abondants que les alcanes, et ne représentent que 10 à 30 % des hydrocarbures totaux d'un brut pétrolier [3]. Bien que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) font partie des hydrocarbures aromatique ils constituent de par leur toxicité à très faible dose, un groupe différent des autres hydrocarbures aromatiques. Ces composés sont des substances organiques constituées d au moins deux anneaux aromatiques condensés. Ils sont divisés en deux catégories : les composés à faible masse moléculaire formée de moins de quatre anneaux et les composés à masse moléculaire élevée, à quatre anneaux ou plus [6]. Les HAP purs sont des solides habituellement colorés, cristallins à la température ambiante. Les propriétés physiques des HAP varient selon leur masse moléculaire et leur structure (tableau I.2). Sauf dans le cas du naphtalène, leurs solubilités dans l eau vont de très faibles à faibles et leurs tensions de vapeur, de faibles à modérément élevées. Leurs coefficients de partage octanol/eau (K ow ) sont relativement élevés, ce qui dénote un important potentiel d adsorption sur les matières particulaires en suspension dans l air et dans l eau et aussi sur les particules du sol. Ces composés sont donc lipophiles et solubles dans de nombreux solvants organiques. Ainsi, ils sont potentiellement bioaccumulés et concentrés dans les sédiments et les sols. La persistance des HAPs augmente avec le nombre de cycles de la molécule. Par exemple, le naphtalène et les composés de faible poids moléculaire, étant plus solubles et plus volatiles, sont peu persistants et donc peu bioaccumulables. En revanche, les composés de poids moléculaires élevés sont très persistants et par conséquent bioaccumulables. Par exemple, la demi-vie dans les sols (tableau I.3) du benzo[k]fluoranthène est de plusieurs années (jusqu à 9 ans selon les sources) alors que celle du fluoranthène est de 1 à 2 mois. Le tableau I.3 récapitule les demi-vies de plusieurs HAP dans les sols [7]. 6

11 Tableau I.2: Propriétés physicochimiques des 16 HAP prioritaires[8] Nbr Masse Tension Constante Solubilité de moléculaire de vapeur d Henry [µg/l] cycle [g/mol] [Pa] atm.m 3.m -1 Naphtalène ,5 4,8 Acénaphtylène ,9 1,1 Acénaphtène ,7 2,4 Fluorène ,7 1,7 Phénanthrène ,1 8,9 Anthracène ,7 3,9 Fluoranthrène ,5 Pyrène ,2 5,1 Benzo(a)anthracène ,7 1,2 Chrycène ,4 1,1 Benzo(b)fluoranthrène ,3 6,7 1,2 Benzo(k)fluoranthrène ,6 6,7 3,9 Benzo(a)pyrène ,8 6,7 4,9 Dibenzo(a,h)anthracène ,5 1,3 7,1 Indeno(c,d)pyrène ,3 1,3 7 Benzo(g,h,i)pérylène ,1 1,3 5,3 Log de K ow 3,37 4,07 4,33 4,18 4,4 4,45 5,33 5,32 5,61 5,61 6,57 6,84 6,04 5,97 7,66 7,23 La biodégradation des HAP est particulièrement difficile, elle s effectue noyau après noyau et quasiment uniquement en conditions aérobies. Cette biodégradation est en effet très peu significative. L utilisation de processus de dégradation biologique dans le but de dégrader les HAP est donc peu utile. Toutefois, certains champignons présentent de bonne aptitude à transformer les hydrocarbures aromatiques polycycliques, mais la faible disponibilité de ces polluants, du fait de leur pouvoir d adsorption, empêche leur dégradation[1]. 7

12 Tableau I.3: Demie-vie des HAP par biodégradation dans le sol[8] Nom Sol milieu aérobie Sols milieu anaérobie Domaine de variation (jours) Naphtalène Acénaphtylène Acénaphtène Fluorène Phénanthrène Anthracène Fluoranthrène Pyrène Benzo(a)anthracène Chrycène Benzo(b)fluoranthrène Benzo(k)fluoranthrène Benzo(a)pyrène Dibenzo(a,h)anthracène Benzo(g,h,i)pérylène Indeno(c,d)pyrène 0, ,5-60 0, , , , , , , A cause de leur toxicité ainsi que leur persistance dans l environnement les hydrocarbures aromatiques polycycliques sont moins utilisés que les autres hydrocarbures, mais certains HAP sont produits et utilisés commercialement, on cite, par exemple : o La créosote, qui est un mélange complexe et variable de composés de distillation du goudron de houille. Dix-sept HAP, comptent pour environ 63 % du mélange de créosote. La créosote est communément utilisée comme produit de conservation du bois pour le traitement des traverses de chemin de fer, ainsi que des piles utilisées dans la mer et en eau douce. o Le naphtalène, qui intervient comme intermédiaire de fabrication dans de nombreux secteurs de l'industrie chimique tels que les colorants. Le naphtalène est également utilisé comme antimite domestique[9]. 8

13 I.2 Toxicité des hydrocarbures Le coefficient de partage octanol eau (K ow ) traduit la répartition d une molécule d un soluté entre la phase lipophile (octan-1-ol) et la phase hydrophile (eau). Ce coefficient donne une indication sur sa capacité à s'adsorber sur des surfaces hydrophobes, il est aussi un bon indicateur de la capacité des polluants à pénétrer les membranes biologiques et donc à s accumuler dans les organismes vivants. Pour les HAP, les log K ow varient de 3,4 à 6,8, ce qui indique un fort potentiel d adsorption, de plus les HAP sont des molécules biologiquement actives qui, une fois absorbées par les organismes, se prêtent à des réactions de transformation sous l action d enzymes conduisant à la formation d époxydes et/ou de dérivés hydroxylés. Les métabolites ainsi formés peuvent avoir un effet toxique plus ou moins marqué en se liant à des molécules biologiques fondamentales telles que les protéines, l ARN, l ADN et peuvent provoquer des dysfonctionnements cellulaires (cancer). Outre leurs propriétés cancérigènes, les HAP présentent également un caractère mutagène dépendant de la structure chimique des métabolites formés. Ils peuvent aussi entraîner une diminution de la réponse du système immunitaire augmentant ainsi les risques d infection[7]. Le benzo[a]pyrène est potentiellement le plus cancérigène. D autres HAPs sont également reconnus comme étant fortement génotoxiques et cancérigènes, comme le fluoranthène, le benzo[b]fluoranthène, le benzo[k]fluoranthène, le chrysène, le benzo[g,h,i]pérylène et l indéno[123cd]pyrène Devant l impossibilité de mesurer l ensemble des molécules (il existe plus de 600 composés), l Agence pour la Protection de l Environnement Américaine (US-EPA) a incorporé16 HAP à une liste de polluants prioritaires (Figure I.1) [10]. Parmi les 16 HAP de l US-EPA, six sont classés par le Centre International de Recherche sur le Cancer (IARC) comme des cancérigènes probables (groupe 2A : Benzo(a)pyrène, Benzo(a)anthracène, Dibenzo(a,h)anthracène) ou comme des cancérigènes possibles pour l'homme (groupe 2B : Benzo(b)fluoranthène, Benzo(k)fluoranthène, Indéno(c,d)pyrène). Les autres HAP de la liste ne sont pas classifiés (groupe 3) ou n'ont pas été évalués[11]. 9

14 FigureI.1: 16 HAP de la liste prioritaire de l'us-epa et l abréviation communément utilisée[12] 10

15 Nom TableauI.4: cancérogénicité des HAP[8] Classement Classement UE CIRC/IARC Classement US EPA Naphtalène Acénaphtylène Acénaphtène Fluorène Phénanthrène Anthracène Fluoranthrène Pyrène Benzo(a)anthracène Chrycène Benzo(b)fluoranthrène Benzo(k)fluoranthrène Benzo(a)pyrène Dibenzo(a,h)anthracène Indeno(c,d)pyrène Benzo(g,h,i)pérylène nc nc nc nc nc nc nc nc nc 2 nc 2 nc 2B A 3 2B 2B 2A 2B 2A 3 C D D D D D D B2 B2 B2 B2 B2 B2 B2 D nc: non cancérigène, 2:substances devant être assimilés à des substances mutagènes pour l homme. 2A : probablement cancérigène pour l homme ; 2B : peut être cancérigène pour l homme ; 3 : ne peut être classé cancérigène. B1 et B2 : cancérigène probable pour l homme ; C :cancérigène possible pour l homme ; D : inclassable. La toxicité des hydrocarbures HAP est plus importante que celle des hydrocarbures aliphatiques qui, une fois émis dans l environnement, ils sont plus sensibles aux phénomènes d altération et persistent donc moins dans le milieu. Cependant, les alcanes à faible poids moléculaire peuvent présenter des dangers pour la santé. Par exemple, l hexane peut entraîner, lors d une exposition prolongée, une atteinte des nerfs périphériques conduisant à une paralysie des membres inférieurs. Le pentane et l heptane ont une toxicité moindre. Quand aux cycloalcanes, et grâce à leur complète élimination par l organisme, présentent un faible danger d intoxication chronique pour les humains mais peuvent en avoir pour d autres espèces marines (tableau I.6). 11

16 Tableau I.5: Toxicité aigue de n-hexane[8] Voie Espèce CL50/DL50 Inhalation Rat ppm/4h Orale Souris 5000 mg /Kg Cutanée Lapin 3000 mg/kg Tableau I.5: toxicité aigue chez daphnia magna de certains alcanes[8] Substrat CL 50 (mg/l) Toxicité Pentane n-hexane n-heptane n-octane n-décane Non disponible 3,3 0,6 Faiblement toxique Faiblement toxique Non disponible Modérément toxique Toxique Cyclopentane Cyclohexane Méthylcyclohexane cycloheptane 140 2, ,74 Non toxique Faiblement toxique Faiblement toxique Toxique Où CL50 (ou CLx) = Concentration Létale 50 % : concentration en substance qui induit la mort de 50% de la population d'organismes étudiés, pendant un temps donné, par administration unique. Plus la concentration létale est faible, plus la substance est toxique. DL50 (ou DLx) = Dose Létale 50% : dose de substance qui induit la mort de 50 % dans la population d'organismes étudiés, pendant un temps donné, par administration unique. Plus la dose létale est faible, plus la substance est toxique En fin, l exposition prolongée aux hydrocarbures aromatiques monocycliques peut altérer la mémoire et certaines capacités psychiques, ils ont aussi une toxicité prouvée sur l oreille interne pouvant entraîner une diminution de l audition, leur contact prolongé avec la peau ou les muqueuses aura une action dégraissante et desséchante se traduisant par des irritations ou des dermatoses. Le benzène et le plus toxique des composés monoaromatiques. Il se distingue par sa grande toxicité pour les cellules sanguines et les organes qui les produisent. Les affections en résultant vont de la simple anémie à la survenue du cancer du sang [13]. 12

17 I.3 Règlementations A nos jours l environnement est rarement propre. Sa pureté est définie par rapport aux normes fixées par les législations. L environnement est considéré pollué lorsqu il renferme des substances dont les teneurs sont telles qu elles présentent des risques pour la santé humaine ou un danger pour les humains et les écosystèmes[14]. Ces dernières années, une avancée considérable a été constatée dans le monde entier dans le domaine de la réglementation des pollutions, particulièrement, celles dues aux hydrocarbures. Ceci est dû essentiellement à l émergence des préoccupations liées à l environnement et au développement durable dans les différents pays. A titre d exemple, en Algérie, la loi relative à la protection de l environnement (Loi 83-17) pose le principe que l eau doit être protégée contre la pollution et la sur exploitation, et le Décret du 10/07/1993 sur les rejets d effluents liquides industriels, fixe la valeur maximale de 20 ppm pour la somme de concentrations des hydrocarbures dans les rejets, quand aux eaux destinées à la consommation humaine (eau potable) la concentration de la somme des hydrocarbures ne doit pas dépassée la valeur de 10ppm comme il est indiqué dans les normes établies par l organisation mondiale de la santé (OMS) [15,16]. Plus récemment, l Algérie adopte la Loi du 19 juillet 2003 relative à la Protection de l environnement dans le cadre du Développement Durable.Cette loi vise à compléter les lois algériennes déjà en vigueur dans le domaine de l environnement, lesquelles incitent à la protection des eaux souterraines. Elle fixe un objectif ambitieux de bon état de la qualité des eaux en Algérie au futur. A titre d exemple, l article 51 de cette loi interdit tout déversement d eaux polluées dans les eaux souterraines [16]. Dans le domaine de la pollution des sols, les industriels sont soumis au principe de pollueur/payeur (PPP). Ce principe repose sur le fait que le pollueur devrait se voir amputer les dépenses relatives aux mesures arrêtées par les pouvoirs publics pour que l environnement soit dans un état acceptable [14]. A l'heure actuelle, il n'existe pas en Algérie, des réglementations sur les teneurs en hydrocarbures des sols et des eaux souterraines. Les seules données qu on a pu avoir sont : o Les normes néerlandaises pour les BTEX ; o Les VCI française (Valeur de Constat d'impact) pour les HAPs, qui sont des valeurs dites guide, servant de référence et qui correspondent aux valeurs d'intervention audessus de laquelle le site doit être dépollué. Le Tableau I.8 récapitule ces valeurs. 13

18 Tableau I.6: Normes néerlandaises pour les BTEX[17] OMS eau potable µg/l Normes NL nappes µg/l Normes NL sol mg/kg Benzène Toluène Ethylbenzènes Xylènes styrène 20 Tableau I.7: Les valeurs de constat d'impact française pour les HAP[11] OMS eau potable mg/l Normes NL nappe mg/l VCI française sol à usage sensible mg/kg Naphtalène Phénanthrène 5 Anthracène 5 Fluoranthène Benzo(a)anthracène 0,5 13,9 252 Chrysène 0, benzo(a)pyrène 0,7 0, Benzo(g,h,i)pérylène 0,05 Benzo(k)fluoranthène 0, Indéno(1,2,3-0,05 16,1 252 cd)pyrène VCI française sol à usage non sensible mg/kg 14

19 II Comportement des hydrocarbures dans les sols Depuis plusieurs dizaines d années, l apport de quantités importantes d hydrocarbures dans le sol a provoqué une contamination du sol et de l eau souterraine. Celle-ci peut devenir une menace potentielle et sérieuse pour les ressources en eau potable. Face à ce type de pollution, les scientifiques ont été amenés à comprendre les mécanismes de transport liés à ces produits très faiblement miscibles dans l eau, mais malheureusement très dangereux à des doses infinitésimales pour l homme (en particulier les HAP). Le but de cette section est de présenter de manière brève et condensée une synthèse bibliographique portant sur une description générales des sols et des mécanismes gouvernant le comportement des hydrocarbures en milieu souterrain. II.1 Le sol milieu polyphasique Le sol peut être défini comme la couche supérieure de la croûte terrestre composée de particules minérales, de matière organique, d eau, d air et d organismes. D un point de vue pédologique, le sol représente la partie des formations naturelles superficielles soumises aux processus pédologiques et subissant des évolutions plus ou moins importantes de la composition chimique et de la constitution minéralogique. Le sol résulte de l évolution de la roche mère sous jacente transformée en surface par divers facteurs (climat, nature de la roche, activité biologique )[18]. Le sol est donc un système hétérogène et complexe. Il est composé d une phase solide représentée par les particules du sol, une phase liquide représentée par l eau du sol (qui peut être enrichie en de nombreux composés et particules) et une phase gazeuse constituée par l air emprisonné dans le sol. Ceci permet de déterminer un domaine non saturé et un domaine saturé. La zone non saturée constitue une interface entre l atmosphère et l hydrosphère. Dans cette partie, les pores du sol ne sont que partiellement remplis par l eau et le gaz y prédomine. La zone saturée est une zone où l ensemble des pores est rempli d eau [19]. Nous ne présenterons pas dans cette partie une description détaillée des différentes classifications des sols, mais nous nous contenterons de présenter les deux fractions intervenant principalement dans la rétention des hydrocarbures dans le sol, à savoir les fractions organique et minérale [11]. La fraction minérale est principalement constituée de minéraux primaires (quartz, feldspaths, micas ) et de minéraux secondaires, les oxydes métalliques ou les argiles. La fraction organique comprend les composés organiques simples ou complexes. Ils peuvent être classifié en quatre catégories : 15

20 o La matière organique vivante végétale et animale, qui englobe la totalité de la biomasse en activité ; o Les organismes morts regroupés sous le nom de matière organique fraîche; o Des composés organiques intermédiaires, appelés matière organique transitoire provenant de l évolution de la matière organique fraîche ; o Des composés organiques stabilisés, les substances humiques provenant de l évolution de la matière précédente [20,21]. II.2 Origine des hydrocarbures dans les sols Le sol est une ressource naturelle indispensable et précieuse à des points de vue multiples : ses fonctions à la fois économiques, sociales et environnementales. Le sol permet l agriculture, accueille et offre l espace nécessaire à l habitat et aux diverses activités humaines, stocke lui-même d autres ressources naturelles indispensables à toute vie (eau, ressources et combustibles fossiles, minerais ) et par conséquent, il est le réceptacle de divers émissions qui, au-delà d un certain seuil d accumulation, présentent une pollution susceptible de provoquer une nuisance ou un risque pérenne pour les personnes ou l'environnement, au regard de l utilisation future que l on envisage pour le sol. La contamination du sol par les hydrocarbures occupe une position particulière en raison de la toxicité et de l effet cancérogène de certains d entre eux, et des quantités importantes susceptibles d être introduites dans le sol, phénomène qui s est accentué ces dernières années avec l augmentation remarquable de la consommation des hydrocarbures (voir tableau II.1 et figure II.1)[22]. Tableau II.8 Consommation des hydrocarbures en Algérie [23] Consommation Consommation en 10 3 tonnes Taux de croissance en (%) Carburants ,3 GPL ,6 Lubrifiants ,3 Bitume ,4 Les hydrocarbures peuvent être libérés dans l environnement par des phénomènes naturels. Toutefois, on considère que les activités anthropiques sont une importante source de rejet d hydrocarbure dans l environnement. Ce phénomène est logiquement accentué aux endroits où l industrialisation et l urbanisation sont le plus développées [11]. On distingue différentes sources d hydrocarbures dans l environnement selon qu elles sont liées : 16

21 o Au transport ; o A l exploitation des gisements ; o Au rejets telluriques ; o Aux sources naturelles ; o Aux retombées atmosphériques [1]. Le transport des hydrocarbures peut conduire à l introduction de grandes quantités d hydrocarbures, dans l environnement, sous forme de brut pétrolier ou de produits raffinés: carburants et huiles. Cela est principalement du aux : o Déversements plus ou moins massifs lors d accidents de transport d hydrocarbures par route ou chemin de fer ; o Ruptures accidentelles d oléoducs ; o Fausses manœuvres humaines lors des opérations de transfert et de distribution. L exploitation des gisements peut provoquer des déversements lors de ces trois principales opérations : forage, production et transport par oléoduc souterrain. Les rejets telluriques proviennent de différentes sources : o Incendies ou explosions d unités de production industrielle ou de cuves de stockage hors sol dans les centres de distribution ; o Fuites cuves enterrées, industrielles (stations-service par exemple) ou domestiques, résultant souvent de la corrosion des installations ; o Infiltrations à partir de dépôts de déchets industriels et urbains contenant des hydrocarbures, mal stockés et mal contrôlés (exemple : l enfouissement des résidus de distillation de la houille, pratiquée pendant des décennies pour produire le gaz de ville); o Déversements et enfouissements volontaires de déchets d hydrocarbures, liés à des activités domestiques, artisanales, commerciales, agricoles ou industrielles; (figureii.2) [22]. Les retombées atmosphériques concernant les imbrûlés produits lors de la combustion (échappements d automobiles, incendies provoqués après déversement d hydrocarbures, ) ou les hydrocarbures gazeux vaporisés lors de fuites ou de manipulation. Ces composés sont, pour la plupart, rapidement oxydés. Seule une faible fraction retombe sur le sol, le plus souvent à proximité du lieu d émission. Une meilleure connaissance de la photochimie atmosphérique a fait passer, au cours de la période , l estimation de ces retombées de 9 à 0,3Mt/an [1]. 17

22 Les sources naturelles : Les feux de forêts, les éruptions volcaniques et les fuites des réservoirs naturels ont un important potentiel de production de quantités massives d hydrocarbures [11]. Les hydrocarbures sont, également produits, de manière naturelle, par des plantes, des organismes marins, des insectes, des bactéries, des champignons, des mammifères par divers processus qui se déroulent dans les océans, et les milieux souterrains. Les hydrocarbures produits ainsi comprennent des alcanes et des aromatiques. La stabilité de ces composés a fait d eux des marqueurs biologiques et géochimiques d une très grande valeur. Ainsi, le développement des méthodes analytiques (chromatographiques et spectroscopiques) a facilité la réalisation de plusieurs travaux de recherches, qui se sont intéressés à la distribution et l abondance de ces hydrocarbures et d estimer une éventuelle augmentation de leur concentration suite au phénomène de transport et d activités industrielles et prédire les effets des hydrocarbures anthropogéniques sur les processus physiques, chimiques et biologiques [3]. Figure II.2: Les principaux polluants des sites pollués en Frances [14] II.3 Mobilité et transport des hydrocarbures dans les sols Dans un milieu poreux souterrain, lors d un déversement ou de tout autre phénomène pouvant être à l origine de l intrusion d hydrocarbures dans le sol, ces composés forme une phase qu on appel PLNA (phase liquide non aqueuse), la propagation de cette phase s effectue en deux étapes : 18

