Le développement embryonnaire chez les Vertébrés

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1 Le développement embryonnaire chez les Vertébrés On va principalement étudier l'embryogenèse à partir de 3 modèles que sont le Xénope, le Poulet et la Souris. On s'attachera surtout à montrer la ressemblance entre ces 3 types d'organismes, à la fois avant et après la segmentation. On étudiera ensuite les différentes étapes de développement chez les Vertébrés, en se basant toujours sur les 3 modèle L'établissement des axes est très précoce chez les Vertébrés, qui sont des animaux avec des axes très bien définis. En 1870, Geoffroy St-Hilaire a observé qu'un homard à l'envers ressemble fortement à un Vertébré, avec un SN dorsal et un TD ventral. Cette ressemblance l'a mené à dire qu'au cours de l'évolution, on a eu inversion de l'axe DV, mais cet axe est défini à partir de la position de la bouche : c'est donc qu'on aura également modification de l'emplacement de la bouche. A la suite d'expériences génétiques, anatomiques, on a pu montrer que l'on a effectivement de très grandes ressemblances ans le plan d'organisation des Vertébrés et des Invertébrés, et les molécules engagées dans l'embryogenèse semblent conservées, tout comme les principaux mécanismes. Les Vertébrés et les Invertébrés supérieurs présentent quelques particularités. ainsi, les animaux supérieurs ont tout de même développé des structures complexes : ainsi le pôle antérieur est bien développé : il est orienté dans le sens de la marche, et il est en général spécialisé dans la perception sensorielle. Les têtes que l'on peut observer sont très différentes chez ces individus (baleine, souris, hominidés ), mais la différence se fait plus encore sentir ave les Invertébrés (dont les Insectes ) : cela est en réalité dû à une implication différente des crêtes neurales. De plus, ces individus présentent une asymétrie dans tous les plans, mais cette asymétrie des Vertébrés est toujours précédée d'une asymétrie moléculaire initiale. Cela implique que l'on doit avoir des composants maternels disposés de manière ordonnée dans l'ovocyte et des facteurs externes qui pourront leur donner un "coup de pouce". A partir de cette asymétrie moléculaire; on peut comprendre pourquoi on obtient des cellules très différentes, et un organisme complexe formé d'entités différentes. Une fois les groupes de cellules déterminées, des signaux pourront être échangés : ce sont des voies toujours adaptées aux interactions au sein de l'embryon. Cependant, au cours du développement embryonnaire, on a beaucoup plus de signalisation que de nature de signaux différentes : c'est donc qu'à plusieurs reprises on retrouve les mêmes types de molécules. C'est par exemple le cas des membres de la famille des TGFβ, fortement impliqués dans la mise en place de l'axe DV, mais aussi des membres de la famille des Wnt et shh : dans tous les cas, une même molécule pourra avoir plusieurs fonctions. On a coutume de considérer qu'un ligand intervient avec un récepteur, mais en réalité, les communications sont beaucoup plus complexes : en effet, on aura intervention de plusieurs types de molécules pour assurer une seule différenciation : on aura par exemple des activations et facteurs puis des inhibitions. 1

2 I) Les modèles animaux 1) Description a) Les Amphibiens Le Xénope est une grenouille sud-américaine, possédant des griffes. L'adulte est obtenu après différentes phases de développement : fécondation, segmentation, gastrulation pour la mise en place des 3 feuillets A ce stade, l'embryon n'a toujours pas changé de volume : toutes les cellules, sauf peut-être les cellules les plus végétatives remplies de vitellus (elles seront digérées après formation du TD) contribuent à la formation de l'individu. On obtient alors un têtard, qui devra subir une métamorphose pour donner la grenouille adulte comme on peut l'observer. Cet animal est assez facilement manipulable, et on a pu développer de très nombreux outils moléculaires : anticorps dirigés contre certaines protéines, banque de cdna Cependant, ce sont des animaux quasiment tétraploïdes, et c'est pourquoi il est très difficile d'intervenir directement sur les gènes. On peut tout de même très facilement faire des manipulations sur les stades de développement précoce. b) Le Poulet c'est un animal très employé depuis Aristote, et ce dans de très nombreux domaines de la biologie. L'œuf est très différent de celui que l'on connaît chez les xénopes, et la quantité de vitellus est telle que l'on ne peut imaginer les mêmes mécanismes développementaux que chez l'amphibien. La segmentation va ainsi créer des cellules peu séparées les unes des autres (on a uniquement des cloisons transversales), juste à la surface du jaune. A partir de cette population de cellules, on aura formation à la fois de l'embryon et de toutes les annexes embryonnaires (allantoïde, amnios ). Tout comme chez l'amphibien, on assistera ensuite à une gastrulation et à une neurulation, mais aucune métamorphose ne sera nécessaire. Le nombre de chromosomes est très élevé chez les poulets, ce qui rend l'analyse très complexe et la transgenèse presque impossible. Cependant, c'est un animal très robuste, et les manipulations sur l'œuf (greffes, ablation ) sont assez faciles. 2

3 c) La Souris Elle est apparu asse tard dans les laboratoires ;: en effet, les embryons sont assez difficilement accessibles, et les expériences menées sur les Amphibiens ne sont pas reproductibles. De plus, comme chez les Poulet, on a formation d'annexes embryonnaires et bon nombre de cellules formées au cours de la segmentation ne participeront pas à la formation de l'embryon. Au terme des processus d'embryogenèse, on va obtenir un adulte, et si dans leur globalité ils sont très comparables à ce que l'on a vu précédemment, la gastrulation en détail est très particulière. En effet, à l'opposé du poulet et de nombreux Mammifères, elle se fait non pas à plat, mais sous la forme d'un s'un dé à coudre, ce qui rend son étude beaucoup plus complexe. Les transplantations et greffons sont assez difficiles réaliser chez les souris, et notamment du fait que le développement est interne. Par contre, chez les souris, les manipulations génétiques sont 3

4 très faciles : on connaît de nombreux mutants naturels, et la génétique a pu créer encore d'autre types de mutants, que l'on appelle KO. De plus, les cultures de cellules de souris ont été bien développées, et on peut facilement étudier la différenciation d'un tissu. Finalement, on peut voir que chaque modèle présente des avantages, et selon le type d'expérience que l'on veut réaliser, on choisira plutôt l'un ou l'autre. On doit également avoir des considérations logistiques et scientifiques, qui favoriseront tel ou tel modèle d'étude 2) Le stade phylotypique Les différents cycles de développement des 3 modèles étudiés présentent une certaine parenté malgré les différence, et on l'a remarqué depuis assez longtemps. Cependant, les stades précoces restent très différents : ainsi la segmentation est régie par des mécanismes plus ou moins différents, et la gastrulation semble également engager des processus différents. Les stades fœtaux contribuent à l'installation des particularité de chaque espèce (poil, plumes, ailes ), et c'est pourquoi il est difficile de les comparer. Cependant, il existe un stade où tous les Vertébrés sont très comparables : c'est ce qu'on appelle stade phylotypique ou pharyngula. On y retrouve une grosse tête, une queue, des somites, un système nerveux creux et des arcs branchiaux ou poches pharyngiennes (dont la présence a donné le nom à ce stade). C'est à partir de cette observation que Haeckel a émis la théorie de la récapitulation dans les années 1870 : il a supposé que l'on aurait une succession linéaire de l'évolution au cours de l'embryogenèse. Par exemple si on considère le développement de l'homme, on retrouve un protiste (zygote), un protiste colonial (blastula), un poisson (pharyngula) C'est bien entendu une théorie très différente de celle de Darwin, puisque Haeckel suppose que l'évolution de l'individu nécessite l'ajout d'une étape du développement. 4

5 En réalité, même si on a effectivement des similarités, il existe beaucoup de différences entre les 3 modèles. De plus, la théorie de Haeckel a été très exploitée par les racistes, qui pensent alors que certains peuples du 1/3monde auraient un stade de développement en moins Mais tout de même, il existe des similarités que l'on doit expliquer. C'est pour cela que Von Baer a émis une hypothèse tout à fait opposés à celle de Haeckel : il suppose que ce sont les formes embryonnaires des ancêtres communs qu sont récapitulés. A partir de là, un développement post-phylotypique est possible pour chaque embranchement, et l'embryogenèse ne récapitule pas la phylogenèse. Le développement des Vertébrés semble montrer comme un goulot d'étranglement : en effet, les stades précoces comme les stades tardifs présentent de nombreuses variantes, alors que le stade phylotypique est unique. Apparemment, ce serait un stade où aucune variation ne serait possible, et aucune mutation n'a pu apporter de nouvelles capacités A partir du stade phylotypique, les arcs branchiaux qui représentent une constante pourront avoir des devenirs très différents : fentes branchiales, mâchoires, glandes (thymus par exemple), osselets de l'oreille interne Chez certains individus, on a pu observer certains caractères très étonnants : par exemple, on peut trouver des traces d'organes normalement absentes, mais présents chez les ancêtres Ainsi on aura apparition d'une queue ou de tétons surnuméraires sur le ventre des hommes, de pattes arrières chez les baleines, de 5 e doigt chez les poulets. Dans tous les cas, les structures que l'on aurait dû observer sont absentes : on pense que c'est une inhibition d'un caractère ancestral qui favorise la formation des organes spécifiques, et l'absence d'inhibition provoque l'apparition de ces structures ancestrales. II) La spécification initiale du plan d'organisation 1) Chez le Xénope Les ovocytes des Amphibiens sont de grande taille et le vitellus y est très abondant : le pôle végétatif est caractérisé par la présence abondante de plaquettes vitellines, mais le pôle animal contient la vésicule germinative. Dans l'oviducte, les différents ovocytes sont orientés n'importe comment (à la différence des drosophiles), alors comment expliquer la localisation précise du vitellus? La vitellogénine sécrète par le fois de la mère est endocytée par toute la surface de l'ovocyte, mais elle est ensuite accumulée au pôle végétatif. Cela est peut-être dû à l'organisation elle-même de la cellule : on a souvent l'habitude d'orienter les cellules, quelles qu'elle soient, selon un axe noyaucentrosome, et la formation des microtubules se ferait donc de manières orientée. A la fin de l'ovogenèse, on obtient alors une asymétrie moléculaire très bien dessinée : on a accumulation de certains ARNm au pôle végétatif ou au pôle animale. Cela correspond aux prémices de l'axe animal-végétatif et on pourrait même délimiter les futurs territoires : ectoderme au pôle animal, mésoderme autour de l'équateur et endoderme au pôle végétatif. On peut également dire que le pôle animal préfigure le futur pôle antérieur, mais à ce stade, l'axe DV n'est pas encore déterminé. 5