23 II.3.1 Dans la zone non saturée Dès leur déversement à la surface du sol, les hydrocarbures, sous l action de la gravité, pénètrent rapidement dans la zone non saturée. Leur mouvement vertical dans le sous- sol est à la fois contrôlé par la nature du déversement (quantité déversée et débit d infiltration), la densité, la viscosité et les propriétés capillaires du milieu poreux. Leur migration verticale est accompagnée par un étalement latéral dû à l action des forces capillaires et à la texture du milieu poreux[24]. En effet, des hétérogénéités dans la zone non saturée (ex. présence de couches argileuses, alternance de couches ayant des perméabilités différentes) conduisent à une composante latérale. Ainsi, les hydrocarbures s accumulent sous forme de flaques au-dessus des zones moins perméables, et tendent à migrer latéralement jusqu à atteindre les bords de la couche ou bien une hauteur suffisante (ou pression d entrée) qui leur permet de vaincre les forces capillaires qui s opposent à leur déplacement vertical. Alternativement, leur migration est favorisée à travers les zones les plus perméables telles que les macropores, les fractures, le long des racines et dans les couches de sable qui fournissent une résistance capillaire relativement faible à l écoulement du polluant. Ils continuent leur mouvement vertical dans la zone non saturée jusqu à atteindre la saturation résiduelle pour laquelle ils restent piégés par les forces capillaires. La capacité de rétention des hydrocarbures dans la zone non saturée varie généralement entre 3 à 5 l/m 3 en milieu très perméable, et de 30 à 50 l/m 3 en milieu peu perméable, et les saturations résiduelles dans les milieux sableux sont comprises entre 2 et 5 % du volume des pores. Les hydrocarbures retenus à saturation résiduelle sous forme de ganglions et de flaques sont difficilement mobilisables par les méthodes de traitements et constituent des sources de pollution à long terme car, les hydrocarbures présents dans ces sources seront transportés lentement vers les eaux souterraines sous forme dissoute uniquement, et principalement par le jeu des eaux de pluie, et peuvent ainsi constituer une source de pollution durable de l eau souterraine du fait de leurs faible solubilités dans l eau [14]. 19

24 Figure II.3 : Comportement des polluants dans le milieu souterrain ; cas de produit n atteignant pas la nappe Figure II.4: Piégeage et transport des produits dans la zone non saturée II.3.2 Dans la zone saturée II Produits plus légers que l eau C est notamment le cas des hydrocarbures les plus courants (essences, gazole, solvants aromatiques, ). Le volume de produit non retenu dans la zone non saturée va atteindre la nappe et s étalera progressivement sur la frange capillaire et, si le volume de produit sur la surface piézométrique est suffisant, il formera une «galette» de produit flottant dont la forme dépendra d avantage de la capacité de rétention du milieu et de sa perméabilité au polluant que la vitesse d écoulement de l eau. La figure II.4 illustre ce phénomène. L extension de la «galette» croit en même temps que l arrivé du produit sur la nappe. Elle cesse assez rapidement lorsque cette arrivée se termine. A l équilibre, l épaisseur de la galette est faible, et suivant la nature du produit, elle contient de 10 à 40 litres de polluant par m 3 [17]. 20

25 Les nappes sont, souvent, soumises à des variations de niveaux. Du fait des fluctuations piézométriques, la lentille de produit flottant va se trouver «piégée» dans la zone de battement de la nappe, ce qui a pour effet de la disparition progressive de la lentille de flottant et, ultérieurement, la mise en contact d une tranche importante de terrain contaminé avec l eau circulant dans la nappe [4]. Dans certains cas les fluctuations de la nappe peuvent aussi entraîner un piégeage des hydrocarbures plus légers que l eau, par une couche moins perméable, sous le niveau piézométrique général. (Figure II.5) Il est donc souvent utile de bien connaître l historique des variations de niveau des nappes souterraines dans la mesure où elles permettent d expliquer la position de certaines pollutions ou des manifestations tardives [17]. Figure II.5: Comportement d'un produit plus léger que l'eau et qui atteint la nappe Figure II.6: Effet de battement de la nappe sur la lentille de produit flottant 21

26 II Produits plus lourds que l eau Les produits plus lourds que l eau, comme les plus légers, vont traverser le sol verticalement, en constituant des corps d imprégnation. Quant le produit atteint la nappe, il «coule» au font de l aquifère, et peut s accumuler sur le substratum (figure II.6). Son mouvement est lié à la fois à la forme du substratum (pente éventuelle) et aux conditions d écoulements (direction, vitesse) de la nappe. L exemple le plus connu pour ce type de pollution, est les hydrocarbures halogénés qui, une fois arrivés à la frange capillaire et du fait de leur forte densité et leur faible viscosité, coulent au fond de l aquifère comme le montre la figure II.6suivante [14] : Figure II.7: Comportement d'un produit plus dense que l'eau et qui atteint la nappe Mais quant le produit plus lourd que l eau a une viscosité importante comme, par exemple, les goudrons, ces polluants migrent peu dans la zone non saturée et tendent à rester piégé dans les pores ou à s étaler latéralement. Ainsi, la contamination des nappes par ces produits reste un cas exceptionnel. En revanche, l écoulement de l eau de pluie à travers le site favorise une lixiviation des éléments les plus solubles des goudrons dans la zone non saturée et conduit à leur transfert dans la nappe. Lorsque la pollution est très ancienne, on peut raisonnablement penser que ces transferts sont devenus négligeables [17]. 22

27 II.4 Evolutions des hydrocarbures dans les sols à partir de la source II.4.1 Evolution en phase gazeuse Il s agit du transfert des hydrocarbures présents dans la phase organique (PLNA) et dans la phase aqueuse vers la phase gazeuse du sous-sol. Ce mécanisme se déroule à l interface nappe / zone non saturée et également dans la zone non saturée. Les équilibres sont régis par la pression de vapeur saturante pour le passage phase organique phase vapeur, et par la constante de Henry pour le passage phase dissoute phase vapeur. II Partage entre la phase aqueuse et la phase gazeuse : Le partage d un composé organique entre une phase aqueuse très diluée, en raison de la faible solubilité des composés organiques dans l eau, et une phase gazeuse est classiquement définit par la loi de Henry. La constante de Henry, également appelée «coefficient de partage aireau» décrit la tendance d un composé organique à se volatiliser lorsqu il se trouve en solution aqueuse. Plus la constante de Henry H d un composé est élevée, plus ce composé à tendance à se volatiliser. Dans le cas du transfert phase dissoute phase vapeur, le mécanisme inverse de la volatilisation existe : il s agit du mécanisme de dissolution des vapeurs sous l action d une infiltration d eau (pluie utile) dans la zone non saturée ou du fait des fluctuations de la nappe [25]. II Partage entre la phase organique et la phase gazeuse : La pression de vapeur est, à une température donnée, la force par unité de surface exercée par la phase vapeur d un composé chimique en équilibre avec sa phase solide ou liquide Le transfert de la matière à la phase vapeur est d autant plus élevé que la pression de vapeur est importante [25]. Ce mécanisme dépend de la pression de vapeur de chaque composé mais aussi des gradients de concentration qui existent dans la ZNS, de la densité des vapeurs des contaminants et des propriétés du sol. Par exemple, les BTEX sont volatils avec une pression de vapeur supérieure à 133 Pa, voire très volatils pour les TEX. Cependant, la densité de vapeur des BTEX est supérieure à celle de l air (d = 2,70-3,70), à l exception du méta-xylène et du para-xylène, ce qui empêche la montée des vapeurs et donc la perte vers l atmosphère. Néanmoins, certains hydrocarbures présentent une densité de vapeur inférieure à celle de l air, ce qui permet leur élimination par la volatilisation. C est le cas par exemple du n-nonane, du n-décane, du triméthylbenzène et des composés cycliques alkylés en C9. 23

28 Les propriétés du sol jouent aussi un rôle dans la volatilisation des hydrocarbures. En effet, plus l humidité du sol est grande, plus la quantité de pores disponibles pour le passage des vapeurs est faible, et donc moins la volatilisation sera importante. De plus, la présence d eau dans le sol va conduire à la dissolution des vapeur est leurs transfert vers la nappe sous forme dissoute. La taille des pores influence aussi le mécanisme volatilisation. Dans un sol sableux, les pores ont un diamètre important, ce qui favorise de plus grands transferts de masse de vapeur vers l atmosphère, et donc une plus grande volatilisation. Il faut cependant noter que ce mécanisme peut représenter dans certains cas des risques d exposition si la source est localisée dans des endroits fréquentés [4]. II.4.2 Evolution en phase aqueuse II Mécanismes de relargage des hydrocarbures dans la phase aqueuse du sol Les hydrocarbures présents dans le sol sous forme de gouttelettes d huiles dispersées sont relarguées dans la phase aqueuse par un mécanisme de dissolution. Par contre, lorsque les hydrocarbures sont fixés à la surface des particules ou bien dans la porosité intra particulaire, le relargage vers la phase mobile est contrôlé par un mécanisme de désorption. De plus, les hydrocarbures, comme tous les polluants hydrophobes, sont susceptibles d être entraînés sous forme particulaire, c'est-à-dire qu ils sont fixés sur les particules mobiles. Cet aspect de la mobilité sera abordé sous le nom de transport particulaire [19]. II Dissolution Le contact des hydrocarbures piégés dans le milieu poreux (saturation résiduelle, produit flottant sur le toit de la nappe, ) avec l eau en écoulement entraîne la dissolution de certains composés (figure II.7) [14]. Figure II.7: Dissolution des polluants par la solution du sol 24

29 Généralement, le mécanisme de dissolution est le principal mécanisme de pollution de l aquifère par apport continu de molécules solubilisées, conduisant ainsi à la formation d un panache de pollution par les traces dissoutes dont la propagation est régie par les mécanismes suivants : 1. La convection : C est le transport des polluants dissous sous l effet du déplacement de l eau souterraine. Il est donc lié à la vitesse de déplacement de l eau souterraine qui varie entre quelques dizaines de mètres par an (sable fin) et quelques dizaines de mètres par jours (alluvions grossier), voire un Km/jour (milieux karstiques). Bien que le transport convectif domine en ce qui concerne la propagation des polluants dans la nappe et dans la zone non saturée du sol, d autres phénomènes de transports vont s effectuer tel que la dispersion hydrodynamique[17]. 2. La dispersion hydrodynamique : Il s agit du processus par lequel un panache de polluants dissous dans l eau s étale dans des directions longitudinale (dans la direction de l écoulement), transversale (dans une direction perpendiculaire à l écoulement) et verticale. Ce processus est dû à deux phénomènes : La dispersion cinématique (ou mécanique) : c est un phénomène de mélange lié essentiellement à l hétérogénéité des directions et des vitesses microscopiques au sein du milieu poreux et qui résulte de variations locales de la vitesse d une molécule autour d une vitesse moyenne de l écoulement de l eau souterraine[19]. La diffusion moléculaire : elle provient de l agitation moléculaire et produit un transfert de matière des zones fortement concentrées vers des zones à faible concentration [26]. L expérience montre que, pour la plupart des polluants, la diffusion moléculaire est en général faible a regard de la dispersion mécanique, sauf dans le cas d aquifère peu perméables ou de produits très diffusifs (cétones, éthers,..) [17]. II Les phénomènes de sorptions et de désorptions Le phénomène de sorption est l un des premiers phénomènes auxquels sont soumis les hydrocarbures dans un sol. Il a une influence prépondérante sur le devenir de ces polluants, en particulier sur leur mobilité et leur relargage dans la phase aqueuse. 25

30 L adsorption et l absorption décrivent les processus qui aboutissent à la rétention des hydrocarbures respectivement sur et dans les particules de sol. On définit l adsorption comme le passage d un soluté de la phase liquide, solution du sol, à l interface liquide/solide du sol. Il s agit d un processus qui implique l attraction du composé vers la surface de la particule de sol et sa rétention sur cette surface pendant un temps qui dépend de l affinité du composé pour la surface. Du fait de la nature hétérogène des sols et des sédiments, il est très difficile, expérimentalement, de faire la différence entre l adsorption, décrite précédemment, et l absorption qui correspond à la pénétration du composé dans la phase solide du sol. En effet, puisque ces deux phénomènes ont lieu simultanément et ne peuvent pas être distingués, le terme souvent utilisé dans la littérature est celui de sorption, terme qui ne fait pas la différence entre ces interactions d adsorption et d absorption. La désorption est le phénomène inverse de la sorption phénomène qui conduit au relargage d hydrocarbures dans la phase mobile (aqueuse) et qui est régit par plusieurs paramètres physicochimiques du sol [27]. II Influence des paramètres physicochimiques sur les mécanismes de transferts des hydrocarbures en phase liquide et sur leur sorption Les facteurs environnementaux peuvent avoir une influence sur la solubilité des hydrocarbures et sur leurs mécanismes de sorption et de dissolution. Nous allons présenter successivement l influence de ces différents paramètres dans les paragraphes qui suivent : II Facteurs liés aux caractéristiques des sols La matière organique La matière organique est la partie non vivante de la fraction organique du sol. Elle est constituée d'un mélange hétérogène de résidus de décomposition microbienne et de matière organique fraîche (MOF) [19]. La matière organique du sol se caractérise par une grande surface spécifique et par son pouvoir gonflant permettant la pénétration de l eau et la diffusion d autres molécules, ainsi dans le cas de présence d une substance organique polluante dans le sol cette dernière peut être piégée dans la matière organique, donc la matière organique joue un rôle important dans la sorption des polluant dans le sol. En effet, lorsque la teneur en matière organique dans les sols est supérieure à 1%, la sorption peut être considérée comme un équilibre de partage entre la phase aqueuse et la matière organique du sol par conséquent, on peut, dans ce cas, quantifier ce phénomène par un coefficient K om définit par la relation suivante : K d = K om = C om / C aq 26

31 Où C om est la teneur de polluant organique dans la matière organique du sol (Kg..Kg -1 ). C aq sa concentration dans la phase aqueuse (Kg.m -3 ). La teneur en matière organique du sol n est pas mesurable expérimentalement, on peut obtenir plus facilement la fraction en carbone organique du sol. On remplace alors le coefficient de partage K om par K oc qui est définit par : K oc = C oc / C aq = K om / F oc Où C oc est la teneur de polluant organique par rapport à la teneur en carbone organique du sol, K oc est alors exprimé en m 3.Kg -1. K oc peut être estimé à partir du coefficient de partage octanoleau (K ow ) qui est disponible dans la littérature. Pour un grand nombre de composés organiques la relation empirique suivante peut etre appliquée pour déterminer leur K oc : K oc = 0,63 K ow Cette relation reste valide pour une grande variété de sols et des composés organiques représentant une très large gamme de solubilité dans l eau [11]. La matière minérale Des interactions non négligeables avec la phase minérale peuvent jouer un rôle non négligeable dans la rétention des hydrocarbures, en particulier dans les sols ou les horizons de faible teneur en matière organique. Ainsi, lorsque le pourcentage en carbone organique est inférieur à 0,001 %, il semblerait que les surfaces minérales contribuent de façon significative à la sorption totale des hydrocarbures [27]. L humidité du sol L eau joue un rôle essentiel dans tous les phénomènes physiques, chimiques et biologiques qui se produisent dans le sol. Elle pourra entrer en compétition avec les molécules organiques pour l adsorption sur les matériaux solide, entraînant une baisse de l adsorption des polluants lorsque le taux d humidité du sol augmente [19]. II Facteurs liés aux caractéristiques de la phase aqueuse du sol La force ionique La force ionique des solutions du sol est un paramètre intervenant à différents niveaux dans les mécanismes de transfert solide/liquide. La force ionique des eaux marines est environ de 1M, des eaux souterraines d environ 0,1M et des eaux de surface d environ 0,01M. Il a été observé que les espèces ioniques prédominantes dans les eaux naturelles (Na +, Ca 2+, Cl -,HCO 3- ) diminuent souvent par effet de compétition, la solubilité dans l eau des molécules organiques hydrophobe (hydrocarbures) et favorisent donc leur rétention par la phase solide du sol [12]. 27

32 Le ph Le ph de la solution est un des principaux paramètres gouvernant le partage des molécules organiques entre les phases solides et la phase aqueuse. Le ph, s il n a pas d influence directe sur la mobilité des hydrocarbures, peut en avoir sur les métabolites de dégradation. Le ph peut également contrôler les conditions de biodégradation. Le ph influe indirectement sur la force ionique de la solution du sol et, à travers elle, sur l ensemble des mécanismes de répartition solide/liquide. Il entraîne une modification des équilibres chimiques entre les formes ionisées et les formes neutres, en fonction de la constante d acidité Ka de la molécule considérée. La baisse du ph favorise l adsorption des acides faibles qui s adsorbent principalement sous leur forme neutre ou protonée. Par ailleurs, le ph peut également avoir un effet indirect sur l adsorption soit au niveau de l adsorbant par modification de sa structure et de ses propriétés, soit en agissant sur la composition de la solution aqueuse. Par ailleurs, la modification de la solubilité de certains cations métalliques qui constituent ainsi de nouveaux sites potentiels d adsorption des polluants. La présence de cosolvants La présence de molécules organiques dans l eau peut influencer le comportement des hydrocarbures. En ce qui concerne la solubilité, des molécules codissoutes présentent à plus de 10% du volume total de la solution du sol, elles agissent elles-mêmes comme un solvant (cosolvant) et permet ainsi le passage des hydrocarbures dans la phase mobile et leur transfert vers les milieux souterrains. La présence de cosolvants aurait aussi une incidence sur le processus de sorption. Par exemple, le pyrène a une influence sur la cinétique de désorption du phénanthrène, le pyrène défavoriserait la sorption du phénanthrène sur la matière organique du sol, autorisant ainsi le phénanthrène à se déplacer plus rapidement dans la matrice [12]. II Influence de la température En général, elle a pour effet d augmenter la solubilité des molécules organiques. D autre part, l élévation de la température conduit généralement à une diminution de l adsorption. Les plages de variation de température dans les sols étant relativement faibles, on considère les effets de ce facteur comme plutôt négligeables par rapport aux autres paramètres intervenant dans les processus de sorption et de transports [19]. 28

33 II Le vieillissement Les hydrocarbures sorbés sur le sol peuvent voir leurs interactions de sorption évoluer dans le temps. Certaines études ont montré que le prolongement du temps de contact entre le polluant et le sol entraînait une plus forte adsorption ainsi q une grande résistance à la désorption. On assiste donc à une fraction de polluants non extractible de la phase solide. Cette fraction est souvent signalée sous le terme de «résidus liés». La modification de la désorbabilité et de l extractabilité des polluants avec le temps et la formation de résidus liés sont très peu prises en comptes dans les modèles de description du comportement des polluants dans le sol. En effet, de nombreuses réactions bio physico chimiques avec des cinétiques très variées peuvent avoir lieu dans/entre les différents compartiments du sol avec des conséquences complexes[12]. II Transport particulaire Les colloïdes sont des particules solides, de faibles solubilités dans l eau, dont le diamètre est compris entre quelques nanomètres et quelques micromètres. Parmi les colloïdes présents dans les sols, on retrouve des macromolécules telles que les substances humiques, des microorganismes, des fines gouttelettes de liquides organiques insolubles, et des matières minérales. Lorsqu une partie des polluants dissous (hydrocarbures) se fixe sur les colloïdes, il se crée une seconde phase mobile. Les colloïdes, pour participer au transport des polluants, doivent tout d abord être relargués dans l eau. Ceci se produit généralement par dissolution/précipitation chimique, activité biologique ou désagrégation d agrégat stables. Les colloïdes sont mobiles, leur surface est telle que les colloïdes se repoussent entre eux. En effet ceci évite qu ils se rapprochent les uns des autres pour former des grosses particules. Dans le même temps, la taille des pores du sol doit être suffisante pour éviter l élimination des colloïdes, de la suspension, par effet filtrant. Les colloïdes possèdent généralement des charges négatives à leur surface, ce qui provoque la répulsion des colloïdes entre eux. Cependant, des cations dissous dans la solution peuvent modifier la répartition des charges à la surface et diminuer la répulsion des colloïdes entre eux. Les colloïdes sont alors susceptibles de se rapprocher pour former des plus grosses particules qui ne sont plus mobiles. La présence de sels dissous dans la solution de lixiviation permet donc de stabiliser le sol vis-à-vis du transport particulaire [19]. 29

34 II.5 Conséquence de la pollution des sols pour l environnement et la santé A travers l étude de l évolution des hydrocarbures dans les phases liquide et gazeuse du sol, on peut dire que les terrains contaminés entraînent une extension de la contamination, que ce soit par voie aérienne (entraînement des poussières contaminées et migration des vapeurs) ou souterraines (migration d eaux contaminées), aux environ immédiats du site, où peuvent habiter des populations humaines. Des évaluations précises de la qualité du sol pour bien cerner l ampleur de la contamination sont alors requises. Les impacts d une telle situation peuvent être significatifs. La contamination des humains peut survenir par : o L inhalation des volatils à la surface même du sol ou à l intérieur d un bâtiment dans lequel de l air contaminé pénètre par diffusion ou convection au travers des murs en sous-sol ; o Le contact cutané avec de la terre superficielle contaminée ; o L ingestion directe de terre contaminée (par des enfants) ou de poussières de terre en suspension dans l air ; o L ingestion indirecte de polluants par consommation d aliments contaminés sur le site comme des légumes, des fruits, de la viande d animaux, du lait, des oeufs. o Les risques sur les ressources en eau potable (pompage direct dans les nappes phréatiques), qui ont aussi une relation évidente avec la santé humaine, sont traités différemment et plus simplement au travers d une norme de potabilité. o Les risques écologiques concernent la flore poussant sur le site, la faune diverse y vivant en permanence ou temporairement (par exemple vers de terre, escargots, lapins ) et la faune aquatique d étangs ou de rivières susceptibles d être atteints par la pollution du site considéré[28]. Il faut enfin prendre parfois en compte les risques vis-à-vis du patrimoine immobilier qui peuvent se caractériser par des dégradations matérielles, des nuisances olfactives ou esthétiques et des risques d explosion. Figure II.8 Description schématique des cibles et des voies d'exposition aux hydrocarbures dans les sols 30