6 Ce sera la fécondation ou n'importe quel artifice mimant la pénétration du spermatozoïde qui déterminera l'axe DV. En effet, cela provoque la rotation d'une mince couche de cytoplasme au pôle opposé au point d'entrée, mais cela ne concerne que la partie superficielle. Cela va également intervenir sur la disposition des ARNm : certains molécules qui étaient végétatives se retrouvent plus concentrées au futur pôle dorsal. 2) Chez le Poulet Le vitellus se dépose successivement au cours du développement de l'ovocyte ;: il occupe alors la presque totalité de l'œuf et le noyau est repoussé vers le pôle animal. Les déterminants maternels sont là encore essentiels puisque l'expression de génome zygotique ne commence qu'après 10 ou 11 divisions. Au moment de la fécondation, la segmentation ne se fera qu'au pôle animal, là où le vitellus est le moins abondant. Cependant, contrairement aux amphibiens, on a une forte polyspermie: les spermatozoïdes peuvent donc entrer à n'importe quel endroit de l'ovocyte. De plus, la cellule est de grande taille, donc on peut difficilement imaginer un réseau microtubulaire qui ferait tourner le cytoplasme les mécanismes seront donc très différents. A l'issue de la segmentation, on a formation d'un blastodisque, et lorsque l'œuf est pondu, l'embryon compte cellules. Cependant, seules 500 participeront à la formation de l'embryon. Dans ce disque, on a pu établir que le pôle postérieur du futur embryon se trouve en périphérie, alors que le pôle antérieur se trouve plutôt vers le centre. De plus, même si on a une seule couche de cellule dans le disque, on suppose que la face vitelline sera la face dorsale. Lors de la progression de l'ovocyte dans l'oviducte, il se déroule un évènement très important : l'œuf va entrer en rotation et effectue ainsi de 10 à 12 tours par heures (un témoignage de cette rotation est l'aspect des chalazes). Le blanc et la coquille peuvent très facilement tourner, mais le vitellus étant trop lourd, l'embryon ne pourra que s'incliner. C'est à ce moment-là que le véritable axe antéro-postérieur est déterminé : le pôle postérieur est dans la partie haute du disque. 6

7 Suite à la ponte, on va assister à une prolifération cellulaire accrue dans la zone postérieur, ce qui permet de mieux caractériser encore cette zone. C'est Von Baer qui a établi une règle sur l'orientation de l'embryon dans l'œuf : en effet, il a remarqué que plus de 9 fois sur 10, l'embryon se dispose perpendiculairement au grand axe de l'œuf, et il semble regarder vers la petite pointe. Tout cela serait apparemment régi par la rotation de l'œuf dans l'oviducte. 3) Chez la souris a) La détermination des axes L'œuf de souris ne renferme pas de vitellus : l'embryon doit donc se suffire à lui-même assez rapidement, et c'est pour cela eu le génome zygotique s'exprime dès le stade 2 cellules. Cela entraîne également le fait que les déterminants maternels sont assez rares : l'asymétrie moléculaire est donc très peu développée. Les cycles cellulaires sont très longs (entre 12 et 24h), et les divisions sont très rapidement asynchrones. 7

8 Après un certain nombre de divisions, on obtient une morula où toutes les cellules sont capables de redonner un embryon entier : ce sont donc des cellules totipotentes. Après ce stade, on assiste à une association très forte des cellules entre elles : c'est le phénomène de compaction, qui est principalement dû à la synthèse accrue d'e-cadhérine (ou uvomoruline). A l'issu de cela, les cellules deviennent polarisées. Les divisions cellulaires vont ensuite adopter des plans de divisions au hasard, qui seront verticaux ou horizontaux : on obtient alors des cellules externes ciliées et des cellules internes non ciliées. Seul un effet de position pourra expliquer le devenir différent des cellules externes et internes En effet, les cellules internes donneront les cellules de la masse interne, alors que les cellules externes donneront le trophoblaste extracellulaire (ou trophectoderme). L'embryon lui-même sera issu de la masse cellulaire interne, mais les annexes embryonnaires seront issues à la fois de cette masse (cas pour le chorion et l'amnios) et du trophectoderme. Cette 1 e différenciation des cellules semble irréversible puisque les cellules du trophoblaste ne peuvent pas redonner l'embryon. Cependant, on ne peut toujours pas déterminer d'axe au sein de cet embryon Le blastocyste que l'on obtient alors est creusé par un blastocœle, et composé de 2 populations très différentes de cellules. On peut observer qu'une partie des cellules de la masse interne s'étale le long du trophoblaste : elles donneront la partie interne du sac vitellin. Dans le trophectoderme, on peut là aussi différencier 2 types de cellules : des cellules polaires et des cellules de très grande taille et polyploïdes suite à des caryocinèse sans cytodiérèse. C'est au stade blastula que l'embryon va s'implanter et se libérer de sa gangue protectrice de cellules folliculaires. L'embryon est alors sous forme d'une couche unicellulaire, et la gastrulation mettra en jeu des processus très particuliers. 8

9 Lors de la fécondation, on va assister à l'achèvement de la méiose, et le second globule polaire se forme exactement à l'opposé du point d'entrée du spermatozoïde. On peut marquer ce point à l'aide d'une bille fluorescente, et cela permet de mieux matérialiser le 1 e axe animal-végétatif. Lors de la 1 e division cellulaire, on observe que la bille se retrouve exactement au centre du plan de clivage. La 2 e division est ensuite diachrone : elle se fait d'abord dans l'un des 2 premiers blastomères (donc on aura un stade 3 cellules), et la bille est intégrée dans l'une des 2 cellules ainsi obtenues. Au stade blastocyste, on peut repérer l'emplacement du futur embryon par rapport au trophectoblaste : cela détermine un axe embryonnaire/abembryonnaire. De plus, la bille que l'on peut toujours repérer marque le pôle animal 9

10 Au stade épiblaste, on retrouve des cellules de l'endoderme viscéral : elles n'interviennent pas dans la formation de l'embryon mais jouent un rôle essentiel dans la détermination de l'axe AP. Si on déplie l'épiblaste, on peut former un disque plus ou moins plat, que l'on peut comparer avec le disque du poulet : par analogie, la partie postérieure de l'embryon se trouve donc en périphérie Chez le poulet, c'est l'inclinaison de l'embryon qui pouvait localiser avec précision de pôle postérieur : chez la souris, l'axe sera simplement déterminé selon l'axe proximo-distal et selon l'endoderme viscéral L'axe AP aura donc globalement la même orientation que l'axe proximodistal, avec une légère rotation De plus, comme chez le poulet, on suppose que la future face dorsale est à l'intérieur du cylindre de l'épiblaste. b) Détermination des blastomères Dans un morula, les blastomères sont tous identiques : ce sera simplement une information de position qui déterminera leur devenir. Millman a prélevé des blastomères indifférenciés de morula et il les a réimplanté à différents endroits d'une autre morula. Si l'implantation se fait en périphérie, le blastomère participe à la formation du trophectoderme, mais si elle se fait au centre, alors il participe à la formation du bouton embryonnaire (= masse cellulaire interne). Il semble donc que c'est bien la seule position qui indique la destinée. 10

11 On a également pu réaliser des chimères d'agrégation à partir de 2 morula : on obtient donc une morula chimérique 2 fois plus grande que la normale. Cependant, on obtient une souris de taille normale, qui sera tétraparentale : c'est donc que les différents blastomères subissent une forte régulation c) Les cellules souches Les cellules souche sont toujours prélevées à partir du blastocyste, mais elles ne peuvent se maintenir en culture qu'en présence de LIF (Leukemia inhibitory factor). A partir de ces cultures, on obtient des cellules souches embryonnaires ES, que l'on peut conserver pendant très longtemps (elles peuvent se diviser de manière presque infinie). Cependant, si on enlève le LIF, les cellules ES se différencient, et on obtient alors de très nombreux types cellulaires : os, cardiomyocyte, adipocyte, neurone Les travaux actuels les plus importants consistent à connaître dans quel environnement telle différenciation sera favorisée : cela permettrait une utilisation des cellules ES en thérapie cellulaire. Les cellule souches ES peuvent être modifiées pour certains gènes et réimplantées ensuite dans un blastocyste : on obtient alors des souris chimériques, dont la plupart des lignées cellulaires seront génétiquement modifiées. 11

12 On peut tout de même obtenir des cellules similaires à partir de cellules germinales primordiales d'un fœtus : elles sont alors appelées cellules EG et peuvent là encore donner toutes les cellules possible (totipotence). Chez les adultes, on retrouve des cellules souches dans des tératocarcinomes (cancer des testicules), capables de se diviser ou de se différencier. III) La gastrulation 1) Les mouvements cellulaires La gastrulation est une phase qui permet aux différents feuillets embryonnaires d'arriver à leur disposition finale. Elle s'accompagne de différents mouvements cellulaires : des ensembles cellulaires assez éloignés pourront alors entrer en contact, ce qui permettra des induction entre les différents tissus. A la fin de la gastrulation, les organes sont plus ou moins en place, de même que les axes AP et DV (on peut retrouver une tête, un dos ). Un des éléments cruciaux de la gastrulation est le blastopore : sa destinée finale permet de séparer les protostomiens (c'est la bouche qui se creuse en 1 e : Annélides, Mollusques et Arthropodes) des deutérostomiens (Chordés et Echinodermes). Chez les Protostomiens, le blastopore donne à la fois la bouche et l'anus, alors que chez les Deutérostomiens il ne donnera que l'anus. Chez ces derniers, la bouche ne sera qu'un orifice secondaire : elle se perce à l'extrémité du tube digestif mais n'aura pas la même origine que l'anus. Malgré les différences entre les organismes, la gastrulation s'accompagne toujours des mêmes types de mouvements cellulaires : - l'invagination : cela permet de creuser un tube à l'intérieur de l'embryon. C'est la forme la plus simple de la gastrulation, que l'on retrouve chez l'oursin. - l'involution : c'est un phénomène très similaire à l'invagination, mais les cellules vont migrer sur la face interne des cellules constituant la couche externe. L'épithélium va rester cohérent, et seuls les contact cellule/cellule se défont entre la couche interne et la couche externe : cela permet une progression plus importante vers l'intérieur de l'embryon. - l'extension convergente : les cellules ne vont pas migrer, mais simplement changer de forme. Le plus souvent, les cellules vont s'allonger, ce qui assure un rétrécissement en épaisseur des structures. Ce type de mouvement cellulaire peut également s'accompagner de l'intercalation de cellules parmi d'autres : par exemple on peut passer de 4 couches de cellules à seulement 2 couches, tout cela en ne rompant que les contact cellule/cellule. - l'épibolie : une couche cellulaire va s'étaler, ce qui lui permet de recouvrir puis d'englober d'autres cellules, souvent plus grandes. 12

13 - la délamination : à partir d'un population hétéroclite, on va avoir ségrégation de 2 couches cellulaires individualisées par rupture des contacts cellule/cellule. 2) La gastrulation chez l'amphibien Pendant longtemps, c'est le Triton qui a été utilisé comme modèle d'étude, mais il a été remplacé par le Xénope. Cependant, il existe une différence essentielle entre ces 2 Amphibiens : chez les Triton, le mésoderme en fin de segmentation représente une ceinture équatoriale assez épaisse formée de 2 couches cellulaires (une interne et une externe). Par contre chez le Xénope (que l'on va étudier), si la disposition du mésoderme est sensiblement la même, seules les cellules internes ont une nature mésodermique, alors que les cellules équatoriales externes sont ectodermiques. Cependant, une partie de ces cellules (groupe dit MIZ) va tout de même être engagé dans la gastrulation : elles tapisseront l'archentéron. La gastrulation est plus complexe que ce qu'on pouvait imaginer chez l'oursin, car les cellules du pôle végétatif sont de très grande taille et chargées de vitellus. Elles représentent un obstacle à la gastrulation et le blastopore va se creuser dans la zone sub-équatoriale, là où les cellules animales rencontrent les 1 e cellules végétatives. A ce niveau, on a apparition de cellules en bouteille : ce sont des cellules qui ont subi une constriction apicale, par modification du cytosquelette. Cela a pour conséquence de tirer les cellules plus animales vers le pôle végétatif, et c'est ainsi que se creuse le blastopore. 13