35 L application de mesures immédiates de dépollution est alors nécessaire pour réduire les possibilités d exposition des humains et en particulier des groupes les plus vulnérables, tels, les enfants, les femmes enceintes et les personnes âgées. Beaucoup de paramètres sont à prendre en compte avant de faire le choix d'une méthode particulière de dépollution : type de polluant et variabilité de leur comportement (volatilité, adsorbabilité, polarité ), diversité des conditions locales (nature du sol, de la nappe, accessibilité, disponibilité de surfaces utilisables à proximité, zone urbaine ou non), pollution récente ou ancienne, étendue ou non. En plus, les exigences économiques et administratives sont à prendre aussi en compte[22]. 31

36 III Réhabilitation des sols par voie biologique La protection des sols à l égard des pollutions est une préoccupation relativement récente. Si ce souci n est venu que tardivement, c est bien parce que le sol a été trop longtemps considéré comme «une boite noire», une sorte de réceptacle illimité destiné à accueillir nos déchets et les polluants générés par nos activités industrielles et urbaines. La remédiation des sites industriels contaminés par des polluants organiques est l une des priorités dans la recherche environnementale et aussi une grande préoccupation de la société. Ces dernières années, la recherche de méthodes efficaces de remédiation des sites pollués a progressé et la concurrence industrielle s est développée beaucoup plus rapidement que la taille du marché qui est encadré par des textes réglementaires et des considérations économiques. Plusieurs techniques de traitement ont vu le jour afin de tenter de restaurer les sites pollués classés dangereux pour les écosystèmes et la santé humaine. L intérêt d une méthode se mesure à son efficacité, à son coût, à la facilité de sa mise en œuvre, à la qualité du sol obtenu après traitement ainsi qu à la facilité de retraitement des sous-produits générés [29,30]. III.1 Les sites contaminés : Qu est qu un site contaminé? Le site est définit comme «Tout terrain sur lequel sont exercées, en un lieu donné, sous le contrôle d une entreprise, des activités industrielles, y compris tout stockage de matières premières, sous produits, produits intermédiaires, produits finis et déchets que comportent ces activités, ainsi que tout équipement et toute infrastructure, fixe ou non, intervenant dans l exercice de ces activités.» le sol est donc inclus dans le site, des éléments physique artificiels, (aménagement ou équipement réalisés par l homme) ou naturels (eaux superficielles ou souterraines, végétation, faune) pouvant s y ajouter [29]. III.2 Réhabilitation des sols contaminés III.2.1 Généralités sur les technologies de réhabilitation Les différents procédés de décontamination des sols consistent à traiter les sols pour en supprimer, ou en diminuer fortement, le caractère contaminant. Quant aux diverses actions de réhabilitation, elles comprennent à la fois des opérations de dépollutions et de réhabilitation d un site en vue d en permettre un nouvel usage. L objectif final étant de faire disparaître les nuisances et de supprimer, ou de minimiser, les risques vis-à-vis de l environnement, des personnes et des biens [29]. Les procédés de décontamination des sols peuvent être regroupés selon trois familles distinctes : 32

37 Les méthodes ex situ qui consistent en l'excavation des sols contaminés. On parlera de méthode "hors site" si le sol est évacué vers un centre de traitement spécialisé, ou de méthode "sur site" si le sol excavé est redéposé sur le site pour être traité, Les méthodes in situ pour lesquelles l'opération de dépollution s'effectue sans excavation du sol. Cette option est souvent choisie pour traiter des sites en activité ou lorsque la zone polluée est trop étendue pour avoir recours à l'excavation Le confinement qui consiste à isoler la pollution à l'aide d'ouvrages étanches, La dépollution peut être mise en oeuvre à travers les techniques suivantes : Physiques, Chimiques qui font appel à un principe réactionnel (action d'un solvant, oxydation ) pour transformer le polluant en un composé moins toxique et inerte vis-à-vis de l'environnement, Thermiques qui consistent à chauffer le matériel contaminé pour en extraire le polluant et le détruire, Biologiques qui favorisent la biodégradabilité des produits [11]. Dans ce chapitre, nous allons exposer les méthodes biologiques (biodégradation) employées pour la remédiation des sites contaminés par les polluants organiques et notamment les hydrocarbures. III.2.2 Le principe de base du traitement biologique «biodégradation» La biodégradation est un phénomène naturel. Elle est le résultat de la dégradation des molécules organiques carbonées par les microorganismes (bactéries, champignons ). Leur croissance s effectue par l intermédiaire de l oxydation du carbone qui est utilisé comme source d énergie [31]. Cette réaction met en jeu deux autres éléments : L azote et le phosphore qui participent à la synthèse protéinique, Un oxydant. La réaction est de type «redox», ce qui signifie que les atomes de carbone perdent des électrons au profit de l oxydant, appelé pour cette raison «accepteur d électrons». Le processus se développe selon une réaction en chaîne, où les composés carbonés sont transformés, par cassures successives, en molécules de moins en moins complexes, jusqu à l obtention de sous produits simples, généralement le CO 2 et H 2 O. Les produits de transformation sont appelés métabolites [32]. 33

38 III.2.3 Mécanismes de biodégradation Ils existent deux types de mécanismes ou métabolismes de dégradation qui sont communément impliqués dans la biodégradation des composés organiques: III Biodégradation primaire Dans ce cas, les molécules organiques dégradées sont considérées comme des sources de croissances primaires, puisqu elles sont directement impliquées dans la croissance bactérienne [33]. III Cométabolisme Il s agit d un mécanisme dans lequel la dégradation des composés organiques est complètement fortuite et les microorganismes n en retirent aucun bénéfice. L US-EPA en donne la définition suivante : «Un composé est biodégradé par cométabolisme quand cette dégradation est catalysée par une enzyme (ou un cofacteur) produite fortuitement par le microorganisme pour d autres objectifs. Les microorganismes ne retirent aucun bénéfice de cette dégradation.» C est le caractère peu spécifique de ces enzymes ou cofacteurs qui leur permet de dégrader également le composé [34]. Hydrocarbures CO 2 + H 2O + Biomasse + Énergie Figure III.9 Schématisation du processus de biodégradation La figure III.1 schématise la biodégradation de la matière organique qui est le principe de base des techniques de biodécontamination qui consistent donc à stimuler ce phénomène naturel pour en augmenter le rendement, afin de réduire en un minimum de temps le polluant organique, utilisé comme source de carbone. La biodécontamination est une réelle méthode de dépollution, et non un simple transfert de polluant d un milieu à un autre, puisque les molécules sont décomposées au cours du processus. 34

39 Par rapport aux autres techniques de dépollution, la biodécontamination prend aujourd hui de plus en plus d importance ; ainsi aux USA, son développement technologique est maximum et elle représente la seconde méthode utilisée (après les techniques de Venting) en alternative des solutions classiques de confinement et d incinération, pour le traitement des produits organiques volatils et semi-volatils [35]. III.2.4 Facteurs influençant la faisabilité de la technologie pour la biodégradation des hydrocarbures L efficacité d une technique de biodégradation mise en œuvre pour décontaminer un site précis, va dépendre de nombreux facteurs, qui devront être pris en compte lors de la conception de l opération. En effet, il n existe pas de procédé standard utilisable dans tous les cas, où le succès est garanti. Avant de proposer l utilisation de la biodécontamination, une série de précautions doit être prise sous peine de prendre le risque de voir la méthode totalement inopérante ; certains tests seront réalisés, ainsi que la mesure de certaines caractéristiques propre au milieu à traiter ou au polluant à dégrader. III Biodégradabilité du polluant Le premier facteur à prendre en compte est la biodégradabilité du polluant, notion difficile à cerner, parfois peu précise, ce terme regroupe les qualités nécessaires à une substance pour subir un processus d altération microbienne qui résulte soit d attaque enzymatiques (action directe des microorganismes), soit de modifications chimiques de l environnement tels que le ph, sous-produits du métabolisme. qui ont pour conséquence l altération physique et/ou chimique du polluant [5,32]. En ce qui concerne les hydrocarbures, ces composés diffèrent par leur susceptibilité à l attaque microbienne. Ainsi la vitesse de biodégradation est plus élevée pour les saturés, viennent ensuite les aromatiques légers et enfin les aromatiques à haut poids moléculaire. Les hydrocarbures saturés incluent les n-alcanes, les alcanes ramifiés et les cycloalcanes(naphtènes). Les alcanes normaux ou à chaînes linéaires sont les plus rapidement dégradables: Les n-alcanes à chaînes courtes, tel que le n-nonane ne sont pas toujours assimilés, mais peuvent être oxydés. Seules quelques bactéries ont la capacité de croître sur des alcanes plus courts que le n-octane. Les n-alcanes à nombre de carbone supérieur à 44 peuvent être métabolisés par les microorganismes mais ceux ayant de 10 à 24 atomes de carbone (C10-C24) sont généralement les plus facilement dégradables. Les alcanes ramifiés sont plus récalcitrants à la biodégradation que les n-alcanes et plus le nombre de ramifications augmente, moins ces composés sont susceptibles à la dégradation microbienne [3]. au 35

40 Mais en général les métabolites obtenus au laboratoire sont des composés d acides gras, des acides et d alcools ayant une toxicité moindre voire inexistante (non classé par l IARC) [8]. Tableau III.9: Produits métabolitiques issus de la dégradation des alcanes Substrat Organismes Produits identifiés Heptane Aucune désignation Acide carboxylique C 5, C 2 et C 1 Hexane Heptane Heptane P473 Acide carboxylique C 6, C 4, C 3 et C 2 Acide carboxylique C 7, C 6, C 5, C 4, C 3 et C 2 Acide succinique et carboxylique C 7, C 6, C 5, C 4, C 3 et C 2 Acide glutarique, acide pent-4-enoique, acide hept-6-enoique Hept-1-ène Heptane P.aeruginosa Hept-1-ène Heptane Acide heptanoique, acide pimélique «R» Octane Acide butyrique, acide acétique, acide adipique et acide subérique Octane Aucune désignation Acide acétique, acide propionique et acides non identifiés Décane P.aeruginosa9904 Acides C 7, C 8, C 9, C 10 ; 1-,2-,3-,4- et 5-décanols+1-5-cétones Tétradec-1- Acide tétradécanoique et acide tétradéc-13-énoique P.aeruginosa ène Hexadécane Aucune désignation Hexadécanol Hexadécane P.aeruginosa Acide palmitique, acide pamlitoléique, acide stérique, acide oléique, acide b-hydroxylaurique et b-hydroxymyristique Hexadécane Aucune désignation Hexadéc-1-ène Octadécane Aucune désignation Octadécanol Les hydrocarbures cycliques constituent une fraction d hydrocarbure plus difficilement dégradable que les deux séries précédentes à cause de leur toxicité suite à l interaction avec la membrane cellulaire des microorganismes. Les expériences montrent de façon non équivoque que la biodégradation des cycloalcanes est très limitée. La non accumulation des hydrocarbures cycliques dans l environnement, implique des phénomènes non conventionnels de dégradation tel que l intervention des phénomènes de co-oxydations impliquant plusieurs souches microbiennes dont l équipement enzymatique est complémentaire [3,36]. Pour Les hydrocarbures aromatiques des études sur leur transformation par les microorganismes ont montré leur toxicité cellulaire. Les hydrocarbures aromatiques de faible poids moléculaires, tels que les alkyl-benzènes légers, sont les plus toxiques à cause de leur solubilité dans l eau, mais peuvent cependant être métabolisés par les microorganismes quand ils sont présents en faibles concentrations. La structure moléculaire de ces substrats détermine la vitesse de leur dégradation: un grand nombre de substituants méthyle empêche l oxydation initiale. Les polyaromatiques sont moins toxiques pour les microorganismes, les recherches sur la dégradation des HAPs ont permis l isolement de nombreuses espèces de bactéries, de champignons et d algues capables de dégrader les HAPs de petit poids moléculaire (2 à 3 cycles benzéniques). Les plus gros HAPs sont généralement récalcitrants à l attaque microbienne, c est ce qui explique leur accumulation dans l environnement [3,37]. Tableau III.10 :Principales souches bactériennes aérobies qui participent à la dégradation des HAPs Composé Microorganisme Produits 36

41 Naphtalène Speudomonas sp Acide salicylique, catéchol, acide gentistique Acinetobacter Acide salicylique calcoaceticus Mycobacterium sp Acide salicylique, catéchol Rhodococcus sp Acide salicylique, acide gentistique Fluorène Pseudomonas sp 1,1-dihydroxy-1-9 hydrofluorénone Rhodococcus sp 9-fluorenol, 9-fluoorénone, 1-indanone Mycobacterium sp Staphylococcus 4- et 1-hydroxy-9-fluorénone Auriculans Anthracène Pseudomonas Acide salicylique et cathéol aeroginosa Rhodococcus sp Phénanthène Pseudomonas sp 1,2-dihydroxynaphtalène Pseudomonas CO 2 Paucomobilis et P.fluorescens Fluoranthrène Pseudomonas 3-hydroxymethyl-4,5-benzocoumarique Paucomobilis Alcaligenes denitrificans Pyrène Mycobacterium spp CO 2 Benzo(a)anthracène Beijerinckia sp Cis-10,11-dihydrodiol chrysène Rhodococcus sp Benzo(a)pyrène Beijerinckia sp Cis-7,8- et cis-9,10-hydrofluorénone Pseudomonas spp Lorsqu elles sont isolées, de très nombreuses molécules organiques sont aujourd hui considérées comme biodégradables ; par contre, lorsqu elles constituent des mélanges de produits se développent des phénomènes d inhibition, stoppant le processus de biodégradation, parfois avec empoisonnement des microorganismes présents. Ainsi, la présence de pesticides ou de métaux lourds, toxiques pour la biomasse, va inhiber la biodégradation d autres composés organiques comme les hydrocarbures. La biodégradabilité d un mélange d hydrocarbures est également très fortement dépendante de leur composition; Par exemple, un brut à très faible teneur en soufre et très riche en composés saturés (exemple: Louisiane du Sud) (Tableau III.3) sera facilement biodégradé, contrairement à un fuel de type"buncker C", à très haute teneur en soufre et composés aromatiques. Nous signalons également que les n-alcanes contenus dans un pétrole provenant du Vénézuéla sont moins bien dégradés que ceux présents dans un pétrole de type "Léger d Arabie", par suite de la présence de produits à plus longue chaîne. Tableau III.11: Proportions des différentes familles de composés dans divers bruts pétroliers Bruts Polaires Saturés Aromatiques pétroliers (résines) Asphaltènes Louisiane du sud

42 Koweit Buncker C Léger d Arabie Tunisien (asthart) Vénézulien Prudhoe Bay Les voies de dégradation anaérobies La dégradation des hydrocarbures par les microorganismes dans des conditions aérobies est bien connue depuis plus d'un siècle, alors que l'utilisation de ces composés dans des conditions anoxiques n'a été étudiée que durant la dernière décennie. Différentes souches de bactéries anaérobies capables de dégrader les hydrocarbures ont été isolées de sites contaminés (Tableau III.4) [3]. TableauIII. 12: Exemples de bactéries anaérobies dégradant les hydrocarbures aromatiques et aliphatiques Espèce ou souches bactérienne Hydrocarbures métabolisés Bactéries dénitrifiantes Thauera aromatica T1 Azoarcus tolulyticus Td15 Azoarcus sp.souche EB1 Souche HxN1 Souche HdN1 Bactéries réduisant le fer Geobacter metallireducens GS15 Bactéries réduisant le sulfate Desulfobacula toluolica Desulfobacterium cetonium Souche AK-01 Toluène Toluène, m-xylène Ethylbenzène Alcane (C 6 -C 8 ) Alcane (C 14 -C 20 ) Toluène Toluène Toluène Alcanes (C 13 -C 18 ) Néanmoins la dégradation anaérobie des hydrocarbures par les microorganismes peut se produire mais à des vitesses négligeables et son importance écologique est considérée comme de moindre importance [37]. III Concentration et répartition du polluant sur le site Outre la biodégradabilité du polluant, sa concentration et sa répartition sur le site sont également importantes à considérer lors de l application de la biodécontamination. En effet, à 38

43 partir d une certaine concentration les composés organiques, notamment les hydrocarbures peuvent devenir toxiques pour les microorganismes qui sont censés les dégrader [32]. De plus, en milieu complexe comme les sols, la distribution des hydrocarbures est hétérogène : ils peuvent être sorbés sur les particules organiques, localisés dans des petits pores inaccessibles aux bactéries (voire chapitre précédent) ce qui limite le transfert de matières des hydrocarbures vers les compartiments aqueux, où il y a biodégradation [7]. lieu les phénomènes de Pour résoudre ce problème, il peut être nécessaire d'augmenter leur biodisponibilité par ajouts de tensioactifs [11]. III Le choix de l accepteur d électrons et des nutriments Ces deux facteurs représentent toujours un point clé de la faisabilité d une opération de biodécontamination. Pour l accepteur d électrons, il existe une importante littérature technique mais son choix est encore loin de faire l unanimité aujourd hui. En aérobie, l accepteur d électrons est l oxygène, et on parle de respiration aérobie selon la formule : O 2 gazeux +4H + + 4é 2H 2 O Environ 3 Kg d oxygène est nécessaire pour dégrader 1 Kg d hydrocarbures. L oxygène peut être fourni sous plusieurs formes, soit : o L air atmosphérique ; o L oxygène pur ; o L ozone (O 3 ) ; o Le peroxyde d hydrogène (H 2 O 2 ) ou «eau oxygénée» [32,38]. L utilisation d air atmosphérique, ajouté par diffuseurs dans l eau à injecter, est à priori peu efficace, la quantité d oxygène nécessaire pour réaliser l oxydoréduction étant rarement atteinte. Pour cela, elle est aujourd hui tombée en désuétude. Les procédés utilisant de l ozone et de l oxygène pur permettent d augmenter le niveau de l oxygène dissous dans l eau, relativement à une simple aération : cependant, leur utilisation nécessite des conditions techniques particulière (générateur d ozone, emploi de l oxygène liquide) peu aisées à maintenir sur place, ce qui a toujours limité leur application. Par contre, le peroxyde d hydrogène présente, sur les autres formes de l oxygène, plusieurs avantages intéressants, qui ont favorisé son utilisation : sa solubilité illimitée dans l eau, sa facilité de transport et de mise en œuvre, et sa facilité d utilisation par les microorganismes [32]. 39

44 Cependant cette source d'oxygène présente trois inconvénients majeurs : il se décompose rapidement dans le sous-sol, son coût élevé, le caractère corrosif de H 2 O 2, qui attaque les puits d'injection et le pouvoir désinfectant de H 2 O 2 si celui-ci est utilisé à de fortes concentrations. [11,38]. En dehors de l oxygène, d autres accepteurs d électrons peuvent être mis en œuvre, en conditions peu oxydantes ou en anaérobie vraie. Ainsi, la dénitrification utilise les nitrates comme accepteur d électrons, selon la formule : 2NO H é N 2 gazeux + 6H 2 O Par rapport au peroxyde d hydrogène, la cinétique de réaction et le développement de la biomasse sont cependant beaucoup plus faibles avec les nitrates, ce qui pénalise fortement le rendement de la biodégradation réalisée avec un oxydant. On peut aussi citer deux exemples de l utilisation d accepteurs d électrons en anaérobie, par méthanogène, en fabriquant du méthane à partir du CO 2 Ou par réduction des sulfates CO 2gazeux + 8H + + 8é CH 4gazeux + 2H 2 O [39]. (SO 4 ) H + + 8é HS - + 4H 2 O Pour ces deux derniers exemples, le potentiel redox est cependant beaucoup moins élevé que pour la respiration aérobie ou la dénitrification (de l ordre de 5 à 6 fois) [3]. Pour les nutriments, le choix est moins complexe, tous les auteurs reconnaissant que les formes de phosphore et d azote les mieux assimilables par les microorganismes sont les orthophosphates et l ammoniac. Pour l azote, les principales sources sont donc les sels d ammonium (par exemple ((NH 2 ) 3 PO 4 ) ou l urée ((CO(NH 4 ) 2 ) ; les nitrates sont parfois utilisés également, les expérimentateurs jouant alors à la fois sur ses qualités d accepteur d électrons et de nutriments[32]. III Les caractéristiques du milieu à traiter Outre le stock de C/N/K et la quantité d oxygène disponible dans le milieu à traiter, d autres caractéristiques physicochimiques peuvent également avoir une influence sur le rendement de la biodégradation, avec principalement le ph, la température et l humidité. III Influence de la température La température est un paramètre pouvant influencer la biodégradation d un mélange d hydrocarbures en modifiant son état physique, sa composition chimique, l activité 40

45 physiologique des microorganismes et par conséquent la vitesse de dégradation, ainsi que la nature et la concentration des espèces microbiennes présentes[3]. Une diminution de la température est généralement accompagnée par une diminution de la vitesse de biodégradation qui peut être expliquée par une décroissance de l activité enzymatique. Des températures plus élevées ont pour effet d augmenter la vitesse de biodégradation. Si l oxydation des hydrocarbures a été observée à des températures inférieures à 0 C, ou élevées à C, le maximum de l activité métabolique des microorganismes est généralement observé à une température comprise entre 15 et 45 C. Au delà de cet intervalle on assiste à une augmentation de la toxicité des hydrocarbures et une diminution de l activité métabolique [3,37]. III Effet du ph Les sols peuvent avoir des valeurs de ph très variables, allant de 2,5 à 11,0. Des valeurs extrêmes de ph, ce qui est le cas pour quelques types de sols, pourraient avoir une influence négative sur la capacité des microorganismes à dégrader les hydrocarbures. La croissance des bactéries hétérotrophes et des champignons étant favorisée par un ph proche de la neutralité [3]. III Effet de l humidité Pour l humidité, la teneur en eau du matériau doit être comprise entre 25 à 85% et son rôle se situe au niveau du transport et des échanges biochimiques. En cas de tendance à la dessiccation, il sera nécessaire de réhumidifier le milieu [32]. III Effet des caractéristiques physiques Pour des dépollutions réalisées in situ, certains paramètres physiques du sol et de l aquifère sont déterminants pour la réussite de l opération. Il s agit entre autres, de la perméabilité du sous-sol, de son homogénéité, de la profondeur du niveau de la nappe Il est clair que la caractéristique la plus importante est la perméabilité ; en effet, si le sous-sol n est pas assez perméable (présence de limon, d argile), cela provoquera une mauvaise circulation des fluides contenant les nutriments et l oxydant, et une baisse de l oxygénation, limitant l extension et le rendement de la biodégradation. On considère habituellement qu au dessous d un cœfficient de perméabilité de 10-6 m/s dans le milieu à traiter, une décontamination in situ par voie biologique est difficile à mettre en place [35]. 41