14 Les cellules vont alors progressivement rentrer dans l'embryon, et le mésoderme qui se trouve déjà à l'intérieur va tirer l'ectoderme externe. On peut observer une épibolie au niveau de l'ectoderme animal, alors que l'on a formation d'un archentéron, qui remplace au fur et à mesure le blastocœle. Grâce à une involution (elle prend le relais de l'invagination), le mésoderme pré-chordal va migrer jusqu'à la tête, et les cellules en bouteille qui ont initié la gastrulation jusqu'au pharynx. L'archentéron a tendance à s'allonger, et les cellules qui pénètrent petit à petit dans l'embryon contribuent à élargir le blastopore. A un moment donné, on a même formation d'une lèvre ventrale du blastopore, mais les mouvements y seront beaucoup plus restreints. Cependant, cela permet aux cellules les plus riches en vitellus de pénétrer également à l'intérieur de l'embryon, mais elles n'auront ensuite qu'un rôle nutritif, puisqu'elles seront digérées. Elles joueront tout de même un rôle important de signalisation dans les stades précoces du développement A part ces cellules particulières, toutes les cellules de la blastula contribueront à la formation de l'embryon, puisqu'on n'a pas d'annexes embryonnaires. Au cours de la gastrulation, l'embryon va subir une rotation de 90 et il va légèrement s'allonger : c'est alors que l'on peut reconnaître les principaux axes. 14

15 Finalement, au début de la gastrulation, on peut repérer plusieurs zones dans la blastula : certaines cellules ne migrent ainsi pas à l'intérieur, et subissent uniquement des mouvements d'épibolie. Au fur et à mesure que la gastrulation avance, on a formation de cellules en bouteille côté ventral, ce qui permet de créer un blastopore plus large, renfermant au centre le bouchon vitellin, formé par des cellules très riches en vitellus. De plus, on peut voit que toutes les cellules migrent sous forme de couche : elles ne se dissocient pas, et les liens cellule/cellule sont maintenues tout au long du processus. 15

16 Les modèles Amphibiens se prêtent bien aux expériences et on a essayer de mettre en évidence les principaux mécanismes de la gastrulation. Les cellules en bouteille semblent essentielles pour initier la gastrulation, mais à un stade plus avancé, leur absence ne constitue plus un obstacle à la gastrulation. Par contre, on a pu constater que la fibronectine avait un rôle essentiel : elles permet en effet la migration des cellules sur le toit du blastocœle par le phénomène d'involution. Ainsi, si on injecte des anticorps anti-fibronectine, on ne bloque pas totalement la gastrulation, mas elle est fortement altérée (cf TD 1 reproduction). On a même pu montrer qu'à la surface du blastopore, les molécules de fibronectine se disposent en fibrilles, orientées dans le sens de la migration. Lors de la gastrulation, on a également pu mettre en évidence des phénomènes d'intercalation cellulaire : dans le sens radial, cela permet à des cellules profondes de remonter vers la surface; dans le sens longitudinal, cela provoque un élargissement, et notamment dans la partie antérieure. 3) La gastrulation chez le Poulet Chez le Poulet, la gastrulation est difficile à étudier car elle se déroule peu après la ponte. Du fait de l'organisation de l'œuf, on ne peut pas imaginer d'involution depuis le pôle végétatif : d'ailleurs à ce stade on ne parle pas de pôle végétatif ou animal, puisqu'on n'a qu'une couche monocellulaire au-dessus d'une cavité sous-germinative. 16

17 A partir de cette unique couche appelée épiblaste, on va avoir formation d'une 2 e couche, et notamment grâce à des cellules de la future zone postérieure : cela se comprend puisqu'on a vu que la prolifération y était plus intense, et cette zone est donc un peu plus épaisse. Elle correspond à ce qu'on appelle l'aire opaque, et la population de cellules qui en est issue va peu à peu créer l'hypoblaste. La formation de cet hypoblaste se fait en 2 temps : tout d'abord, certaines cellules de l'épiblaste vont perdre leurs contacts. Elles deviennent alors plus arrondies et forment de petits agrégats dans la cavité sous-germinale : c'est l'hypoblaste primaire. Ces différents amas seront ensuite réunis par les cellules qui se développent depuis la zone marginale postérieure, formant l'hypoblaste secondaire. Ces 2 populations ensemble formeront l'hypoblaste, qui délimite alors avec l'épiblaste un blastocœle. Finalement, on obtient un pseudo-embryon ovale formé uniquement par l'hypoblaste et l'épiblaste, que l'on peut comparer à la blastula d'oursin. Cependant, l'hypoblaste ne participe absolument pas à la formation de l'embryon, et les territoires présomptifs que l'on pourrait décrire n'intéressent que l'épiblaste. C'est la zone marginale postérieure qui est le point de départ de la gastrulation au sens strict : on l'appelle aussi croissant de Köller, et son absence n'empêche pas la gastrulation (le point de départ se situera simplement ailleurs). On assiste à une mise en mouvement de cellules antérieures vers ce croissant de Köller, puis de nouveau vers le pôle antérieur. Grâce à ces phénomènes, on a formation de 2 petits monticules délimitant au centre une petite dépression : c'est la ligne primitive. Lorsque cette ligne arrive à peu près au milieu du blastodisque, on voit que la partie antérieure s'épaissit : c'est le futur nœud de Hensen, qui est l'équivalent de la lèvre du blastopore des Amphibiens. A 24h, l'extension de la ligne primitive vers le pôle antérieur est maximale, mais pendant les 2 jours suivants, elle va régresser. Lors de cette régression, on assiste à la mise en place de structures de type somite, repli céphalique vers le pôle antérieur. Ces différentes formations ont pu se développer car pendant l'extension de la ligne primitive, on a eu des mouvements cellulaires actifs. En effet, l'épiblaste va progressivement passer par la ligne primitive et rejoindre l'hypoblaste, progressivement rejeté vers la périphérie du blastodisque. Dès que les cellules épiblastique ont passé la ligne, elles se dissocient et se différencient en cellule du mésoderme et de l'endoderme, mais on ne connaît pas encore le déterminisme de ces différenciations. On a simplement pu montrer que les 1 e 17