46 Si le sous-sol est hétérogène, le processus aura tendance à se développer de façon différentielle, laissant intactes des poches plus résistantes à la décontamination où les polluants n auront pas été touchés. De même, si la nappe est proche de la surface (moins de 2-3 mètres), la zone non saturée, peu épaisse aura tendance à être mal oxygénée et il sera difficile d homogénéiser les ajouts envoyés dans le sous-sol sur une grande épaisseur ; au contraire, si le niveau de la nappe est profond (> 20 mètres), une oxygénation efficace du sous-sol et une bonne percolation des produits ajoutés sera possible [32]. III.2.5 Traitement in situ III Biodégradation par traitement in situ Les traitements in situ du sous-sol consistent à réaliser une opération de bio décontamination en place, en prenant en compte à la fois le sol et l eau souterraine. Ce traitement est intéressant lorsqu on doit par exemple dépolluer sous les bâtiments ou encore lorsque la contamination est présente en profondeur. Un autre cas typique de situations favorables à une réalisation in situ, concerne l extension latérale d une pollution en hydrocarbures pétroliers sur une distance parfois relativement grande [35]. III Le procédé appliqué Le procédé dans un traitement in situ consiste à injecter l eau dans le sous-sol, dans laquelle sont dissous le phosphore, l azote et l oxygène, pour activer la flore bactérienne. Dans la majorité des cas, c est la flore autochtone qui est la seule mise à contribution. Parfois, si la flore locale est inadaptée à la dégradation du polluant présent, ou trop peu abondante, la technique va consister à provoquer leur développement au laboratoire à partir d échantillon prélevés et de les ré-inoculer ensuite dans le milieu, ou encore d inoculer des souches allochtones. Ces microorganismes, directement fabriqués pour dégrader spécifiquement une molécule ou un groupe de molécules, devront s adapter aux conditions du milieu où elles seront inoculées, pour permettre une meilleur adaptation, les souches à inoculer sont développées, sur un support (zéolites, carbonates, matériau composite, ), qui sera utilisé pour le traitement et mélangé directement à l eau à injecter dans le sol. Il s agit alors d une bioaugmentation [40]. III Le bioventing et le biosparging Lorsqu on parle de bioventing, on réalise une aération forcée dans le sol non saturé; lorsqu on emploie le terme de biosparging, l air est injecté directement dans la nappe phréatique. 42

47 Cet apport d oxygène favorise le développement de la biomasse, Par ailleurs, un apport de nutriments est généralement nécessaire pour rééquilibrer le rapport carbone, azote, phosphore. Ceux-ci mélangés à l eau, sont soit injectés dans la nappe en amont de la zone à traiter, soit infiltrés directement dans le sol de la zone par aspersion ou lagunage [36]. Exemple de résultats obtenus: Figure III.10 : Le schéma d'un dispositif de bioventing[41]. Aux USA par exemple, le bioventing est maintenant couramment utilisé pour dépolluer notamment les terrains d aviation militaires ou les zones de stockages des carburants de l armée. Il a été pratiqué à Westover Air Reserve Base, dans le Massachusset. Ce site est utilisé pour les exercices de lutte incendie par les américains. Pendant ces exercices des volumes importants de fuel sont déversés. Après un traitement par bioventing pendant 6 ans la teneur en BTEX (Benzène, Toluène, Ethylbenzène, Xylène) est passée de4,8mg/kg à 0,6mg/kg dans le sol, et de 8000micro grammes/kg à 3micro grammes/kg. Le traitement a été appliqué, également, à Fort Rucker en Alabama qui est un lieu de stockage des carburants pour les hélicoptères. Sur ce site le total des hydrocarbures pétroliers, dans le sol, est passé de 10000mg/kg à2 770mg/kg après deux ans de traitement [35]. III.2.6 Traitement sur sites Ce type de traitement est envisageable lorsque les terres polluées sont facilement accessibles et leurs volumes tels que leur excavation et leur transport ne génèrent pas des coûts trop élevés. III Le traitement en bio réacteur Le principe du bioréacteur consiste à réaliser la biodégradation du polluant dans un contenant installé sur le site (cuve fermée, bassin, colonne ), en ajoutant au matériel à traiter, les ingrédients nécessaires à la réaction [11]. 43

48 Cette technique s'adresse à des sols pollués par des substances peu biodégradables, type HAP, et pour des sols généralement difficiles à traiter comme les sols argileux [42]. Les principaux atouts de cette technique sont sa facilité à contrôler et maintenir les conditions optima de traitement ; les durées de mises en oeuvre sont plus courtes et n'excèdent généralement pas 6 à 9 mois ; enfin la structure du sol n'est pas trop altérée et sa réutilisation est envisageable pour des usages de reconstruction paysagère [35]. III Traitement de matériaux solides (sol, remblai souillé,déchets..) Pour ce type de traitement une préparation est nécessaire incluant des opérations d homogénisation, broyage, démottage, tamisage Ce matériel est mélangé à l eau (généralement en proportion de 30% poids/volume) et introduit dans le réacteur par pompage [11]. Figure III.11: Schéma d'un bioréacteur [41]. Dans la plupart des dispositifs, il y a plusieurs réacteurs en chaîne, la «phase boue» transitant de l un à l autre. Au niveau du premier réacteur, sont ajoutés les quantités de nutriments nécessaires. Des micro-organismes sont également ajoutés à ce niveau si nécessaire. Dans chaque réacteur, un brassage mécanique est réalisé, permettant un mélange vigoureux de l ensemble des constituants de la réaction (bras tournant à l intérieur, rotation de la cuve ) Une aération habituellement sous forme d air pulsé par le fond du réacteur, complète le dispositif. Cet air chargé d une éventuelle phase gazeuse polluante, est récupéré au sommet de cuve et est dirigé vers un système d épuration (bio filtre par exemple) avant son dégagement dans l atmosphère. 44

49 Une fois la boue traitée elle passe dans un séparateur solide/eau; la terre est alors stockée avant remise en place, tandis que l eau, contenant de nombreux micro-organismes adaptés, est généralement recyclée. Cette façon de procéder permet aussi de réduire les temps d acclimatation des micro-organismes et de traitement pour la suite de l opération. Pour des sols ou des déchets, cette technique est particulièrement adaptée si on est en présence de fortes teneurs en polluants organiques, avec une phase huile individualisée importante. Le processus est réalisé entre autre pour décontaminer des terres polluées par des HAP, des phénols et, de façon plus classique, des produits pétroliers de type gasoil et fuel [32]. Tableau III.13 : Exemples de résultats obtenus par bioréacteur Composés Concentration initiale Taux de réduction (mg/kg) (%) Organiques volatiles Phénanthrène (HAP) Carbone organique total Temps de traitement (jours) III Traitement des gaz Pour le traitement des gaz émis dans le bioréacteur, l emploi d un bio filtre représente souvent une solution efficace et peu onéreuse. Le filtre biologique est formé de compost, milieu idéal pour la croissance des bactéries, ou de tourbe. Son installation peut être effectuée selon deux dispositifs: le filtre «en lit», ou le filtre «en paquet». Ce dernier (schéma ci-dessous) est formé d une couche de compost humidifiée maintenue entre deux grilles dans une cuve fermée; l air chargé en polluants est injecté par le bas à faible pression, au travers d une couche à porosité grossière (gravier, support plastique), qui va favoriser sa répartition régulière dans la cuve. Un robinet installé au fond pour récupérer l eau de condensation, et un aspergeur placé au dessus du compost, pour l humidifier au besoin, complètent l installation. Figure III.12: Schéma d'un biofilm 45

50 Avant son passage dans le filtre, le gaz est humidifié, par exemple par barbotage dans l eau (jusqu à 80 à100% d humidité relative). Le maintient de bonnes conditions d utilisation du filtre permet de dégrader jusqu à90% des polluants présents (BTX notamment); pour le compost, les principaux facteurs de réussite sont un taux d humidité de 50 à 70%, une porosité comprise entre 80 et 90%, un ph de 7 à 8 et une température variant de 15 C à 45 C [35]. III.2.7 La biodégradation en «tas» Le principe de base de la biodégradation en tas consiste à excaver le sol et à le disposer à proximité, en respectant certaines modalités techniques visant à favoriser la biodégradation aérobie naturelle. III Le compostage C est la technique la plus simple. Le sol excavé est disposé en andains régulièrement espacés, de quelques mètres de circonférence et d environ 1m de haut. Pour accélérer la biodégradation, il est d usage de mélanger la terre à un substrat organique grossier qui favorisera l aération et apportera un complément nutritif à la réaction; on peut utiliser pour cela des matériaux tel que la paille, les débris d écorces ou de broussailles, du fumier [32]. III Le «land farming» C est une technique plus élaborée qui consiste à traiter le matériau comme un sol agricole pour en faciliter la décontamination. Le sol pollué est tout d abord étalé régulièrement sur de grandes surfaces planes, sur une épaisseur de quelques dizaines de centimètres, permettant par la suite le passage et le travail d outils agricoles; pour éliminer le risque d une répétition de la pollution du sol sous-jacent, cet étalement est réalisé généralement sur des surfaces imperméables [11]. Un fertilisant est ensuite ajouté, soit sous forme d engrais chimique, soit sous forme de fumier, ou encore un ensemencement de légumineuses, plantes qui fixent l azote atmosphérique, peut servir d «engrais verts».. A intervalles réguliers, le sol est travaillé, retourné et biné, pour permettre son aération. Les techniques de compostage et de «land farming sont particulièrement adaptées à la biodégradation hydrocarbonés peu volatiles (fuels, diesel ). Après une période de plusieurs mois, les hydrocarbures sont généralement totalement consommés [35]. 46

51 Tableau III.14 : Exemples de résultats de traitements par land farming et compostage Concentration initiale Taux de réduction (%) (mg/kg) Composés Land farming Huile lourde Huile légère Hydrocarbure Compostage Huile Temps de séjour (jours) III Le traitement en «bio pile» Pour des sols pollués contenant des contaminants volatils en quantités non négligeables, ou dans des pays où la législation interdit le traitement de dépollution à l'air libre (Québec par exemple), l'utilisation de la "biopile" est nécessaire. Les réacteurs à l'air libre sont alors remplacés par des réacteurs où les flux de gaz et de liquide sont parfaitement contrôlés. On réalise une pile de plusieurs mètres de haut que l'on place sur une couche drainante. Un système d'aspersion et un système de rigole sont mis en place. Pour les gaz, le procédé utilise le plus souvent un système de ventilation/extraction qui permet d'aspirer les composés émis ou d'injecter de l'air frais. Une couverture étanche (géomembrane) vient recouvrir l'ensemble[11]. Figure III.13 :Schéma d'une bio pile Exemple de rendement de traitement en bio pile: Dans le cas des huiles, on passe des teneuses moyennes de l ordre de 3000 mg/kg d hydrocarbures totaux dans le sol, à une fourchette allant de 100 à 300 mg/kg après sept mois de traitement (de novembre à juin). Concernant les HAP, produits beaucoup plus difficiles à dégrader par la voie biologique, il passe de120mg/kg à environ 20mg/kg en neuf mois de traitement. 47

52 III.2.8 Traitement en voie de développement «phytoremédiation» Sous cette appellation sont regroupées plusieurs processus qui utilisent les végétaux (avoine, lupin, colza ) comme épurateurs du milieu. Jusqu'alors la phytoremédiation était essentiellement appliquée aux métaux lourds, mais de récentes études ont montré que cette technique était utilisable pour les HAP. Cependant, les mécanismes sont encore mal compris. La phytorémédiation présentent des avantages: Elle est sans danger pour l environnement, économique et esthétiquement plaisante; Elle peut réduire la pénétration des contaminants dans l environnement en empêchant leur déversement dans les réseaux d eaux souterraines. Elle peut servir à nettoyer une grande quantité de contaminants. La phytorémédiation présente également des inconvénients: C est un processus lent puisqu il dépend du cycle naturel des plantes; La phytorémédiation a plus de succès lorsque la contamination se situe à proximité des racines des végétaux, en général à une profondeur de 1 à 1,80m pour les plantes herbacées et de 3 à 4,5m pour les arbres; Certaines plantes qui absorbent une grande quantité de métaux toxiques pourraient mettre en danger la chaîne alimentaire si des animaux les mangent [35]. 48

53 IV Réhabilitation des sols par voie chimique La biodécontamination est une réelle technologie de dépollution qui détruit les contaminants au lieu de les transférer à un autre milieu, mais elle a montré ces limites, car elle ne vaut que pour les produits biodégradables. De plus, la durée d application de cette technologie s étale généralement sur plusieurs mois, pour des applications in situ ou sur site, ce qui est néfaste surtout dans le cas où on doit dépolluer une zone le plus rapidement possible pour limiter les risques liés à cette pollution. Dans ce cas, il faut envisager l application d autres technologies plus adaptées à ce type de besoins comme les traitements chimiques. IV.1 Le principe des traitements chimiques Les traitements chimiques ont pour but de détruire les polluants ou de les transformer en une forme moins nocive pour l environnement. Le principe est simple : on injecte dans le sol un réactif chimique approprié au type de pollution. Ce réactif réagit avec certains polluants qui deviennent plus faciles à extraire. Certaines conditions opératoires sont nécessaire : le sol et les réactifs doivent être bien mélangés, le réactif doit être mis en léger excès. Une des difficultés de cette méthode est de doser correctement la quantité de réactif à utiliser : s il n y a pas assez, la dépollution est évidemment incomplète et s il y en a trop il reste un excès de réactifs dans le sol. En outre, il faut connaître parfaitement le terrain et le réactif employé car des réactions secondaires peuvent apparaître. Celles-ci sont susceptibles de conduire à la formation d autres polluants, ou du moins à une dégradation des qualités du sol [29]. Les procédés chimiques peuvent être in-situ ou hors-site. Généralement ces techniques sont opérantes uniquement dans les cas où le sol est sous forme de boue ou si les polluants sont piégés dans un milieu liquide qui permet d éliminer la majeure partie des polluants. Cependant les coûts et l efficacité sont très différents d un procédé à un autre [11]. Dans les paragraphes qui suivent nous allons tenter de présenter les principaux procédés chimiques utilisés dans le traitement des sols en particulier les procédés d oxydation avancés qui nous intéressent le plus dans ce travail. IV.2 Le traitement des sols par extraction avec des solvants organiques On utilise actuellement des solvants organiques comme des alcanes, des alcools (éthanol et butanol) ou des cétones qui permettent de dissoudre la plupart des contaminants organiques notamment les hydrocarbures. Contrairement, le solvant est introduit dans le sol, il dissout les polluants avant d être extrait et traité. 49

54 Il existe plusieurs méthodes d extraction : o Par séparation naturelle et tripping ; o Par volatilisation en diminuant la pression jusqu à la pression de vapeur saturante du solvant ; o Par modification de la température afin de rendre le solvant non miscible à l eau. La toxicité des solvants organiques envers la population microbienne du sol et leur interaction avec les constituants du sol représentent les principaux désavantages de cette technique. IV.3 Extraction par des fluides critiques On utilise généralement le gaz carbonique, le propane ou le butane liquéfié à température et pression critiques. Dans ces conditions thermodynamiques, les caractéristiques de transfert de masse sont excellents : le fluide va occuper toutes les espaces interstitielles du sol. Lorsque la température et la pression remontent, la volatilisation du gaz entraîne les polluants organiques. Il s agit d une technique intéressante mais très difficile à mettre en œuvre et très coûteuse [29]. IV.4 Immobilisation chimique L immobilisation in-situ des polluants peut être effectuée en introduisant dans le sol des produits chimiques qui vont transformer les polluants en produits moins nocifs par stabilisation [43]. Les réactifs en solution sont appliqués pour saturer le sol soit par inondation de la surface, soit plus graduellement par nébulisation. Un traitement complémentaire sera nécessaire si le réactif chimique utilisé est lui-même indésirable. On utilisera alors les techniques physiques de lavage, pompage, ou confinement. Des réactifs insolubles peuvent être également utilisés par épandage et labourage du sol afin de favoriser leur contact avec les polluants [29]. IV.5 Procédés d oxydation avancée IV.5.1 Généralités C'est dans l'intention de développer des techniques de traitement rapides, moins onéreuses et plus adaptées aux composés organiques réfractaires ou toxiques que les procédés d oxydation avancée (POA) ont vu le jour. Ces procédés sont de nouvelles techniques de traitement en cours de développement. Ces techniques sont des alternatives très intéressantes pour la dégradation de polluants organiques difficilement biodégradables (hydrocarbures lourds, HAPs). Elles sont beaucoup plus efficaces que les techniques habituelles [44]. 50

55 Les POA sont basés sur les propriétés et la génération d intermédiaires radicalaires très réactifs, particulièrement les radicaux hydroxyles (HO ) à température ambiante. Les POA peuvent être regroupés en cinq catégories : 1. Les procédés d oxydation homogène : Les radicaux sont générés par la réaction de Fenton, ozone à ph élevé ou O 3 /H 2 O La photolyse homogène UV : ces procédés emploient la photolyse UV de H 2 O 2 et/ou O 3 en solution homogène pour générer les radicaux HO. 3. La photocatalyse hétérogène : Une source lumineuse induit des réactions photoélectrochimiques à la surface du photocatalyseur semi-conducteur tel que TiO La radiolyse : Des espèces HO, H, sont produites par irradiation de forte énergie (rayon ) des solutions à traiter. 5. Les procédés électrochimiques d'oxydation : les radicaux sont générés dans le milieu à partir de réactifs formés par électrochimie (Electro-Fenton) ou à partir du solvant aqueux (oxydation anodique de l'eau) [45]. IV.5.2 Radicaux hydroxyles Un radical est un fragment de molécule qui possède un électron non apparié ; cette propriété lui permet d'être très réactif mais d'avoir un temps de vie court. Le radical OH est l un des oxydants les plus puissants utilisés dans les procédé de dépollution parce qu il répond à un ensemble de critères d'exigence : o ne pas induire de pollution secondaire, o ne pas être toxique, o ne pas être corrosif pour les équipements, o être le plus rentable possible, o être relativement simple à manipuler [46]. On comprend aisément pourquoi des oxydants puissants comme XeF, OF 2 et H 4 RnO 6, ne sont pas exploitables pour la dépollution à cause de leur extrême réactivité, leurs nocivités sous formes réduites et leur capacité à former des trihalométhanes cancérigènes avec les matériaux organiques. Ainsi seuls les oxydants sans halogène ni métal et basés sur l'oxygène : (OH, O 3 et H 2 O 2 ), sont attractifs pour être utilisés dans la décontamination. Le tableau-16, présente le potentiel redox des différents agents oxydants, on remarque d après ce tableau que le radical OH est l oxydant non oxygéné le plus puissant [44]. Tableau IV. IV.1: Potentiel d'oxydo-réduction (E ) d'agents oxydants en milieu acide (T=25 C) Réaction redox E 51

56 XeF + e - Xe + F - 2OF 2(g) + 4H + + 4e - O 2(g) + 4HF HO + H + + e- H 2 O HO + e - HO - O 3 + 2H + + 2e - O 2 + H 2 O H 2 O 2 + 2H + + 2e - + H 3 O 2 HClO 2 + 3H + + 4e - Cl - +H 2 O MnO H + + 5e - Mn +2 +4H 2 O HO 2 + H + + 2e - H 2 O 2 Cl 2 + 2e - Cl - O 2 + 4H + + 4e - 2H 2 O (V/ENH) 3,4 3,29 2,7 2,33 2,07 1,76 1,57 1,51 1,44 1,36 1,23 IV Production des radicaux OH : procédé Fenton (Fe 2+ /H 2 O 2 ) IV Historique Fenton décrivit à la fin du 19 ème siècle que le fer ferreux favorisait fortement l oxydation de l acide maléique par le peroxyde d hydrogène en milieu acide. Des travaux ultérieurs ont montré que la combinaison de H 2 O 2 et de Fe 2+ nommé "réactif de Fenton", était un oxydant efficace pour une grande variété de substrat organique notamment des alcools, éthers, colorants, phénols, pesticides, les hydrocarbures et les aromatiques polycycliques. Quarante ans plus tard, Haber et Weiss (1934) identifiaient le radical hydroxyle comme étant l espèce oxydante de la réaction [44]. Depuis cette date, les scientifiques (wailling 1975, Prousek 1995, Sychev et Isak 1995) ont essayé de détailler le mécanisme de cette réaction. C est ainsi que la réaction de Fenton était modélisée comme suit : M n+ + H 2 O 2 M (n+1) + + OH. Où M est un métal de transition comme ((Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Ag, Pt ) Toutefois, le couple H 2 O 2 /Fe 2+ reste le plus utilisé et porte le nom de réactif de Fenton. Cette préférence pour le fer comme catalyseur est due à son activité comparable à l activité des autres métaux et à sa toxicité beaucoup plus faible [46]. Dans les paragraphes suivants nous allons détailler les mécanismes de décomposition du peroxyde d hydrogène par les sels de fer pour mieux comprendre leurs effets sur la production des radicaux hydroxyles et comment ils affectent le rendement de la réaction. IV Mécanisme de décomposition de H 2 O 2 par Fe 2+ ou Fe 3+ en solution aqueuse 52

57 La décomposition radicalaire de H 2 O 2 peut être initiée par un sel de fer (Fe 2+ ) ou par un sel ferrique (Fe 3+ ). Selon les réactions suivantes : Fe Ou 2 H O 2 2 Fe 3 OH 3 2 Fe H 2O2 Fe HO2 OH H (A1) (A2) Ces réactions (A1 et A2) conduisent à la production des radicaux hydroxyles, mais le système de Fenton est beaucoup plus complexe que ça, car il y a d autres réactions qui entrent en compétition et conduisent à la production des radicaux hydroperoxyles (2 et 5), le recyclage du Fe 3+ en Fe +2 (2 et 3) et le piégeage des radicaux hydroxyles par le Fe +2 et H 2 O 2 (4 et 5) [47]. Le phénomène de piégeage des radicaux hydroxyles affecte l efficacité de la réaction de Fenton car, il limite la quantité des radicaux hydroxyles destinés à la minéralisation des polluants. Ce phénomène et beaucoup plus accentué dans le cas où il y a un large excès soit du catalyseur, soit du peroxyde d hydrogène c est pour cela qu il faut optimiser la dose des réactifs qu il faut ajouté lors du traitement fait par des essais au laboratoire car, chaque site pollué a ces propriétés. Fe 3+ + HO. 2 Fe 2+ + O 2 + H + (3) HO. + Fe 2+ Fe 3+ +OH - (4) H 2O2 OH HO2 H 2O (5) HO. 2 + Fe 2+ + H + Fe 3+ + H 2 O 2 (6) 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 (7) IV Le mécanisme de réaction des radicaux hydroxyles avec la matière organique IV Formation des radicaux organiques ROH et R Les radicaux hydroxyles générés en solution par la réaction de Fenton (réaction A1) sont extrêmement réactifs. Ils réagissent «non sélectivement» avec les composés organiques, soit : o Par un mécanisme d abstraction d un atome d hydrogène s il y a présence d un hydrogène labile dans le substrat initial (réaction B2), pour former les intermédiaires réactionnels radicalaires et R. 53

58 o Par addition sur une double liaison éthylénique ou aromatique (B1) pour former l intermédiaire radicalaire ROH, comme s est indiqué sur le schéma IV.1 [48]: R OH ROH (B1) RH OH R H 2O (B2) Figure IV.14 Addition du radical OH sur une double liaison Ces réactions sont cinétiquement équivalentes. Une réaction d addition est préférentiellement observée sur les molécules insaturées. Les radicaux organiques intermédiaires ROH et R peuvent ensuite être oxydés par Fe 3+ (réactions B3 et B5), O 2 (réactions B4, B10 et B11), H 2 O 2 (réaction B7), OH (réaction B8) ou par d autres intermédiaires [48]. En réalité, le caractère dit précaution. En effet, OH «non sélectif» des radicaux hydroxyles doit être pris avec est électrophile. Par conséquent, il est plus réactif envers les composés aromatiques et aliphatiques insaturés qu envers les composés aliphatiques saturés [45]. Pour la même raison, la réactivité augmente en présence de groupements donneurs d électrons sur le substrat organique (par exemple, OH, OR, et amide) et diminue en présence de groupements accepteurs d électrons (par exemple, C=O et COOH). Les radicaux HO 2 et O 2 peuvent aussi réagir avec les composés organiques mais, à l inverse du radical hydroxyle, ils présentent une moindre réactivité et une grande sélectivité vis-à-vis de leur oxydation [44]. IV Réactivité du radical ROH L intermédiaire radicalaire ROH, formé après réaction du OH avec le composé organique, peut être oxydé, soit par l ion ferrique, régénérant ainsi l ion ferreux (réaction B3) qui peut réinitier une nouvelle séquence de la réaction A1, soit par l oxygène moléculaire (réaction B4). Ces deux réactions conduisent à l alcool correspondant comme produit d oxydation. 3 2 ROH Fe ROH Fe (B3) ROH (B4) O2 ROH O2 Si l oxygène est l agent oxydant, alors l anion superoxyde (O 2 ) ou son acide correspondant le radical hydroperoxyle (HO 2 ) seront générés selon le ph. En présence d un excès de peroxyde d hydrogène initial par rapport au fer(ii), le fer étant très rapidement oxydé en 54

59 fer(iii), O 2 peut agir comme un réducteur pour régénérer Fe 2+ (réaction A12) et ainsi initier une nouvelle séquence de la réaction A1. IV Réactivité du radical R Le radical R peut subir une oxydation par le fer ferrique (réaction B5) et ainsi régénérer Fe 2+, ou une réduction par le fer ferreux (réaction B6) qui régénère le substrat organique parent RH). R R Fe OH Fe 3 2 Fe H Fe 2 3 ROH RH (B5) (B6) Dans certains cas, le radical R peut réagir avec le peroxyde d hydrogène et ainsi régénérer le radical hydroxyle (réaction B7) : R H 2 O2 ROH OH (B7) Théoriquement, il peut également se produire une réaction d addition (réaction B8) ou de dimérisation (réaction B9), toutes deux étant des réactions de terminaison [45,50]. R OH 2R R 2 ROH (B8) (B9) Toutefois, des études sur les produits d oxydation excluent la dimérisation des radicaux comme réaction de terminaison prédominante, notamment lorsque les substrats organiques sont relativement volumineux, comme par exemple les HAP. L intermédiaire réactionnel R, s il possède un deuxième atome d hydrogène labile (on le notera alors R H), peut également réagir avec O 2 (transfert d un atome d hydrogène) pour produire le radical HO 2 (réaction B10) et générer un composé organique stable R (qui contient une double liaison). L oxygène moléculaire peut aussi s additionner à l intermédiaire R (réaction B11) pour donner un nouvel intermédiaire radicalaire, le radical libre peroxyle ROO : R ' H (B10) O2 R' HO2 R O2 ROO (B11) Puis, le radical peroxyle ainsi formé peut donner lieu aux réactions suivantes : 55

60 2 3 ROO Fe H ROOH Fe (B12) ROOH Fe 2 RO Fe 3 OH (B13) RO RH ROH R (B14) 2 3 RO Fe H ROH Fe (B15) ROO RH ROOH R (B16) ROO (B17) H 2O ROH HO2 Par conséquent, en présence d oxygène dissout, la formation du radical peroxyle a un effet inhibiteur sur l oxydation de substrats organiques car elle conduit à des réactions qui consomment le fer(ii), conduisant ainsi à une efficacité moins bonne que celle du système Fenton. Toutefois, la présence d oxygène améliore la minéralisation et empêche la réaction de dimérisation B9 de se produire. De plus, pour des concentrations élevées en réactifs [fer(ii) et H 2 O 2 ] et de faibles concentrations initiales en composés organiques (1 µmol.l -1 ), la concentration en oxygène n avait pas d influence sur leur cinétique d oxydation car les concentrations en radicaux peroxyles ROO (qui sont fonctions de la concentration initiale en composé organique) restent faibles et leur impact sur la vitesse d oxydation du fer(ii) était peu important [48]. IV Influence de quelques paramètres opératoires sur le réactif de fenton IV Influence du ph Si à ph acide le fer ferreux est essentiellement présent sous la forme de l ion Fe 2+ libre (i.e. uniquement hydraté par six molécules d eau [Fe II (H 2 O) 6 ] 2+ ), vers ph 7, les formes Fe(OH) + et Fe(OH) 2 deviennent non négligeables, et à ph supérieur à 8, le fer ferreux précipite sous forme de [Fe(OH) 2 ] (s) [44]. Ainsi, en milieu neutre, le fer(ii) réagit principalement sous la forme de Fe(OH) + dans la réaction A1 : 3 Fe( OH ) H 2 O2 Fe OH 2 Cette réaction, qui est favorisée à ph neutre, a une constante cinétique beaucoup plus élevée (5,9 x 10 6 mol -1.L.s -1 ) que celle de la réaction A1 (55-76 mol -1.L.s -1 ), qui est l étape principale d initiation en milieu acide. Il s ensuit une décomposition du peroxyde d hydrogène plus rapide en milieu neutre qu en milieu acide. Le fer(iii), généré dans les systèmes Fenton, est lui aussi fortement susceptible d être hydrolysé en solutions aqueuses neutres et faiblement acides pour former des complexes ferriques hydroxylés OH 56

61 L hydrolyse du fer ferrique débute vers ph 1-2, avec la formation des formes solubles (écrites en s affranchissant des molécules d eau) Fe(OH) 2+ et Fe(OH) + 2. Entre ph 3,5 et 7, ces complexes hydroxo ferriques donnent lieu aux réactions de polymérisation suivantes : 2 4 H O OH Fe H O OH H O 2 Fe H O OH H O Fe H O OH H O Fe H O OH FeH O OH Fe H O OH H O Fe Les complexes ainsi produits, dont la réactivité avec le peroxyde d'hydrogène est très faible, contribuent à rendre plus lente la décomposition du peroxyde d hydrogène dans la solution et diminue la concentration des espèces libres de Fe 3+ inhibant ainsi la régénération de Fe 2+ et par conséquent la production des radicaux OH. Ainsi, la réaction de Fenton a généralement lieu en milieu très acide (ph=3) pour prévenir la précipitation des sels de fer (particulièrement les sels ferriques à ph 7) en hydroxydes correspondants. Cependant, si la concentration en protons est trop élevée, il peut y avoir consommation des radicaux hydroxyles par la demi-réaction rédox ci-dessous dont la constante de vitesse est relativement élevée (k OH,H+ = 7x10 9 mol -1.L.s -1 ) [44,48]. OH H e H 2O Les électrons peuvent provenir de la demi-réaction d oxydation du fer ferreux en fer ferrique : Fe 2 Fe Il s ensuit la réaction globale suivante : 2 3 Fe OH H Fe H 2O Sachant que la constante de vitesse d oxydation de la plupart des substrats organiques par le radical hydroxyle est de l ordre de mol -1.L.s -1, à des ph inférieurs à 2, les protons pourraient inhiber la dégradation de ces substrats de par la consommation en radicaux par la réaction précédente. En outre, les milieux très acides inhibent la complexation du fer ferrique, en déplaçant l équilibre vers le fer ferrique libre dans la solution : Fe 3 H O e Fe( OOH) Par conséquent, en milieu très acide, la régénération du fer ferreux devient problématique. Aussi il est généralement établi que le ph optimum de la réaction de Fenton se situe aux alentours de 2,5-3,5 [48]. 2 7 H 10 57

62 IV Influence des composés organiques et inorganiques La présence dans la solution aqueuse de composés inorganiques (en particulier le contre-ion associé au fer ferreux initial) ou organiques (notamment la matière organique naturelle dissoute) peut modifier la quantité de radicaux hydroxyles générés dans le milieu, et par la suite avoir un effet direct sur l oxydation d un substrat organique lors de l ajout de celui-ci au milieu réactionnel. IV Influence des chlorures et sulfates Des études ont montré que les anions inorganiques tels que Cl et SO 4 2 influençaient significativement les vitesses de réaction des systèmes Fenton. Or ces anions sont susceptibles d être présents en solution, d une part parce qu ils sont utilisés comme contre-ions lors de l ajout des sels de fer, et d autre part parce que les solutions aqueuses sont couramment acidifiées avec HCl ou H 2 SO 4. Il est donc important de tenir compte de leur présence. Le tableau IV.2, présente les principales réactions de ces anions inorganiques en présence du réactif de Fenton. Tableau IV.2 : Principales réactions des ions Cl et SO 2 4 en présence du réactif de Fenton. N Réactions k Références 1a Fe 2 Cl FeCl 2,88 mol -1.L.s -1 De Laat et al., a 3 2 Fe Cl FeCl 6,61 mol -1.L.s -1 De Laat et al., a 3 2 Fe 2Cl FeCl 10,47 mol -1.L.s -1 De Laat et al., a Cl OH HOCl 4,3x10 9 mol -1.L.s -1 Liao et al., a HOCl Cl OH 6,1x10 9 s -1 Liao et al., a HOCl H Cl H 2O 2,1x10 10 mol -1.L.s -1 Liao et al., a Cl H 2O HOCl H 1,3x10 3 s -1 Liao et al., a Cl Cl Cl 2 8,5x10 9 mol -1.L.s -1 De Laat et al., a Cl 2 Cl Cl 6,0x10 4 s -1 De Laat et al., a Cl H 2O2 HO2 Cl H 1,0x10 9 mol -1.L.s -1 De Laat et al., a Cl 2 H 2O2 HO2 2Cl H 4,1x10 4 mol -1.L.s -1 De Laat et al., a 2 3 Cl Fe Cl Fe 5,9x10 9 mol -1.L.s -1 De Laat et al., a 2 2 Cl 2 Fe Cl FeCl 1,4x10 7 mol -1.L.s -1 De Laat et al., b 2 2 Fe SO4 FeSO4 2,29x10 1 mol -1.L.s -1 De Laat et al., b 3 2 Fe SO4 FeSO4 3,89x10 2 mol -1.L.s -1 De Laat et al., b 3 2 Fe 2SO4 Fe( SO4 ) 2 4,47x10 3 mol -1.L.s -1 De Laat et al., b H 2SO4 OH SO4 H H 2O 1,4x10 7 mol -1.L.s -1 De Laat et al., b HSO4 OH SO4 H 2O 3,5x10 5 mol -1.L.s -1 De Laat et al., b 2 SO4 H 2O2 SO4 H HO2 1,2x10 7 mol -1.L.s -1 De Laat et al., b SO 4 Fe Fe SO4 3,0x10 8 mol -1.L.s -1 De Laat et al., 2004 Ces anions inorganiques peuvent complexer le fer(ii) et le fer(iii) (réactions 1a, 2a, 3a et 1b, 2b, 3b) et ainsi modifier la distribution et la réactivité du fer. De plus, les ions chlorures et sulfates peuvent consommer les radicaux hydroxyles (réactions 4a, 4b et 5b) et générer des espèces radicalaires (Cl, Cl 2 et SO 4 ) à ph acide. Ces espèces radicalaires formées sont 58

63 moins réactives que les radicaux hydroxyles. De plus, en présence de chlorures, la formation de sous-produits d oxydation chlorés potentiellement toxiques a été reportée. D autre part, Cl, Cl 2 et SO 4 peuvent consommer le fer(ii) et le peroxyde d hydrogène (réactions 10a, 11a, 12a, 13a et 6b, 7b) [48]. IV Influence de complexants organiques La décomposition du peroxyde d hydrogène par le fer(ii) étant plus rapide en milieu neutre qu en milieu acide (du fait d une plus grande réactivité de Fe(OH) + par comparaison avec Fe 2+ comme indiqué précédemment), il peut être intéressant d opérer en milieu neutre. Toutefois, la faible solubilité du fer, tout particulièrement celle du fer(iii), impose de rajouter des ligands en milieu neutre, afin de le complexer, et ainsi empêcher la précipitation des sels de fer en leurs hydroxydes correspondants [51]. Par exemple, les complexes du fer(ii) avec l EDTA ou le DTPA réagissaient avec le peroxyde d hydrogène pour former le radical hydroxyle en milieu neutre [48]. IV Choix des concentrations en réactifs Une oxydation du substrat optimale peut être obtenue si la consommation des radicaux hydroxyles par les réactifs eux-mêmes est limitée. Ceci implique que, ni le peroxyde d hydrogène, ni l ion ferreux ne doivent être surdosés afin que la quantité maximale de radicaux hydroxyles soit disponible pour, par la suite, oxyder les polluants organiques. En effet, en présence d un excès d ions Fe 2+ par rapport au peroxyde d hydrogène, il peut y avoir un arrêt rapide des réactions et de plus, le fer(iii) généré en excès peut s hydrolyser et former des précipités [52]. Un excès en peroxyde d hydrogène par rapport à l ion ferreux semble donc nécessaire pour mener à bien l oxydation de substrats organiques. Toutefois, si l excès de peroxyde d hydrogène devient trop important, celui-ci peut alors devenir un consommateur important de radicaux hydroxyles, selon les réactions A5 et A13 ci-dessous : H 2O2 OH HO2 H 2O (A5) OH OH H O 2 2 (A13) D après plusieurs études réalisées sur ce sujet, un rapport [H 2 O 2 ] 0 / [Fe 2+ ] 0 de l ordre de dix semble le plus judicieux en théorie [45]. IV Mode d ajout des réactifs 59

64 En pratique, il est souvent préférable d ajouter la solution d ions ferreux au milieu réactionnel avant celle de peroxyde d hydrogène. Toutefois, l ajout de H 2 O 2 doit se faire assez rapidement, sinon on peut observer une autooxydation partielle du fer(ii) en présence d oxygène dissout (réaction A21),: Fe (A21) Fe 2 3 O2 Fe O2 2 O 2 3 2H Fe H 2O2 (A11) L ajout de H 2 O 2 se fait le plus souvent en une seule fois, au tout début de réaction. Mais il peut être avantageux dans certains cas de faire plusieurs ajouts à des temps différents, ceci afin de limiter l excès de peroxyde d hydrogène dans la solution, et donc la consommation en radicaux hydroxyles qui pourrait en découler. Il est aussi possible de faire un ajout continu dans le temps, en ajoutant lentement et progressivement une petite quantité connue de peroxyde d hydrogène à une solution contenant un excès d ions ferreux Fe 2+ et de substrat [48]. IV La température La température agissant de manière positive sur la cinétique des réactions, une température suffisante est nécessaire pour que les réactions d oxydation aient lieu. Mais, étant donné les réactions de minéralisation sont exothermiques donc une température proche de l ambiante semble-t-elle la plus appropriée, ce qui pourrait d ailleurs justifier le fait que la plupart des études sur le système Fenton sont menées à température ambiante. IV.5.3 Le réactif de fenton dans le traitement des sols pollués par des hydrocarbures De nos jours, le réactif de Fenton est souvent utilisé pour traiter des matrices contaminées provenant d industries diverses (colorants, pesticides, additifs du plastique, préservation du bois et du caoutchouc, hydrocarbures, etc.). En effet, ce réactif a montré des résultats prometteurs pour la dégradation d une grande variété de contaminants en solutions aqueuses (tableau VI.2) [55]. Il permet en règle générale de dégrader les polluants organiques en composés moins toxiques (et dans certains cas de les minéraliser), et d augmenter la biodégradabilité. Par conséquent, il peut être considéré, soit comme un traitement unique, soit comme un prétraitement avant une étape de biodégradation. En outre, il peut être appliqué non seulement au traitement des eaux usées, mais aussi à la réhabilitation de matrices solides contaminées, telles que des boues ou des sols [45,54]. Tableau VI. IV.3 : les familles de polluants qui peuvent être dégradés par réactif de Fenton Famille Polluants 60

65 Hydrocarbures aromatiques monocycliques Composés hydrocarbures oxygénés Organochlorés Composés hydrocarbures polyaromatiques Hydrocarbures aromatiques polycycliques halogénés Hydrocarbures aromatiques monocycliques halogénés Alcools aromatiques Pesticides organiques Benzène, toluène, ethylbenzène et xylène. Oxyde de tert-butyle et de méthyle (methyl tertbutyl ether = MBTE) Solvant chlorés (TCE, PCE, ) Hydrocarbures aromatiques polycyliques (HAP) Polychlorobiphényles (PCB) Chlorobenzène (CB) Phénol, naphtol Insecticides, herbicides Concernant la réhabilitation de sols contaminés, l application du réactif de Fenton a été avant tout étudiée à l échelle du laboratoire et son utilisation sur le terrain est relativement limitée et il peut être appliquée à la matrice contaminée soit sur site ou in situ. IV Oxydation sur site Le réactif de Fenton a été fréquemment utilisé pour dégrader les contaminants présents dans des sols excavés, soit comme seul traitement, soit associé à une biodégradation comme pré- ou post-traitement. En tant que procédé de prétraitement, le réactif de Fenton minéralise les polluants ou les oxydes en produits plus polaires qui sont plus biodégradables. Comme procédé de post-traitement, il permet d éliminer un certain nombre de contaminants résistants à la biodégradation. Le traitement sur site est le traitement le plus conseillé à être utilisé parce qu il a plusieurs avantages : Permet d éviter le risque de mobilité des polluants dans le sol ; N exige pas que le sol soit perméable au contraire du traitement in situ ; Permet la dégradation même des polluants peu solubles comme les hydrocarbures, car l agitation vigoureuse du sol pollué permet de le fragmenter et de mettre les polluants en direct avec les réactifs oxydants. Le traitement sur site est réalisé, généralement, dans des réacteurs ou dans des unités spéciales de traitement. Dans un tel cas, une étude a montré que le coût du peroxyde d hydrogène représentait seulement 5% environ du coût total, qui inclut les coûts d excavation, de main d œuvre, d ajustement du ph, d échantillonnage et d analyse. Le traitement sur site peut, également, être appliqué après un prétraitement du sol par une solution (le plus souvent organique) afin d extraire les contaminants présents, puis de l application de réactif de Fenton à la solution ainsi obtenue. 61

66 IV Oxydation in situ Le traitement in situ est réalisé, sans excavation du sol contaminé, par injection directe des réactifs dans le milieu pollué à travers des puits d injections. Ce procédé est commercialisé depuis une dizaine d années aux États-Unis et depuis un peu moins longtemps en Europe. C est une technologie en forte évolution qui connaît à l heure actuelle un certain succès [46]. Figure VI.15 : Répartition des oxydants et des polluants pour des sites américains IV Difficultés de mise en œuvre de l oxydation in situ La technologie d oxydation in situ comporte de nombreux avantages potentiels. Elle peut être mise en place, là, où des technologies plus classiques ne sont pas opérationnelles et cela à un coût raisonnable. Malgré ces nombreux avantages, le taux de réussite de la technologie d'oxydation in situ est très variable, et le traitement sur site dans les réacteurs reste toujours avantageux par rapport à l oxydation in situ Les critères clefs à prendre en compte pour la mise en oeuvre d une oxydation in situ sont les suivants : o Contact oxydant-polluant Un des principaux paramètres critiques de la technologie d'oxydation in situ est l'efficacité du contact entre l'oxydant et le polluant. Ce paramètre est difficile à maîtriser car il dépend de nombreux facteurs : nature du polluant, nature de l oxydant et géologie, hydrologie et géochimie du site. Concernant les hydrocarbures ceux sont des polluants, de type NAPL, qui sont dispersés dans la matrice et ne se présentent pas sous la forme d une poche bien délimitée. De plus, dans le cas de traitement de NAPL, les réactions ont lieu entre l oxydant et la phase dissoute du produit. La réaction est donc limitée par la cinétique de dissolution du NAPL dans la solution du sol. La surface de contact entre les poches de polluant et l eau conditionne en partie ce paramètre. C est pour cela qu il est important de déterminer la présence et la taille des poches de NAPL résiduelles [46,55]. 62