18 cellules qui passent par la ligne primitive sont des cellules endodermiques, et que le mésoderme se forme dans un 2 e temps. A la fin de la gastrulation, toutes les cellules en surface font partie de l'ectoderme, alors que toutes les cellules qui ont involué font partie du mésoderme et de l'endoderme. Les mouvements d'involution se font toujours de manière perpen,diculaire à l'axe de la ligne primitive, sauf pour les cellules qui ont involué au niveau du nœud de Hensen. En effet, ces cellules ont migré vers le pôle antérieur, et elles donneront le mésoderme de la tête. Toutes les involutions se font tant lors de l'extension que lors de la régression de la ligne primitive : on comprend donc bien que les structures antérieures soient celles qui apparaissent en 1 e. Cela explique également que la zone antérieure subisse la neurulation alors que la zone postérieure soit encore dans une phase de gastrulation. détail Finalement, on voit bien que le Poulet est un modèle assez complexe, et notamment du fait de la dissociation des cellules. Ce phénomène est d'ailleurs dû au "scatter factor", qui est une cytokine favorisant également la prolifération des hépatocytes. Chez le Poulet, on connaît très peu les mécanismes de migration cellulaire, et les modes de différenciation sont encore inconnus 18

19 4) La gastrulation chez les Mammifères a) Chez l'homme A partir de la masse interne (= bouton embryonnaire), on assiste à la ségrégation de 2 couches de cellules, tout comme chez le Poulet. On a ainsi formation d'un épiblaste et d'un hypoblaste, qui ne participera pas à la formation de l'embryon. L'épiblaste forme un blastodisque plat, et la gastrulation va se faire comme si on avait du vitellus sous l'hypoblaste : elle est très comparable à celle du Poulet. La gastrulation va commencer dans la zone postérieure, mais on ne sait pas encore comment cette zone est déterminée, puisque apparemment rien ne la différencie du reste La ligne primitive va alors se former vers la partie antérieure et le nœud de Hensen est formé par un épaississement de la ligne primitive lorsque cette dernière a progressé de moitié. Les cellules de l'épiblaste vont alors involuer soit vers les côtés soit vers le pôle antérieur : elles constitueront le futur mésoderme et endoderme, et elles repoussent dans tous les cas les cellules de l'hypoblaste vers la périphérie. b) Chez la souris Chez la souris, le blastodisque forme par l'épiblaste n'est plus du tout plat : il se replie en forme de coupe, avec l'hypoblaste à l'extérieur (on l'appelle alors endoderme viscéral). Avant que la gastrulation commence, on peut observer un mouvement des cellules de l'endoderme viscéral distal : elles vont migrer, s'étaler vers la futures partie antérieure de la souris. Elles envoient alors des signaux vers l'épiblaste, et ce dernier deviendra en réponse la tête. 19

20 Après cela, on a formation d'un sillon perpendiculaire au grand axe de l'embryon : c'est la ligne primitive. L'involution va alors faire "sortir" les futures cellules de l'endoderme et du mésoderme vers l'extérieur de la coupe : elles vont progressivement déplacer les cellules de l'hypoblaste, qui sont rejetées vers la périphérie. Cette ligne primitive va s'étendre d'abord vers le pôle distal de l'embryon, puis remonter vers l'autre face de l'embryon, et donc vers la zone antérieure. En réalité, tout se passe globalement comme chez le Poulet, mais il faut raisonner dans l'espace puisque le blastodisque est replié (on a étudié le poulet en vue de dessus : il faut alors l'imaginer de profil et le replier). IV) Les mécanismes moléculaires de la mise en place des axes 1) La mise en place de l'axe dorso-ventral a) L'organisateur de la blastula : le centre de Nieuwkoop On a vu que chez l'amphibien, la gastrulation commence dans la zone dorsale, qui est déterminée à l'opposé du point d'entrée du spermatozoïde. On va essayer de comprendre quels sont les mécanismes moléculaires qui permettent d'expliquer la liaison entre la fécondation et la gastrulation. A priori, dans une coupe de blastula, rien ne permet de différencier la face dorsale de la face ventrale. En réalité, on a déjà des différences et notamment au niveau moléculaire, ce qui permettra ensuite de différencier des structures typiques de l'une ou l'autre face. 20

21 On a pu mettre en évidence un organisateur de la blastula, et notamment grâce aux expériences de Nieuwkoop. Il a prélevé un blastomère dorsal et l'a ensuite transplanté sur la face ventrale d'une autre blastula : il a alors obtenu 2 embryons siamois. C'est donc que dans le blastomère transplanté on trouvait tout ce qui est nécessaire pour organiser un embryon. On peut retrouver le même résultat sur on injecte le cytoplasme d'un blastomère dorsal dans un blastomère ventral. On alors supposé qu'il existe des molécules cytoplasmiques capables de provoquer les mêmes conséquences qu'une cellule entière, et ce même si on les injecte à l'état purifié. b) L'organisateur de la gastrula : l'organisateur de Spemann L'activité organisatrice du centre du Nieuwkoop persiste jusqu'au stade gastrula : en effet, si on greffe une lèvre dorsale de blastopore côté ventral, on peut également obtenir 2 embryons siamois (expérience de Spemann et Mangold). C'est ainsi que l'on a mis en évidence le centre organisateur de la gastrula, ou centre de Spemann. On est capable de repérer le lèvre dorsale et les cellules qui en découlent par utilisation de colorants (ou bien de cellules d'une autre espèce, qui ont naturellement une coloration différente). Ainsi, une partie de la corde et des somites présentent la coloration de la lèvre dorsale greffée: c'est donc que le greffon a participé à la formation de l'embryon, et qu'il a pu recruter des cellules ventrales, initialement à destinée ectodermique, sanguine ou mésonéphros pour les convertir en cellules dorsales. C'est ainsi le cas des cellules du nouveau tube neural, qui a été obtenu à partir de cellules épidermiques 21