67 Enfin, le facteur déterminant de l efficacité du contact polluant/oxydant est la géologie et l hydrogéologie du site. En fonction du type de sol, l injection va être plus ou moins facilitée et efficace. En ce qui concerne la géologie, il est plus facile d injecter des produits quelqu ils soient dans des sols sableux pauvres en argile que dans des sols argileux. La perméabilité des sols sableux étant grande, la dispersion des produits est beaucoup plus efficace. À propos de l hydrogéologie, plus le système sera simple, moins il existera de risque d écoulements préférentiels et de by-pass de la zone. o Demande naturelle en oxydant Les oxydants sont aussi consommés par d'autres substrats que le polluant. Ce paramètre est appelé «demande naturelle en oxydant». Les substrats consommateurs d oxydant les plus courants sont la matière organique (M.O.) et les espèces minérales réduites (manganèse, fer, sulfure ). Plus le sol est riche en M.O. (sol riche en tourbe, par exemple), plus la consommation d oxydant va être importante. C est pour cette raison que la majorité des traitements réalisés in situ a lieu sur des sols sableux (sols pauvres en matières organiques). o Maintien du ph La réaction de fenton est favorisée par des ph acide. Cependant, il n est pas toujours possible de modifier le ph de la matrice car celle-ci peut avoir un pouvoir tampon trop important, c est le cas des sols calcaires. Ce type de sol n est pas toujours un handicap pour l utilisation du fenton. En fonction du milieu et des cinétiques des différentes réactions, les conditions du sol peuvent favoriser la régénération du fer [45]. IV Effets induits de l oxydation in situ o Migration de la pollution Lors d une injection, l apport d une quantité importante de liquide dans le sol peut entraîner, par effet piston, un déplacement d'une masse d'eau équivalente à la quantité injectée, et donc décaler la pollution vers des zones non polluées. o Modification de la mobilité d autres polluants Lors de la première phase du traitement, il existe une dégradation de la matière organique, qui va libérer les polluants adsorbés à la surface de la matière organique, ce qui risque d augmenter fortement et rapidement les quantités de polluants dissous. Aussi, Les modifications du milieu (ph, Eh) peuvent entraîner le changement de valence de certains métaux, comme le chrome, l arsenic, le zinc et le cadmium, ce qui entraîne une augmentation de leur mobilité [43,43]. 63

68 o Génération de produits toxiques Si la réaction de dégradation des polluants n est pas complète, les éventuelles réactions secondaires peuvent conduire à la formation d autres polluants. Ces polluants peuvent être classés en deux catégories : les sous-produits du polluant et les sous-produits de l oxydant [49]. En plus l utilisation de H 2 O 2 comme oxydant entraîne la production d oxygène. La présence de ce gaz modifie la conductivité de l aquifère. Par ailleurs, les réactions d oxydation sont exothermiques et dans certains cas la chaleur dégagée peut être très importante. Les deux facteurs réunis (présence de gaz plus chaleur) peuvent aboutir à des émissions fugitives en surface. Si le polluant est volatil, ces émissions vont favoriser sa volatilisation [50]. o Perturbation biologique du milieu naturel L oxydation in situ modifie les conditions géochimiques de la matrice, ce qui perturbe les populations microbiennes ambiantes, ce phénomène est accentué par l utilisation du réactif en grande quantité (en excès) [46]. 64

69 V Matériels et méthodes L objectif de ce chapitre est de présenter tout d abord les matériaux et les dispositifs expérimentaux utilisés dans ce travail. Par la suite, les différentes méthodes d analyses physico-chimiques employées pour suivre l évolution du traitement et quantifier les différentes classes d hydrocarbures avant et après traitement seront également développées. V.1 Présentation du site pollué Cette étude comparative a été réalisée sur un échantillon pris de la raffinerie de Skikda. Pour mieux localiser la zone d étude nous avons préféré commencer par une présentation générale de la raffinerie de Skikda avant de localiser la zone d échantillonnage. V.1.1 Présentation da la raffinerie de Skikda La raffinerie de Skikda est située dans la zone industrielle à 7Km à l est de Skikda et à 2Km de la mer.elle couvre une superficie de 190 ha avec un effectif à l heure actuelle de 1280 travailleurs. La raffinerie de Skikda a pour mission le traitement du pétrole brut provenant de Hassi- Messaoud et le brut réduit importé pour fabriquer une gamme de produits destinés à la satisfaction du marché national et à l exportation. Pour assurer ses demandes la raffinerie est équipée de : Deux unités de topping qui prennent en charge le pétrole brut et le transforment en : GPL : destiné aux unités de traitement gaz. NAPHTAS : dont la coupe intermédiaire alimente le reforming catalytique. JET FUEL. KEROSENE, GAZ OIL LEGER et GAZ OIL LOURD : destinés aux mélanges pour la production du GAZ OIL (produit fini). Une unité de reforming catalytique (magnaforming) : qui produit des essences semi- finies à haut indice d octane. Deux unités aromatiques : qui produisent de BTX à partir des essences de l unité de reforming catalytique et des bases pour la fabrication des essences super et normal. Une unité de production des bitumes routiers et oxydés. La raffinerie possède aussi une aire de stockage d une capacité (ancien design) est de M 3 [56]. 65

70 Matières Premières Brut de Hassi- Messaoud Brut réduit importé Produits Finis Propane Butane Essence normale Essence super Essence export Naphta pétrochimique Benzène Toluène Para xylène Mélange xylène Kérosène/jet A1 Gas-oil Fuel oil BTS Fuel oil HTS Bitume routier Bitume oxydé Transport des Produits Finis Par mer : *Caboteur pour marché national. *Tankers pour marché international. Par pipe : *marché national (GPL, carburants et bitumes routiers). Par camion s : *bitumes et aromatiques. Figure V.1: Capacité de production en tonne/an [57]. La raffinerie de Skikda est le plus grand complexe de Raffinage en Algérie, mais, en plus, de sa contribution au développement économique du pays, elle est aussi une source alarmante de pollution pour l environnement (voir figure-v.2). 66

71 CO 2 : Centrales thermiques, chaudières, chauffage, turbines à gaz, torchères. COV : Installations de séparation de gaz et de déshuilage des eaux SO 2 : Installations de combustion o o o Gaz à effet de serre Pluies acides Effets sur la santé Raffinage Stock Pétrole brut DANGER EXPLOSION INCENDIE Stock Produits SOLS Sols pollués par des hydrocarbures et des solvants résultants de fuites accidentelles EAUX USEES o Eau de process, vapeur, eau de lavage o Eau de refroidissement (en circulation ouverte) o Eau de pluie ruisselée des zones de process o Eau de pluie ruisselée des zones hors process DECHETS o Boues (dépôts de fonds des réservoirs, et boues des stations d épuration des eaux) o Déchets liés à la production : déchets huileux, catalyseurs caustic, produits chimiques usagés, goudrons acides o Déchets non liés à la production : o Déchets domestiques o Démolition/construction Destination L unité 1100 pour le traitement et leur rejet ensuite à la mer La zone de torche pour enfouissement ou épandage Si le traitement est inefficace o o pollution des sols et des nappes pollution rivière et mer Figure V.2 Les déchets produits par la raffinerie et leur destination[58] 67

72 V.1.2 Localisation de la zone d échantillonnage: Selon la figure 2 qui représente les déchets rejetés par la raffinerie. On remarque que l industrie pétrolière génère des rejets polluants d une extrême diversité. On a affaire à des mélanges de composition hétérogène, qui renferment des matières organiques et minérales à l état liquide ou solide en plus des rejets gazeux dont certains peuvent avoir éventuellement un caractère toxique plus ou moins marqué. La dépollution de ces rejets, compte tenu de leur hétérogénéité de composition, conduira toujours à la conception d une chaîne de traitements assurant par étapes successives, l élimination des différents polluants [59]. Pour cela la raffinerie de Skikda est équipée d une station d épuration des eaux usées avant leur rejet à la mer. Quant aux déchets solides, ils sont stockés, sans aucun traitement préalable, au niveau de la zone de torche d où l échantillon de la terre polluée d hydrocarbures choisi était pris pour la réalisation de ce travail. Description de la zone de torche : Cette zone est conçu pour le stockage des déchets solides de la raffinerie et elle est constituée de: 3 fosses bétonnées pour l enfouissement des déchets contenant des produits toxiques ; Une zone d épandage pour : Remarque : Les boues biologiques riches en matière organique venant de la station d épuration des eaux usées ; Les sols excavés lors de la subvention d un déversement accidentel ou d une fuite de produits pétroliers ; 3 bassins de décantation qui reçoivent les boues issues des réservoirs de stockage lors de leur nettoyage. Ces bassins sont reliés à la station d épuration des eaux usées par des drains qui servent à récupérer les eaux polluées après la décantation des boues au fond des bassins. Les boues décantées ainsi auront deux destinations différentes : l enfouissement si elles contiennent des produits toxiques, sinon elles seront dirigées vers la zone d épandage ; La zone de torches contient aussi deux torches pour évacuer les déchets gazeux. L échantillon utilisé dans ce travail était pris précisément de la zone d épandage. C est une terre excavée qui a était le résultat d une fuite accidentelle survenue en 2005 lors du chargement d un tanker avec du fioul lourd au niveau du port de Skikda. 68

73 Si elles sont toxiques Les boues décantées au fond des bassins Zone d épandage des boues «La zone d échantillonnage» Zone d enfouissement Zone de décantation Les eaux récupérées après décantation vont vers la station d épuration des eaux usées Description de la zone de torche La zone industrielle de Skikda Plan de masse de la Raffinerie de Skikda Figure V.3 : Localisation de la zone d échantillonnage 69

74 V.2 Caractérisation physico-chimique du sol Les échantillons à analyser ont été séchés à l air libre pendant 48 heures et tamisés (< 2 mm) puis homogénéisés et ont été conservés à l'abri de la lumière. Afin de mieux appréhender les divers phénomènes observés au cours des expériences, il est important et nécessaire de caractériser les sols. V.2.1 Analyse granulométrique L analyse granulométrique permet de déterminer l'importance pondérale des particules minérales en différenciant les argiles (< 2 µm), des limons (2<d<50µm) et des sables (50<d<2000µm). Les méthodes les plus fréquemment utilisées (car plus simples et plus fiables) reposent sur la loi de Stokes qui nous dit que la vitesse de chute d une particule sphérique, tombant librement dans un fluide, est proportionnelle au carré de son rayon et à sa densité. Dans notre travail on a choisi la méthode de sédimentation avec des prélèvements à la pipette de Robinson. L échantillon utilisé pour cette analyse doit être sec et traiter par le peroxyde d hydrogène à chaud pendant 24 heures pour éliminer la matière organique. La partie minérale restante est traitée par une solution défloculante d hexamétaphosphate de sodium pour assurer une bonne dispersion des particules, l échantillon est ensuite agité dans une allonge pleine d'eau (1 litre), la sédimentation s'effectue sous la seule action de la gravité. Ensuite trois prélèvements sont effectués, successivement, pour récupérer les argiles, le limon fin et grossier (voir tableauv.1). Et pour récupérer les deux catégories de sable fin et grossier, le contenu de l allonge d eau est versé dans les tamis de 50 et 200 microns successivement. Enfin, les différentes classes récupérées par prélèvement à la pipette ou par tamisage, sont séchées à 105 C pendant 24 heures, dans des creusets en porcelaine, qui seront ensuite pesés après refroidissement. Tableau V.1: Temps de prélèvement à la pipette Robinson d une profondeur de 10 cm à 20 C Diamètre des particules Temps de prélèvement 1 er prélèvement 2 ème prélèvement 3 ème prélèvement 50 µm Argile + Lim.fin + lim.gros 20 µm Argile + Lim.fin 2 µm Argile h 00 70

75 Une analyse granulométrique est considérée comme valable lorsque la somme des fractions constitutives de l échantillon est comprise entre 95 et 101 % (sable grossier (SG) + sable fin (SF) + limon grossier (LG) + limon fin (LF) + argile (A) + matière organique (MO)) [60]. Pour l échantillon étudié, le pourcentage obtenu est 106 %, il est légèrement supérieur à la norme cela est du à la quantité importante de la matière organique contenu dans l échantillon qui n était pas totalement éliminée par le peroxyde d hydrogène. V.2.2 Détermination du pheau et phkcl Les ph des solutions de sol ou des lixiviats sont mesurés par un ph-mètre. Mesure du ph en solution aqueuse Le pheau est déterminé selon la norme AFNOR X par la mesure du ph d'une suspension de sol dans l'eau (rapport masse/volume = 2/5) après 1 heure d'agitation puis décantation. Le pheau ne constitue cependant pas un paramètre décrivant le mieux les échanges d ions à l interface liquide-solide. En effet, l'équilibre dans l'eau (pheau) ne rend pas compte de la totalité des ions acides (protons et ions alumineux) fixés sur le complexe argilo-humique qui est notamment responsable de la capacité d échange du sol. Cependant, ces ions acides fixés constituant l'acidité potentielle effective, ou l'acidité d'échange au ph du sol, peuvent être déplacés avec un ion tel que K + d'une solution non tamponnée de KCl normal. C'est pourquoi le ph KCl est mesuré. Mesure du ph en solution de chlorure de potassium Le ph KCl est déterminé selon la norme AFNOR X par la mesure du ph d'une suspension de sol dans une solution de KCl à 1 mol/l (rapport masse/volume = 2/5) après 1 heure d'agitation puis décantation [11]. V.2.3 Dosage de l azote Kjeldhal La méthode de Kjeldhal est applicable pour le dosage de l azote de différents composés azotés tels que les amines et les sels d ammoniums [61]. Cette méthode est effectuée sur un échantillon finement broyé, ce dernier sera chauffé avec 20 ml d'acide sulfurique concentré, qui à l ébullition détruit par son action oxydante les matières organiques azotées. Ainsi, le carbone et l hydrogène se dégagent à l'état de CO 2 et H 2 O, et l'azote transformé en ammoniaque est fixé par l acide sulfurique à l état de sulfate d'ammoniaque SO 4 (NH 4 ) 2 71

76 Cette transformation nécessite l'emploi de catalyseurs. Les plus employés actuellement sont le sulfate de cuivre et le sélénium en poudre. De notre part, sur 5g d échantillon à analyser, on ajoute : 0,25g de sélénium et 5g de sulfate de cuivre anhydre. I1 est nécessaire également d élever la température d ébullition de l acide sulfurique en ajoutant 5 g de sulfate de potassium. Enfin, l ammoniaque formée est déplacée de ses combinaisons par l ajout de 20 ml de soude concentrée à 60%, distillée par entraînement de vapeur, recueillie dans une solution d acide borique, et dosée par l'acide sulfurique titré en présence de rouge de méthyle comme indicateur [62]. V.2.4 Dosage du phosphore total L analyse du phosphore total est faite en deux étapes 1. Minéralisation : Après destruction des matières organiques par l incinération de l échantillon dans un four à moufle à 450 C, le résidu obtenu est mis en solution d acide chlorhydrique concentré à 37% et porté à ébullition jusqu à l obtention d un résidu sec qui est repris dans 10 ml d acide nitrique et porté à ébullition à nouveau pour 2 à 3 minute. Après refroidissement du mélange, le liquide est filtré et transvasé dans une fiole de 250 ml où le volume est complété au trait de jauge avec de l eau distillée 2. Dosage spectrophotométrique: Dans une fiole de 100 ml on mélange: 10 ml du filtrat (éventuellement dilué) ; 10ml de réactif vanado-molybdate qui est composé de : molybdate d ammonium, monovanadate d ammonium et l acide nitrique ; Eau distillée jusqu au trait de jauge. L acide orthophosphorique donne en présence du vanadium (forme V) et du molybdate (forme VI) un complexe jaune, qui peut être mesuré par spectrophotométrie à 430 nm par comparaison à un blanc. La quantité de phosphore dans l échantillon est déterminée, par la suite, en se référant à la courbe d étalonnage effectuée pour des concentrations connues en phosphore [63]. V.2.5 Dosage du fer L analyse du fer est réalisée sur un échantillon exempt de matières organiques, pour cela l échantillon doit passer par l étape de l incinération au four à 450 C pendant 4 heures. 72

77 Les cendres ainsi obtenues sont mélangées avec de l eau distillée, 5 ml l acide chlorhydrique concentré et séchées à sec sur une plaque chauffante pour obtenir des cendres blanches. L analyse par spectroscopie d absorption atomique Les cendres séchées sont, à nouveau, mises en solution d acide chlorhydrique à 6N et 120 ml d eau distillée, filtrées dans une fiole de 250 ml et le volume est complété par l eau distillée jusqu au trait de jauge. La solution obtenue est analysée par un spectromètre d absorption atomique, après calibration de l appareil par les solutions étalons de fer [63]. V.2.6 Détermination de la teneur en carbone organique Le carbone organique est dosé suivant la méthode de Anne. Le principe du dosage repose sur l'oxydation du carbone de la matière organique par le bichromate de potassium en excès. Le mode opératoire de cette méthode ainsi que celui de l analyse gravimétrique des hydrocarbures seront détaillé en ce qui suit. V.2.7 Dénombrement des germes totaux : Le dénombrement des micro-organismes a pour but d'estimer quantitativement la composition microbienne d un échantillon donné. Il existe plusieurs méthodes utilisées actuellement pour le dénombrement, mais pour cette étude, la méthode de culture sur milieu solide après dilution de l échantillon, a été choisie vu sa simplicité et selon les moyens disponibles au laboratoire. Cette méthode est basée sur la présupposition qu'un micro-organisme viable, cultivé en ou sur milieu solide nutritif spécifique et en conditions convenables, se multiplie en donnant lieu à une colonie visible à l'œil nu. Cette colonie peut être bactérie, levure ou champignon selon les conditions et les milieux de culture utilisés. Mode opératoire Pour obtenir une unité d analyse vraiment représentative, les prélèvements de l échantillon de la terre polluée ont été réalisés à différents endroits du site étudié pour constituer l unité d analyse. L échantillon est ensuite transporté au laboratoire dans une bouteille stérile à une température inférieure à 4C, où l analyse est réalisée immédiatement. Préparation de la solution mère La population microbienne typique dans 1 g d échantillon peut être supérieure UFC. Par conséquent, si l échantillon est réparti directement sur le milieu de culture, il y aurait un si 73

78 grand nombre de microorganismes et le comptage des colonies développées serait impossible. Pour éviter ce problème, il a été préféré de diluer l échantillon avant l ensemencement [64]. La solution utilisée pour la réalisation de la solution mère et la série de dilution est : l eau physiologique préparé comme suit : 9 g de chlorure de sodium Le volume est complété à 1l avec l eau distillée qui doit être sans traces de métaux, d'inhibiteurs ou d'autres substances antimicrobiennes. La solution obtenue est homogénéisée, filtrée, distribuée dans des tubes à essai (9 ml/tube). Et en fin les tubes sont stérilisés dans l autoclave à 120 C pendant 20 minutes. La solution mère est préparée en mélongeant 1g de l échantillon avec 9ml d eau physiologique jusqu à obtention d une suspension homogène. Préparation des dilutions Puisque l'on ne connaît pas à l'avance la concentration microbienne de l échantillon. Il faut réaliser des dilutions successives, décimales et croissantes de telle façon qu'on puisse obtenir le nombre le plus favorable (entre 30 et 300 colonies/ boite pétri) pour faciliter le dénombrement et différencier les colonies. Ainsi, en partant de la solution mère une série de dilutions décimales (1:10) est préparée de la manière suivante : A l aide d une pipette stérile 1 ml de la solution mère est ajouté à 9 ml de diluant dans le premier tube. Après homogénéisation, 1 ml de cette dilution est prélevé pour être ajouté à 9 ml de diluant dans le deuxième tube. L opération continue jusqu'à la dernière dilution convenable, selon la population microbienne présumée, en utilisant des pipettes stériles pour chaque dilution Ensemencement du milieu solide Pour l ensemencement les milieux qui ont été utilisés sont : Le PCA pour les germes totaux Le milieu Sabouraud pour les champignons. Ces milieux sont liquéfiés dans un bain bouillon et versés, à 45 C, dans des boites de pétris (15ml/boite). Ensuite, à l aide d une pipette stérile et à partir de la dernière dilution, préparée précédemment, 1 ml est prélevé de chacune des dilutions, homogénéisé immédiatement et 74

79 doucement, dans une boîte de Pétri, en effectuant plusieurs mouvements circulaires dans les deux sens en évitant tout mouvement brusque qui risquerait de projeter le milieu ensemencé contre les paroi de la boite ou même à l extérieur. Après refroidissement des milieux sur une surface plate jusqu'à solidification, les boites de pétri sont retournées et incubées en position inversée : Les germes totaux à 37 C, pendant 2 à 3 jours, en aérobiose ; Les champignons à 37 C, pendant 7 à 10 jours. A la fin de la durée d incubation, les boites représentant entre 30 et 300 colonies sont sélectionnées et le comptage des colonies développées est réalisé à l aide d un compteur de. Figure V.4 : Ensemencement de l échantillon à partir des dilutions préparées [64] V.3 Analyse microbiologique de la terre polluée L analyse microbiologique de la terre était réalisée à partir des boites utilisées pour le dénombrement. La première étape de cette analyse est d observer les colonies développées sur les boites, ensuite procéder à leur isolement et en fin les identifier en utilisant des tests biochimiques. V.3.1 L observation des microorganismes développés sur les milieux gélosés Il est possible d'observer les microorganismes : soit lorsqu'ils sont regroupés en colonies sur boite visible a l oeil, il s'agit alors d'une observation macroscopique, soit à l'état de cellule, il s'agit alors d'une observation microscopique. V Observation macroscopique des colonies Une colonie est l'amas, visible à l oeil nu, constitue par des milliards de descendants d'une seule cellule bactérienne et dont la taille, la forme, la couleur, la consistance sont caractéristiques de chaque espèce. L'examen macroscopique des cultures est effectué après incubation. L'aspect des colonies dépend du milieu utilisé, de la durée et de la température de l incubation. Il ne pourra être écrit convenablement qu à partir de colonies bien isolées : 75