22 Ce centre organisateur de Spemann n'est pas identique chez les différents Vertébrés : ainsi c'est la lèvre dorsale du blastopore chez les Amphibiens, le nœud de Hensen chez les Oiseaux et les Mammifères (et si on greffe un nœud de Hensen sur l'épiblaste, on obtient des siamois). Chez les Poissons, il correspond à la zone d'initiation de la gastrulation, au niveau du bouclier (= shield = écusson). Les transplantations inter-espèces sont tout à fait possibles : ainsi le nœud de Hensen d'un embryon de caille peut reconstituer un embryon siamois de poulet, et le nœud de la Caille ne contribue que très peu à la formation du 2 e embryon On a même pu faire des transplantations entre une grenouille et un poulet, ce qui prouve que les molécules impliquées doivent être relativement conservées. c) L'induction de l'organisateur de Spemann Les 2 centres organisateurs que l'on vient de voir ont la même conséquence s'ils sont transplantés en face ventrale soit d'une blastula, soit d'une gastrula. On peut donc supposer qu'il existe un lien entre les 2, et on a pensé que le centre de Nieuwkoop induirait l'organisateur de Spemann. Ce dernier permettrait ensuite l'organisation de l'embryon par une action dorsalisante Ces 2 structures sont tout de même différentes, et c'est pour cela qu'on ne peut les considérer comme une seule et même structure. En effet, le centre de Nieuwkoop est actif dans les stades très précoces, quand le génome zygotique ne s'exprime pas encore. Les molécules qui s'expriment donc sont d'origine maternelle : ce sont soit directement des protéines, soit des ARNm. A l'opposé, l'organisateur de Spemann engage des molécules zygotiques puisqu'il intervient bien après la transition blastuléenne. De plus, le blastomère transplanté est riche en vitellus et il ne participe pars à la formation de l'embryon siamois : il est en fait digéré dans les phases plus tardives de l'embryogenèse et a un rôle nutritif. A l'opposé, on a vu que l'organisateur de Spemann participe à la formation de 2 e embryon, au niveau de la corde et des somites. Les molécules engagées ne sont donc pas les mêmes et tout cela nous pousse à penser que les 2 centres organisateurs ne sont pas 2 stades d'une même structure. Ce serait une séquence d'évènements qui permettrait au centre de Nieuwkoop d'induire la formation de l'organisateur de Spemann, par émission d'un ensemble de signaux. Un gradient d'inducteur du mésoderme? Dans une blastula d'amphibien, le mésoderme se retrouve dans une ceinture équatoriale, et parmi cette population de cellules, ce sont les plus dorsales (c'est le chordo-mésoderme) qui constituent l'organisateur de Spemann. L'induction de cet organisateur par le centre de Nieuwkoop serait donc le 1 e stade de l'induction du mésoderme. 22

23 Dans des stades précoces du développement, on ne peut pas retrouver de cellules mésodermiques : aucune cellule n'exprime en effet les facteurs caractéristiques, comme par exemple la myosine ou l'actine. Cependant, à un moment donné, ces facteurs s'expriment : est-ce que ce phénomène est dû à une induction ou à un programme génétique prédéterminé? Pour prouver que c'est une induction, on a mis en présence une calotte animale (futures cellules ectodermiques) et une calotte végétative ( futures cellules endodermiques) : on a alors apparition de cellules mésodermiques exprimant spécifiquement les molécules du mésoderme. C'est donc que l'on a bien eu une induction (c'est la 1 e dans l'embryon), et les signaux émaneraient de la calotte végétative. Nieuwkoop a beaucoup étudié ces signaux, et il pensait qu'un seul et même signal ne pouvait expliquer la formation de tous les mésodermes différents. C'est pourquoi il a proposé un modèle avec plusieurs signaux : l'un induirait le mésoderme ventro-latéral, l'autre le mésoderme dorsal () organisateur de Spemann) c'est le modèle à 3 signaux. On parle de 2 signaux car dans un 2 e temps, on aurait émission d'un signal depuis l'organisateur de Spemann vers le mésoderme intermédiaire, pour le rendre un peu plus dorsal Pour mieux comprendre la nature des signaux qui émanent de la calotte végétative, Nieuwkoop a réalisé une série d'expériences : il a greffé une calotte animale sur un blastomère différent de la calotte végétative, et il a ensuite analyser la nature des cellules au pôle animal. C'est ainsi qu'il a remarqué que seul le blastomère le plus dorsal pouvait induire la formation de mésoderme dorsal : c'est donc bien que l'on a des signaux différents selon la zone du pôle végétatif considérée. A partir de la fin des années 70, on a essayer d'éprouver les molécules que l'on pensait engagées dans l'induction du mésoderme. On va pour cela injecter l'arnm de ces molécules au stade 32 cellules et on regarde si on retrouve l'effet de l'organisateur lui-même. Ainsi, on a découvert que certaines molécules assuraient la duplication totale ou partielle de l'axe dorso-ventral. 23

24 Une autre méthode consiste à empêcher le développement de l'axe DV normal : on focalise des UV sur un œuf d'amphibien, ce qui empêche la rotation de 30 du cytoplasme (on a détruit les microtubules par les UV). L'embryon se développe alors comme un sac "ventralisé" car on n'a pas accumulation de déterminants dorsaux : c'est un embryon composé uniquement de mésenchyme. On va alors rechercher quel type de molécule peut rétablir un axe DV. Si on trempe un embryon dans un bain de lithium concentré, alors l'embryon est totalement dorsalisé, et on pourra essayer de rétablir l'organisation normale de l'embryon et connaître ainsi les molécules ventralisantes. Dans les 2 cas, le seul problème est qu'on ne sait pas si les molécules obtenues font partie du 1 e signal inducteur ou bien si ce sont les résultats de cette 1 e induction. En effet, on arrive toujours au même résultat, mais cela peut tout de même donner des pistes. Il existe une 2 e grande méthode d'étude : on prélève une calotte animale et on l'incube en présence d'une protéine que l'on veut tester. On compare alors le résultat avec le témoin, cad une calotte animale cultivée seule : elle donne systématiquement de l'épiderme, et c'est pourquoi on pensait que le devenir normal du pôle animal était de l'épiderme. Le pendant de cette expérience consiste à injecter un ARNm dans le pôle animal de l'œuf : il sera surtout concentré dans la calotte animale de la blastula. En général, cet ARNm code pour une protéine qui n'est habituellement pas exprimée dans cette partie de l'embryon. Rôle des molécules de la famille TGFβ Grâce aux expériences précédentes, on a pensé que les molécules de la famille TGFβ étaient fortement engagées dans l'induction du mésoderme. Dans cette famille, on retrouve un très grand 24