80 La description des colonies doit mentionner : La taille de la colonie La forme Allure des contours : lisses, dentelés, déchiquetés, réguliers ou irréguliers Relief : surface bombée, plate, centre parfois surélevé, parfois ombiliqué (en creux) L'aspect de la surface : Il peut être lisse ou rugueux, L'opacité : les colonies sont décrites comme : opaques, translucides ou transparentes La consistance : au moment du prélèvement il est possible d'apprécier si les colonies sont grasses, crémeuses, sèches ou encore muqueuses. La couleur (pigmentation) Odeur : une odeur caractéristique peut être présente [65]. V Observation microscopique L'observation microscopique est une technique basée sur le grossissement effectué par le microscope et qui permet de faire une étude morphologique des cellules d'une espèce microbienne. Elle comprend : L examen a l'état frais L examen après coloration. V Examen à l'état frais L état frais permet d observer des germes vivants et apporte des renseignements sur leur forme : cette étape est suffisante pour l identification des champignons, quand aux bactéries l état frais donne, en plus, de leur forme (voir figure-v.5) des renseignements sur : Leur mode de groupement (en amas, en paquet, ) La présence de capsules ou de spores Leur mobilité dans le cas des bactéries: ce caractère est le plus important mis en évidence a l'état frais. Une bactérie mobile doit se déplacer dans le champ microscopique avec un mouvement qui lui est propre, mais cette mobilité ne doit pas être confondue avec les mouvements browniens qui sont des mouvements désordonnés de particules (sans déplacement véritable) dus a l'agitation thermique des molécules de liquide ni avec les mouvements transmis par les courants (toutes les bactéries sont entraînées dans le même sens) [65]. Technique de préparation : 76

81 on dépose une goutte d eau physiologique sur la lame propre bien dégraissée, et à l aide de l anse de platine stérilisé on prélève une trace de culture ou une colonie que l on émulsionne à la goutte, puis on pose délicatement une lamelle sur la lame. Ensuite on examine la préparation au microscope. La mobilité est plus nette au bord de la lamelle elle se traduit par un va et vient et des mouvements importants [66]. Figure V.5: les différentes formes de bactéries rencontrées. V Examen après coloration Si la plupart des microbes peuvent être observés en suspension aqueuse, cette observation est grandement facilitée par l'application de colorants. Il y a plusieurs types de coloration utilisés en bactériologie, mais dans notre travail on a utilisé la coloration différentielle de type Gram. Elle permet non seulement d'observer la forme des cellules mais aussi de diviser les bactéries en deux grands groupes taxonomiquement différents: Bactéries Gram-positives: Gram + Bactéries Gram-negatives : Gram Principe : Cette coloration est basée sur la différence présentée par les bactéries Gram positives et Gram négatives due à la diversité de structure et de composition chimique de leurs parois cellulaires. Dans les bactéries Gram négatives, la paroi riche en lipides a une quantité très réduite de peptidoglucane, ce qui permet la pénétration de l'alcool qui dissout le complexe violet de gentiane-iode qui se forme en laissant la cellule incolore, laquelle sera ensuite recolorée en rouge par la fuschine. Au contraire, la paroi cellulaire des bactéries Gram 77

82 positives a une grande quantité de peptidoglucane et une faible concentration de lipides. Ainsi, l'épaisse paroi de peptidoglucane et la déshydratation produite par l'alcool ne permettent pas la pénétration de l'alcool dans la cellule qui conserve la coloration violette ou bleu foncée du complexe violet de gentiane-iode. La coloration de Gram perd sa signification si elle est réalisée sur une culture trop âgée. Ainsi, la souche doit être en phase de croissance exponentielle pendant 24 à48 heures [67]. Les colorants utilisés pour la réalisation de cette coloration sont : 1. Solution de violet de gentiane : Préparation : peser 2 g de violet de gentiane (ou cristal violet), introduire dans un Erlenmeyer de 100 ml et dissoudre dans 20 ml d'alcool à 95% vol. Dissoudre0,8 g d'oxalate d'ammonium dans 80 ml d'eau distillée. Mélanger les deux solutions et utiliser seulement après 24 heures. Filtrer sur papier au moment de l'emploi. Maintenir à l'abri de la lumière en flacon foncé. 2. Solution de lugol : Préparation : dissoudre 2 g d'iodure de potassium dans une quantité minime d'eau (4 à 5 ml) et, dans cette solution saturée, dissoudre 1 g d'iode. Compléter le volume de 300 ml avec de l'eau distillée. Maintenir à l'abri de la lumière en flacon foncé. 3. Solution de fuchsine : Préparation : peser 1 g de fuchsine basique 5 g d acide phéniqué dans un Erlenmeyer de 100 ml, dissoudre avec 10 ml d'alcool à 95% vol. et additionner 90 ml d'eau. Agiter. Maintenir à l'abri de la lumière en flacon foncé [69]. Mode opératoire : La coloration de Gram se déroule en plusieurs étapes. Recueillir à l aide d une anse de platine stérile une colonie. Réalisation du frottis sur lame en étalant les bactéries des cultures jeunes, recueilli directement du milieu solide, dans une goutte d eau physiologique Fixation à la chaleur en passant rapidement la lame 3 fois à l'intérieur de la flamme d'un bec Coloration par le violet de gentiane pendant 1 minute, après refroidissement de la lame Rinçage à l eau. Mordançage: la lame a été recouverte de Lugol pendant 1 minute. Décoloration par l'alcool à 95 degré pendant 1 minute Rinçage à l eau. Contre coloration par la fuschine pendant 20 secondes. 78

83 Rinçage à l'eau puis séchage [70] Observation des frottis au microscope, après l ajout d une goutte d huile de vaseline à la surface de la lame. Les bactéries à Gram-positif restent colorées de violet ou bleu foncé et les bactéries à Gram-négatif sont colorées en rose. Bactérie à gram + Bactérie à gram - Figure V.6: Bactéries colorées par la méthode de Gram V.3.2 Isolement des bactéries Cette opération a pour but d'isoler les bactéries en cause, en obtenant des colonies bien distinct. La gélose nutritive est un milieux non sélectif qui permet systématiquement la poussée de toutes les bactéries peu exigeantes à 37 C en aérobiose.elle a été utilisée pour l isolement des différentes colonies, définie lors du repérage ( à partir des boites utilisées pour le dénombrement) L isolement se fait par plusieurs méthodes dont la plus utilisée est celle de l'anse platine calibrée. Elle consiste à prendre une colonie bien isolée et la déposer à l'extrémité de la gélose. A partir de ce dépôt des stries serrées sur toute la gélose sont réalisées. Ensuite les boite sont incubées pendant 24 heures à 37 c Remarque Il ne fait pas de doute que la totalité des microorganismes présents dans l échantillon n a pas été isolée par cette technique de revitalisation. Il est connu que dans les sols, cette approche ne touche que quelques pourcents des cellules. Cependant, on a pensé que les microorganismes mis en évidence selon l isolement effectué ci-dessus représentent les espèces indigènes majoritaires dans la terre polluée étudiée [71]. V.3.3 Identification des bactéries : Après l examen au microscopique, coloration de Gram et l isolement des différentes souches repérées sur les boites du dénombrement la réalisation de tests biochimiques est nécessaire pour pousser l identification des bactéries. 79

84 Tests biochimiques On identifie une bactérie en observant si elle utilise tel ou tel substrat. On la met donc en contact dans un milieu de culture avec un glucide, ou un peptide, ou d autre substrat plus complexe. On peut révéler l utilisation de ce substrat par virage (changement de couleur) d un indicateur de ph (exemple : un glucide utilisé donne un produit acide, un peptide donne un produit basique). Chaque famille de bactéries a des caractères propres, on peut donc les rassembler facilement avec des caractéristiques de base comme l utilisation du glucose avec ou sans oxygène, la réduction des nitrates, ect Ces tests sont assez longs, le temps nécessaire pour leur réalisation est de un à deux jours [72]. En ce qui suit on va présenter les tests qu on a utilisés pour l identification de nos souches : V Test catalase La catalase est une enzyme contenant du fer qui catalyse la décomposition du peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2 ) en eau. Elle est synthétisée par la plupart des bactéries aérobies le test de la catalase sert à détecter la présence de cette enzyme dans une souche bactérienne donnée. 2H 2 O 2 + catalase 2 H 2 O 2 + O 2 (dégagement gazeux). La mise en évidence de la catalase est réalisée en présence d'eau oxygénée en contact de la souche à étudier. L obtention d'un dégagement important d'oxygène naissant confirme la présence de catalase. La recherche de cette enzyme permet de différencier les bactéries de forme Cocci à gram positif (c est-à-dire les streptocoques et les staphylocoques) [69]. V Test oxydase Une oxydase est une enzyme catalysant une réaction d oxydo-réduction impliquant une molécule de dioxygène comme accepteur d électron. Dans cette réaction, l oxygène est réduit en eau ou en peroxyde d hydrogène. On dit qu une bactérie est oxydase positive si un fragment de culture est capable d oxyder la forme réduite de dérivés N-méthylés du paraphénylènediamine (PDA) en semi quinone (rose violacé). La recherche d oxydase est un test fondamental pour l orienter l identification des bacilles Gram-. Pour la réalisation de ce test des disques imprégnés du réactif PDA sont mis en contact de la souche à étudier. S il y a apparition d une tache violette au bout de 30 secondes, cela veut dire que la bactérie est oxydase positif (exemple : pseudomonas) et s il n y a rien qui apparaît la bactérie est donc oxydase négatif (exemple : entérobactéries) 80

85 V La recherche de urée l indole et le tryptophane désaminase Pour ce test le milieu utilisé est l urée tryptophane qui a la composition suivante : KH 2 PO 4 NaCl Alcool à 95 0,1 g 0,5 g 1 ml Recherche de la tryptophanase et du tryptophane désaminase L-tryptophane Système de lecture de l uréase Urée CO(NH 2 ) 2 Rouge de phénol à 1% Recherche de l uréase : 0,3 g 2 g 0,25 ml Après 24 heures d incubation d un tube à essai contenant le milieu dans lequel une suspension de la bactérie étudiée est réalisée. Si elle possède une uréase active la réaction suivante aura lieu Le CO 2 et le NH 3 se combinent ensuite pour donner du carbonate d ammonium selon la réaction : Sous l action d une uréase il y a donc alcalinisation du milieu (virage de l indicateur au rouge). Après la mis en évidence le uréase le contenu du tube est divisé sur deux l un pour réaliser le test TDA et l autre pour l indole Recherche de la tryptophane désaminase :TDA Sous l action de cette enzyme le tryptophane est dégradé selon la réaction : L addition de chlorure de fer III (perchlorure de fer) réagit avec l acide indol-pyruvique en donnant un précipité de couleur marron. Recherche de la tryptophanase Certaines bactéries dégradent le tryptophane en indole grâce à une tryptophanase selon la réaction : 81

86 L addition de réactif de Kovacs se traduit par l apparition d un anneau rouge, dû à la réaction entre le noyau indole et une des substances du réactif. V Recherche de l'utilisation du glucose et du lactose, la production de H 2 S et la production de Gaz dans le milieu Hajna - Kligler Ce milieu est utilisé pour l'identification des bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriaceae et il a pour composition : Extrait de viande de bœuf Extrait de levure Peptone NaCl Système de lecture de production d H 2 S : Thiosulfate de sodium Citrate ferrique 3 g 3 g 20 g 5 g 0,3 g 0,3 g Système de lecture des caractères glucose et lactose Lactose 10 g Glucose 1 g Rouge de phénol l0,05 g Agar 12 g Le ph du milieu est d environ 7,4 donc le milieu sera de couleur orange. Ce milieu présente deux phases physiques, une pente et un culot. La souche à identifier doit être ensemencée dans ces deux phases. La pente en contact avec l'air contenu dans le tube (il faudra penser à débloquer le bouchon pour l'incubation. Le culot où il y a peu ou pas de contact avec l'air contenu dans le tube. Le fond culot est considéré donc en anaérobiose relative. Figure V.7 milieu hajna-kligler Durant l incubation la bactérie utilise le glucose comme source de carbone et d'énergie pour se développer. Dans le culot cette utilisation se traduit par une forte acidification car en anaérobiose relative le glucose est fermenté. Au niveau de la pente, l'utilisation du glucose produit peu de composés acides car son utilisation se fait par voie oxydative. Au niveau du milieu ceci ce traduira dans un premier temps par un culot jaune et une pente jaune. 82

87 Une fois le glucose consommé la bactérie va : Premier cas : Elle possède les enzymes capables de dégrader le Lactose. Le Lactose est 10 fois plus concentré que le glucose. Ceci se traduira par une utilisation fermentative dans le culot et oxydative sur la pente qui produira suffisamment d'acide pour que le milieu soit jaune dans les deux phases. Deuxième cas : Elle ne possède pas les enzymes capables de dégrader le lactose. Elle va dans ce cas utiliser les peptones du milieu. Cette utilisation se traduira par : - dans le culot aucun changement car l'acidité du culot provoquée par l'utilisation du glucose est trop importante. Le culot reste jaune. - sur la pente l'acidité provoquée par l'utilisation du glucose est faible alcalinisation sera alors dans ce cas suffisante pour alcaliniser le milieu se qui se traduira par un rougissement de la pente (virage du rouge de phénol). Production d hydrogène sulfureux H 2 S La réduction du thiosulfate en anaérobiose par certaines bactéries se traduira par la fabrication d hydrogène sulfureux, qui en réagissant avec le citrate ferrique donnera un précipité noir de FeS Production de gaz Selon la voie de fermentation du glucose empruntée par certaines bactéries, il peut y avoir production de gaz ou non. En cas de production de gaz, si celle-ci est faible il y a formation de quelques bulles dans le culot. Si elle est abondante, il y a décollement du culot. V L utilisation des citrates de carbone et d énergie : Le milieu utilisé pour réaliser ce test et le citrate de Simmons qui a le composition (g/l) suivante : Citrate de sodium 1,0 g Sulfate de magnésium 0,2 g hydrogénophosphate de potassium 1,0 g dihydrogénophosphated'ammonium 1,0 g Chlorure de sodium 5,0 g Agar 15,0 g ph = 7,1 Bleu de bromothymol 0,08 g 83

88 Le substrat est ici le citrate. Il est ici la seule source de carbone et d'énergie pour la bactérie. Après 24heures d incubation d un tube ensemencé par la bactérie à étudier tout en laissant le tube débloqué par ce que l oxygène de l air est nécessaire pour réaliser ce test. La présence de colonies le long de la strie centrale d'ensemencement sera la preuve d'un développement bactérien Les bactéries utilisant le citrate bleuissent normalement le milieu (alcalinisation) les bactéries ne l'utilisant pas ne cultivent pas. Toutefois, des bactéries peuvent utiliser le citrate comme seule source de carbone sans bleuir donc la présence de colonie est l'élément majeur de la lecture. V Recherche de décarboxyalses Le milieu utilisé est le milieu de FALKOW qui fait parti des milieux d étude du métabolisme protidique. Il permet de révéler les décarboxylases liées aux acides aminés étudiés : LDC, ODC, ADH. Ce milieu est composé de (g/l) : Extrait de levure 3 g NaCl 5 g Glucose 1 g L-Lysine, ou L-Ornithine ou L-Arginine 5 g Bromocrésol pourpre ( BCP à 1,6 % ) 1mL On ajuste le ph à 6,3-6,4. Le milieu est donc violet. Pour réaliser ce test, une suspension d une culture de la souche à étudier est réalisée et présentée en eau physiologique stérile. Ensuite les milieux sont ensemencés avec 2 ou 3 gouttes de cette suspension et recouvert avec 1 ml d huile de vaseline pour éviter l aération du milieu. Les tubes sont ensuite incubés à 37 c pendant 24 heures Pendant l incubation les bactéries dans un premier temps, fermentent le glucose en anaérobiose et donc les milieux s acidifient (virage du violet au jaune de l indicateur de ph). Dans un deuxième temps, les bactéries ayant épuisées le glucose peuvent utiliser l acide aminé présent dans le milieu si elles possèdent les enzymes adéquats. En anaérobiose et en milieu acide c est la décarboxylation des acides aminés par les décarboxylases qui est favorisée. L amine produite re-alcalinise le milieu ce qui a pour effet de faire viré au violet le milieu dans le cas contraire la couleur du milieu est jaune donc le test est négatif [73] Remarque Les figures V.8 et V.9 montrent l utilité des tests présentés ci-dessus dans l identification des bactéries [74]. 84

89 Bactéries aérobies à Gram positif Cocci Bacilles Catalase Sporulation Streptocoques Staphylocoques Bacillus Catalase + - Corynebacterium Listreia Lactobacillus Errsipelathrix Figure V.8L identification des bactéries aérobies à Gram positif Bactéries à Gram négatif Cocci Cocco-bacilles Bacilles Neisseria Haemophilus Brucella Bordetella Pasteurella Acinetobacter Oxydase Autres bacilles à Gram - Legionella Gardnerella Bartonella - + Enterobacteriaceae Fermentation du glucose Vibrions Aeromonas Figure V.8L identification des bactéries aérobies à Gram négatif Pseudomonas Campylobacter Moraxella

90 V.4 L étude de la dégradation des hydrocarbures dans un réacteur biologique Après la caractérisation physicochimique et microbiologique de la terre polluée, on a étudié la composition des différentes classes d hydrocarbures lorsque le matériel pollué est placé dans des conditions environnementales différentes du milieu d origine. Ainsi, à partir de conditions connues, choisies et maîtrisables, nous pensons pouvoir comprendre comment les voies biologiques permettent de faire évoluer un produit polluant tel que les hydrocarbures lourds. L effet des conditions de travail (température, aération, nutriment, ) sera aussi étudié pour voir si des différences significatives de composition finale apparaissent. V.4.1 Conception et mise au point de l appareillage expérimental V Etudes en laboratoire Il existe différents types de traitements biologiques des polluants organiques suivant que la digestion se réalise en présence ou en absence d air. Dans le premier cas on parle de traitement aérobie et dans l autre de fermentation. L oxydation complète de la matière organique conduit à la formation de CO 2, de H 2O et une biomasse stables. Il est bien évident que les conditions obtenues au sein d un bioréacteur réalisé au laboratoire sont différentes de celles qui existent dans les sols où a lieu l activité de la microflore tellurique ; cependant, dans les deux situations, il y a dégradation des polluants et production d autres substances diverses. Le mode de traitement biologique aérobie a été choisi pour être réalisé au laboratoire. Ce procédé de traitement par les microorganismes, dans des conditions contrôlées, permet surtout de réaliser une chaîne de traitement à une échelle réduite. En fait, à l échelle industrielle, ce contrôle est difficile, du fait de l hétérogénéité des milieux et des difficultés de maîtrise des conditions opératoires. C est la raison pour laquelle la terre polluée a été traitée, non pas sur site mais au laboratoire, par digestion accélérée en bioréacteurs. L accélération du procédé de traitement permet de réduire le temps nécessaire pour la dégradation de ces polluants organiques, facilite le suivi des différents processus de dégradation, et permet le contrôle des principaux paramètres physico-chimiques du travail (température, aération, production de CO 2 ). V Présentation des conditions expérimentales d étude Le plan expérimental est présenté sur la Figure-V.10. On a utilisé la terre polluée séchée et tamisée (<2mm). Pour ce produit, des essais ont été réalisés en conditions aérobies et sans ajustement de ph. 86

91 Terre polluée séchée PH=7 Température= 20 C 1 ère expérience Terre polluée + Eau distillée 2 ème expérience Terre polluée + Milieu nutritionnel + Aération 3 ème expérience Terre polluée + Milieu nutritionnel + Aération + Souches bactériennes isolées à partir de la terre polluée Figure V.9:Le plan expérimental Il est important de signaler aussi que la durée de traitement était de 21 jours où la terre était agitée constamment dans le réacteur avec un milieu nutritionnel dans un rapport liquide/solide de 1/10. Le liquide utilisé ici est : o L eau distillée pour la première expérience ; o Un milieu nutritionnel pour la deuxième et la troisième expérience. Ce milieu est composé de : Sulfate d ammonium NH 4 SO mg Phosphate mono-potassique KH 2 PO mg Phosphate bipotassique K 2 HPO mg Sulfate de magnésium MgSO mg Chlorure de sodium CaCl 2 40 mg Sulfate ferrique FeSO 4 1mg Sulfate de manganèse MnSO 4 1mg Eau distillée q.s.p ml Et pour stimuler l activité biologique on a ajouté du glucose pour arriver à une concentration finale de 1% en glucose [75]. V Description du dispositif expérimental La température de manipulation La température est un paramètre très important pour la bonne réussite d un traitement biologique. Durant cette étude, on a choisi de faire les manipulations à température ambiante durant toutes les manipulations pour ne pas perturber l activité microbienne. 87

92 Bioréacteurs Chaque bioréacteur (ou mini-réacteur) est constitué d un cylindre en verre de 20 cm de longueur et 10 cm de diamètre, d un volume utile de 250 ml. Ces appareils présentent les avantages non négligeables de la simplicité, le faible coût et un encombrement réduit. On peut ainsi disposer de plusieurs appareils et étudier simultanément plusieurs mélanges. Par ailleurs, leurs conditions d utilisation sont simples et facile à mettre en œuvre. Dispositif d aération Les conditions aérobies sont assurées par un flux constant d air comprimé. L utilisation d un débitmètre, pour le réglage, assure la régularité du débit d air, de l ordre de 3 l/min. Pour assurer une répartition homogène de l air dans tout le volume du réacteur un diffuseur d air a été installé à l entrée du bioréacteur. Le schéma du dispositif expérimental est représenté sur la figure-v.11 : Figure V.10: Schéma du dispositif expérimental en milieu aérobie A la sortie du réacteur, on souhaite mesurer le CO 2 produit par l activité microbienne. Pour cela, on a placé : Un erlenmeyer, initialement vide, qui recueille l eau de condensation éventuelle. Un tube absorbeur de CaCl 2 qui retient l eau-vapeur pour éviter les interférences. Un tube absorbeur de chaux sodée qui piège le CO 2 en virant du beige au violet lorsqu il absorbe le gaz carbonique. 88

93 V.4.2 Mesure de l activité microbienne dans les bioréacteurs V Le dénombrement des germes totaux Cette analyse a été réalisée selon la méthode des dilutions décimales présentées précédemment. V Suivi de la température et du ph Le ph et la température sont des paramètres facilement mesurable en introduisant des sondes spécifiques pour ce type de mesure dans le réacteur biologique V Dégagement de CO 2 Le suivi du dégagement de CO2, reflet de l activité microbienne au sein des bioréacteurs, a été réalisé pour toutes les expérimentations. Dans les tubes absorbeurs de CO2 remplis de chaux sodée, initialement tarés et quotidiennement pesés. L activité microbienne est exprimée en mg de CO 2 libéré par jour (g/j). Pour éviter tout risque de pertes, le contenu de l absorbeur est renouvelé dès que les deux tiers de sa longueur ont été affectés par le changement de coloration. V.4.3 Mesure du taux de composés organiques dégradés V Dosage du carbone organique La méthode utilisée est dérivée de celle décrite par Anne en Elle repose sur le fait que la matière organique du sol peut être oxydée par un traitement avec un mélange de K 2 Cr 2 O 7 et de H 2 SO 4 suivant la réaction suivante : K 2 Cr 2 O 7 + 3C + 8H 2 SO 4 2K 2 SO 4 + 2Cr 2 (SO 4 ) 3 + CO 2 + 8H 2 O Pour réaliser cette analyse une prise d essai (1g) est introduite dans un erlenmeyer de 500ml. On y ajoute 10 ml de bichromate de potassium (K 2 Cr 2 O 7 ) à 8% et 15 ml d acide sulfurique concentré. Le mélange est porté à ébullition pendant 5 minutes. Ensuite, on ajoute l eau distillée jusqu au volume de 250 ml et on laisse le mélange au repos pendant 3 heures. On prélève 50 ml du mélange, auquel on ajoute 200 ml d eau distillée, 1,5 ml d acide orthophosphorique (H 3 PO 4 ) et quelques gouttes de l indicateur ferroine. Les échantillons sont titrés en retour par sulfate ferreux ammoniacal (FeSO 4, (NH 4 ) 2 SO 4, 6H 2 O) ou sel de Mohr N/2. La titration de l excès de bichromate prend fin lorsque la couleur vire au violet. On fait la même chose avec un témoin de façon à obtenir la différence (témoin : sol passé au four à 550 C pendant 4 heures) [76]. Pour le calcul de la concentration en carbone organique on applique l équation suivante : C (%) = (V V) 0,3 où : 89

94 V : volume de (FeSO 4, (NH 4 ) 2 SO 4, 6H 2 O) (ml) ajouté pour titrer le témoin ; V : volume de (FeSO 4, (NH 4 ) 2 SO 4, 6H 2 O) (ml) ajouté pour titrer l échantillon. A partir de concentration du carbone organique total calculé ainsi, on peut déduire la concentration en matière organique dans l échantillon en appliquant l équation suivante : MO (%) = COT (%). 1,72 [11]. V Dosage des hydrocarbures par méthode gravimétrique Etant donné que l échantillon utilisé pour réaliser cette étude été pollués par des hydrocarbures lourds, on s est donc contenté de faire une analyse gravimétrique en suivant les étapes suivantes : Prendre 5 g de la terre à analyser la mettre dans un appareil soxhlet avec 200 ml de chloroforme après 8 heures on évapore le solvant et on pèse la capsule. Reprendre dans 60ml d hexane et faire passer l échantillon à travers une colonne (15*1) rempli de gel de silice activé à 120C pendant 8 heures et éluer successivement par : 60 ml d hexane et récupérer dans une capsule préalablement pesée la fraction aliphatique ; 60 ml de benzène et récupérer la fraction aromatique ; 60 ml de méthanol et récupérer la fraction polaire. Après évaporation des solvants on pèse les différentes capsules pour avoir le pourcentage des différentes fractions [77]. 90

95 V.5 L étude de la dégradation des hydrocarbures par voie chimique «réactif de Fenton» Le principal objectif de cette étude est de réhabiliter la terre contaminée grâce à un procédé d oxydation avancée, le réactif de Fenton. Quelques études ont déjà montré que ce procédé était relativement efficace pour réhabiliter des sols fortement contaminés en hydrocarbures. Nous avons donc recherché des conditions permettant l oxydation des hydrocarbures de la terre étudiée en produits éventuellement moins toxiques et plus biodégradables que les composés parents, le but étant d augmenter leur biodégradabilité et diminuer leur toxicité visà-vis des microorganismes. En ce qui suit, nous détaillerons le matériel et méthodes utilisés pour l application de la réaction de Fenton sur les échantillons prélevés de la raffinerie. V.5.1 Prétraitements des échantillons Les échantillons sont séchés et directement broyés au mortier et les particules supérieures à 2 mm éliminées par tamisage. Ensuite ils sont conservés dans un récipient en polypropylène, à l obscurité et à température ambiante jusqu à leur utilisation. V.5.2 Préparation des milieux réactionnels Toutes les expériences ont été réalisées en respectant les conditions suivantes : Toutes les expériences ont été réalisées à température ambiante, dans des flacons en verre avec des bouchons en Téflon de 250 ml. Le rapport liquide/solide=10 était choisi entre l échantillon et les solutions de réactif ajouté. Les différents milieux réactionnels sont préalablement acidifiés par ajout d acide sulfurique à 1 mol.l -1 sous agitation jusqu à ph 3 (le ph étant déterminé avec un phmètre). La solution mère de fer ferreux à 0,05 mol/l est préparée dans une fiole jaugée (100 ml) par dissolution de la masse appropriée de sulfate de fer heptahydraté (FeSO 4, 7H 2 O) avec de l eau distillée à ph 3 pour éviter l hydrolyse des ions ferreux ou ferriques (ces derniers pouvant être présents sous forme de traces) qui se produit au dessus de ph 7 et 3,5 respectivement. Puis elles sont transvasées dans un flacon et stockées à température ambiante. Cependant, ces solutions n étant pas stables, elles ne sont pas conservées au-delà d une heure. En effet, au bout de quelques heures, la couleur de la solution, initialement bleutée, vire au jaune-vert ce qui est caractéristique de l oxydation des ions ferreux en ions ferriques. Par conséquent, les solutions mères de fer ferreux sont préparées juste avant le début de chaque expérience. 91

96 La solution mère de peroxyde d hydrogène à 30% (V/V) est stockée dans des récipients ambrés car le peroxyde d hydrogène se décompose rapidement sous l action de la lumière. V.5.3 Application du réactif de Fenton à des suspensions aqueuses de terre polluée Le réactif de Fenton a été appliqué sur tous les échantillons de la manière suivante : Un volume donné d eau bidistillée (20ml) est immédiatement introduit dans le flacon contenant 6 g de la matrice sèche. Puis le milieu réactionnel est agité avec un barreau aimanté (flacon ouvert) et le ph est ajusté à 3. Après 30 minutes d agitation, une solution d ions ferreux est ajoutée. Puis, après 3min d agitation, le volume approprié du peroxyde d hydrogène à 30% est ajouté sur 4 doses, par intervalles de 30 min chacun. Ensuite, l eau bidistillée est encore ajoutée si nécessaire pour arriver au rapport liquide/solide=10, et le flacon est fermé pour éviter l évaporation de la solution. Au bout de 6 jours d agitation, la suspension est filtrée et le filtrat est séché dans l étuve à 60 C pour être analysé. V.5.4 L étude de l effet de quelques paramètres opératoires sur le rendement de la réaction L efficacité du système Fenton est fonction de nombreux paramètres tels que les concentrations initiales en ions ferreux et en peroxyde d hydrogène, les concentrations initiales en substrats organiques, le ph, la température, la présence d oxygène moléculaire dissous, et la quantité de composés inorganiques présents initialement dans le milieu tels que les ions sulfates ou chlorures. Pour une concentration initiale en substrats organiques et une température donnée, les principaux paramètres qui peuvent influer sur l efficacité du réactif de Fenton et qui ont été étudiés au laboratoire sont les suivantes : L effet du rapport [H 2 O 2 ]/ [Fe 2+ ] On a essayé d optimiser le rapport [H 2 O 2 ] 0 / [Fe 2+ ] 0 en fixant la quantité initiale de peroxyde d hydrogène, et en variant la quantité de sulfate ferreux ajoutés au milieu réactionnel. Le tableau V.2 montre les différents mélanges préparés au laboratoire pour faire cette optimisation. Tableau V.2: optimisation du rapport [H 2 O 2 ] 0 / [Fe 2+ ] 0 Rapport Volume ajouté de Volume ajouté du sel 92

97 H 2 O 2 /FeSO 4 H 2 O 2 (ml) ferreux (ml) , , , , , ,23 L effet de la concentration initiale en peroxyde d hydrogène Après le choix du rapport optimal de [H 2 O 2 ] 0 / [Fe 2+ ] 0, l effet de la concentration initiale en peroxyde d hydrogène a été aussi étudié en variant le volume ajouté de ce dernier entre 2 et 12 ml et en ajoutant le volume correspondant en sulfate ferreux selon la rapport optimal de [H 2 O 2 ] 0 / [Fe 2+ ] 0 choisi. L effet du ph La réaction de Fenton a généralement lieu en milieu très acide pour prévenir la précipitation des sels de fer en hydroxydes correspondants. Cependant, il y a eu des études où le réactif de Fenton a été utilisé, d une manière efficace, sans acidification du milieu. [54] De notre part, on a voulu appliquer cette hypothèse sur notre échantillon pour voir son efficacité en comparant les résultats obtenus avec ou sans modification de ph. L effet du type de sel de fer utilisé comme catalyseur de réaction Il existe plusieurs type de sel de fer qu on peut utiliser pour accélérer la réaction. Ainsi, on a comparé l efficacité de la réaction en utilisant trois sources différentes du fer dans le milieu réactionnel: 1. Le sulfate ferreux FeSO 4.7H2O 2. Le sulfate ferrique Fe 2 (SO 4 ) 3 3. Les sels de fer qui existent naturellement dans l échantillon L effet du rapport liquide/solide Le rapport liquide/solide= 10, choisi au début de l expérience, a été aussi optimisé en le variant de 3 à 20. L effet de l agitation 93

98 L agitation est un paramètre important pour la génération des radicaux hydroxyles responsables de l oxydation. Ce paramètre a été mis en évidence en comparant les résultats obtenus pour des échantillons agités avec ceux qui n ont pas été agités. V.5.5 Traitement des suspensions Les principales étapes du traitement des suspensions sont les mêmes. La Erreur! Source du renvoi introuvable.v.12 présente le schéma récapitulatif de ces étapes, et celles-ci sont détaillées ensuite. Fe 2+ puis H 2 O 2 Le filtrat est séché à 60 C pendant 24 heures Analyse gravimétrique des hydrocarbures totaux Agitation n jours Analyse H 2 O 2 résiduel sur le surnageant récupéré Figure V.11 : Schéma récapitulatif des différentes étapes de traitement des suspensions de la terre traitée. V Séparation surnageant / matrice A la fin de chaque expérience, le flacon contenant la suspension de terre mélangée avec le réactif de Fenton est mise au repos à fin de récupérer le surnageant à l aide d une pipette. Ensuite le flacon est rincé avec de l eau distillée et le tout est transvasé dans un entonnoir contenant un papier filtre pour séparer la terre traitée de l eau de lavage. V Traitement des matrices solides Le papier filtre contenant la matrice est placé dans une étuve (60 C) avant que les culots séchés ne soient récupérés et homogénéisés dans des cristallisoirs. Les hydrocarbures sont ensuite extraits par solvant (chloroforme) dans un appareil soxhlet selon les conditions présentées précédemment (chapitre V.4.3.2). V Traitement des surnageants Pour les surnageants aqueux, une analyse du peroxyde d hydrogène résiduel est réalisée dans le but de confirmer que la quantité de H 2 O 2 ajoutée au début de chaque expérience est totalement consommée avant de filtrer l échantillon et procéder à l analyse des hydrocarbures. 94

99 Principe On trouve généralement dans le commerce le peroxyde d hydrogène sous la forme de solutions aqueuses contenant environ 6%, 12% ou 30% de H 2 O 2, fréquemment connues sous le nom de solutions à 20, 40 et 100 volumes. Ces expressions rapportant au volume d oxygène libéré lorsque la solution se décompose à l ébullition. Ainsi, 1ml de H 2 O 2 à 100 V donnera 100 ml de O 2, dans les conditions standard de température et de pression. La réaction suivante intervient lorsqu une solution de permanganante de potassium est ajoutée à une solution de peroxyde d hydrogène acidifié à l acide sulfurique : 2MnO H 2 O 2 + 6H + 2Mn O 2 + 8H 2 O Cette réaction est la base de la méthode d analyse décrite ci-dessous. Il est recommandé d utiliser des solutions relativement concentrées d acide et d ajouter assez lentement le permanganate cela afin d éviter la formation de dioxyde de manganèse, catalyseur actif de la décomposition du peroxyde d hydrogène. Pour des solutions légèrement colorées, ou pour des titrages par le permanganate dilué, il est également recommandé d utiliser la ferroine comme indicateur. Certaines substances organiques peuvent gêner le dosage. L observation d une certaine tendance du permanganate à ce décolorer après le point d équivalence signale la présence d autres agents réducteur. Dans ce cas l iodométrie est préalable. Procédure 10 ml de la solution à analyser est transférée dans un erlenmeyer, diluer et acidifiée en ajoutant respectivement 20 ml d eau distillée, 10 ml d acide sulfurique à 0,1 mole/l. Ensuite la solution ainsi préparée est titrée par une solution de permanganate de potassium à 0,02 mole/l jusqu à l obtention d une couleur rose, faible mais persistante [78]. 95

100 VI Résultats et discussions VI.1 Caractérisation physicochimique de la terre polluée La caractérisation du sol pollué a été effectuée en utilisant les différentes méthodes décrites dans la partie "Matériels et méthodes". Le Tableau-VI.1 reprend les résultats obtenus. Tableau VI.1: caractéristiques physicochimique du sol pollué étudié Paramètre Résultat d analyse Granulométrie Limon fin 1% Limon grossier 4% Argile 7% Sable fin 5,08% Sable grossie 84,13% Carbone organique total 3,21% Matière organique 5,52% Hydrocarbures Hydrocarbures totaux 4,6145 % Fraction aliphatique 2,3435% Fraction aromatique 0,2439% ph Fraction polaire 1,1845% pheau = 7,82 phkcl =7,47 conductivité 173µs/cm azote total 0,15% phosphore total 0,01% Fer 0,43% Germes totaux 4,8 105 UFC/g D après le tableau VI.1 on remarque que : La valeur du ph du sol montre que le sol est neutre ; L analyse granulométrique montre que la fraction prépondérante est celle du sable (plus de 89%). Le sol étudié est donc classé comme sol très sableux ; Le sol contient 5,52 % de matière organique cette valeur est proche de la concentration des hydrocarbures totaux qui est de 4,61 % ce qui signifie que la quasi-totalité du matière organique est issue des hydrocarbures présent dans le sol ; Quant aux nutriments, et d après les analyses du phosphore et de l azote total, on remarque que le sol est pauvre en nutriments, ce qu il n est pas favorable pour 96

101 l activité microbienne et par conséquent diminue leur pouvoir à dégrader les hydrocarbures présents dans ce sol. VI.2 Analyses microbiologiques VI.2.1 Identification des colonies isolées du milieu PCA L isolement des colonies issues de la terre polluée étudiée selon le protocole présenté dans le chapitre précédent a permis de mettre en évidence six isolats majoritaires. Les caractéristiques morphologiques et physiologiques de ces isolats sont résumées dans le tableau suivant : Tableau VI.2: description des colonies isolées du milieu PCA Colonie Taille Forme Contour Epaisseur Aspect Couleur Gram Mobil Lisse Bacille 1 1 à 2mm Circulaire régulier Bombé Opaque Gram + Verte Crémeuse à 3mm Circulaire régulier Bombé 3 2 à 3mm Circulaire régulier Bombé 4 2 à 3mm Circulaire régulier Bombé 5 2 à 3mm Circulaire régulier Bombé 6 7mm Ovale ou circulaire Plissé Plate Lisse Opaque Translucide Lisse Crémeuse Opaque Lisse Muqueuse Opaque Lisse Crémeuse transparente Translucide Brillante Grasse Blanche Jaune Verte vers le jaune Verte odeur de jasmin Beige Coque Gram + Coque Gram + Bacille Gram - Bacille Gram - Bacille Gram Chacun des 6 isolats mis en évidence par cette méthode subissent, ensuite, des tests biochimiques dans le but de les identifier. Ainsi, les isolats N 2, 3 et 6 qui sont des bactéries Gram positif, sont soumis au test de catalase pour les différencier. (Voir tableau VI.3) Quant aux isolats caractérisés pour être des bacilles Gram négatif, ils sont soumis au test d oxydase pour séparer les entérobactéries des pseudomonas. Ensuite, les étapes suivantes sont suivies : 1. Les bacilles Gram négatif et oxydase négative sont soumis à une galerie biochimique destinée à séparer entre les entérobactéries ; (voir tableau VI.4) 2. Les pseudomonas sont ensemencés sur les milieu King A et King B pour les différencier en mettant en évidence les pigments produits par ces derniers (tableau VI.5) 97

102 Colonie Tableau VI.3 : Les résultats du test de catalase Test de Observation microscopique Diagnostique catalase 2 Cocci en chainette + Streptocoque 3 Cocci en ams - staphylocoque 6 Bacilles sous forme de lettres d'alphabet + corynebacterium Tableau VI.4: Les résultats de la galerie biochimique réalisée sur les bacilles à Gram négatif Colonie Lac Glu H 2 S Gaz Urée Indole Citrate TDA Oxydase Diagnostique Proteus mirabilis Echerichia coli Pseudomonas Noms des milieux King A King B Tableau VI.5: le mode opératoire de l utilisation et la lecture des milieu King A et B [79] Composition Aspect initial Aspect après au moins et mode 24h à 30 C d ensemence ment Peptone de gélatine Glycérol Sulfate de potassium Chlorure de magnésium Agar Polypeptone Glycérol Phosphate bipotassique Sulfate de magnésium agar Inoculer un tube de milieu A et un tube de milieu B en faisant une strie médiane à la surface de la gélose avec une anse de culture prise dans un bouillon ou sur une gélose Replacer la capsule sur chaque tube sans le revisser Culture colorée en bleuvert (pyocyanine) et parfois en brun-rose (pyorubrine). En cas de doute, prélever l eau de condensation à la pipette pasteur et verser 0,5ml de chloroforme sur la pente du milieu. Laisser 5 à 1à mins en position inclinée. La pyocyanine colore le chloroforme en bleu Culture colorée en vert fluorescent (pyoverdine) Résultats interprétations Si présence de pyoyanine, on identifie pseudomonas aeruginosa Présence de pyoverdine caractéristique de : pseudomonas aeruginosa pseudomonas fluorescens pseudomonas putida Remarque Pour la souche de pseudomonas isolée à partir de notre échantillon il y a eu production des deux pigments et pour la recherche des décarboxyalses, pour la même souche, on a eu comme résultat : ADH+, ODC- LDC-, donc c est une pseudomonas aéroginesa 98

103 VI.2.2 Identification des colonies isolées du milieu Sabouraud Le tableau-vi.6 résume les résultats de l identification, par observation microscopique, de l ensemble des champignons qu on a pu isoler à partir de la culture d une suspension de la terre polluée réalisée sur la gélose sabouraud. Tableau VI.6: description des colonies isolée sur milieu Sabouraud Aspect Aspect Colonie Couleur Forme macroscopique microscopique Diagnostique 1 verte Circulaire Bombé Rigoureuse Aspergillus 2 Beige Circulaire Plate Rigoureuse Microsporum 3 Blanche Ovale ou circulaire Plate Rigoureuse Candida Cette étude microbiologique a été faite dans le but de sélectionner des souches microbiennes capables d améliorer le processus de dégradation des hydrocarbures présents dans l échantillon étudié. Parmi les souches qu on a isolée, les souches suivantes on été sélectionnées pour être utilisées dans le traitement biologique : Pseudomonas aéroginosa et Corynébaccterium. Ce choix a été basé sur les critères suivants : Les souches sélectionnées sont des bactéries, et on a préféré utiliser les bactéries et non pas les champignons pour éviter d acidifier le milieu, car les champignons même s ils sont performants aussi bien que les bactéries pour la dégradation des hydrocarbures, mais ils nécessitent un ph acide pour un meilleur rendement du traitement et on voulait travailler sans effectuer aucun changement ni de ph ni de température du milieu. Parmi les bactéries isolées pseudomonas aéroginosa et corynébaccterium sont les plus connues pour être utilisées dans le traitement des sols pollués par des hydrocarbures à cause de leur production de biosurfactants qui vont solubilisés les hydrocarbures hydrophobes adsorbés sur les particules du sols et les rendant, par conséquent, plus disponibles pour les autre bactéries et faciliter, par la suite, leur dégradation. 99