25 nombre de molécules : c'est par exemple le cas des activines (sous forme de dimère), de nodal, de Vg1 et des molécules de la sous-famille des BMP (Bone morphogenetic protein). Par exemple, l'activine et Vg1 sont capables de donner du mésoderme dorsal ou ventral selon leur concentration quand on les injecte à des stades précoces du développement embryonnaire. De plus, on a pu connaître le devenir des cellules animales par l'analyse quelques heures après l'injection grâce à l'étude de l'expression de certains gènes caractéristiques. Ainsi, le gène goosecoïd gsc s'exprime exclusivement au niveau de l'organisateur Spemann, que ce soit chez les amphibiens, les Oiseaux ou les Mammifères. Cela permet d'éviter de tester fonctionnellement le mésoderme afin de vérifier ses capacités organisatrices. On voit que le devenir du mésoderme est différent selon la concentration de l'activine et Vg1 (à faible concentration, on obtient du mésoderme dorsal), on a supposé que l'activine était un morphogène. Cela suggère donc que l'on peut avoir simplement un gradient de molécules au sein de la blastula, et qui expliquerait l'induction. En réalité, Vg1 est réparti de manière uniforme dans la calotte végétative de l'embryon (on a fait des test par hybridation in situ), de même que l'activine. C'est donc que ces 2 molécules ne sont pas des morphogènes. Ces molécules agissent, elles existent bien in vivo, mais elles sont présentes de manière symétrique et ne peuvent expliquer à elles seules l'induction de l'organisateur. Vg1 et activine sont des ligands solubles qu peuvent diffuser vers leurs récepteurs, et la formation de ce complexe permet la déclenchement d'une voie de transduction. Les récepteurs sont de nature sérine-thréonine kinase : la fixation du ligand entraîne leur dimérisation, puis la voie de 25

26 transduction qui est déclenchée assure à terme l'expression de gènes caractéristiques du mésoderme. Si on fait exprimer aux cellules de la calotte animale des récepteurs mutés (le domaine intracellulaire est ronqué), alors la fixation du ligand n'entraîne aucun signal et on n'aura aucune expression génique spécifique. Ce type d'expérience utilise des formes dominantes négatives : même;si les protéines fonctionnelles sont présentes dans la cellules, leur action est toujours cachée par l'action des protéines mutées. On injecte donc de l'arnm codant pour la forme tronquée du récepteur au stade 2 cellules : il sera exprimé essentiellement sur la calotte animale. On va regarder si le développements est normal lorsque la voie de transduction normalement lancée par l'activine et Vg1 est bloquée. On voit alors que l'embryon est ventralisé : c'est donc bien que ces 2 molécules sont impliquées dans la mise en place de l'axe DV. On pense que Vg1 est une molécule d'origine maternelle qui a un rôle essentiel dans la mise en place de cet axe, et elle constituerait le signal 1 ou 2 du modèle à 3 signaux de Nieuwkoop. Le rôle des molécules de la voie Wnt On a vu que lorsque l'on bloque la rotation corticale de l'œuf après la pénétration du spermatozoïde, on entraîne la formation d'un embryon ventralisé. Or, les UV ne modifient pas l'organisation des molécules comme Vg1, donc c'est que d'autres types de molécules interviennent. Ainsi, la molécule Wnt, apparentée à Wingless de la drosophile, a été largement étudiée. Le problème est que l'on n'a pas encore réussi à la purifier, donc on doit toujours travailler sur à partir de l'arnm. La molécule Wnt est un proto-oncogène dérivé de la protéine viral Int 26

27 Wnt possède un récepteur appelé frizzled, et la voie de transduction qui est déclenchée par la fixation de Wnt fait intervenir la β-caténine. En temps normal, la β-caténine est reliée à de nombreuses molécules : la GSK 3 (Glycogène synthase kinase) qui vient phosphoryler la β-caténine, l'axine, l'apc Lorsque Wnt se fixe sur son récepteur, GSK3 est inhibée, mais on ne sait pas encore comment : on pense que la protéine Dsh (disshevelled) intervient. Grâce à cela, la β-caténine est libérée et peut alors entraîner l'expression de certains gènes. N'importe lequel de ces acteurs peut provoquer la duplication parfaite des axes si on les injecte sous forme d'arnm ou de protéines côté ventral. De la même manière, si on ajoute des formes dominantes négatives de ces molécules, on peut bloquer la formation de l'axe DV normal : c'est donc que cette voie de transduction est engagée dans l'induction du mésoderme. Cependant, si on injecte côté dorsal un dominant négatif de Wnt, cela n'empêche pas la formation d'un embryon avec un axe DV normal. On obtient le même résultat avec une forme dominante négative de Dsh, mais le résultat contraire pour GSK 3. C'est donc bien que la voie de transduction de Wnt est déclenchée, mais pas par son ligand naturel On a alors tenté d'expliquer ces données. Suite à la rotation corticale, un facteur à activité dorsalisante passe côté dorsal et inhibe GSK3 : cela permet de stabiliser l'activité de la β-caténine. On ne connaît pas encore la nature de ce facteur dorsalisant, mais c'est sûrement lui que l'on a mis en évidence dans les expériences où on bloquait la rotation corticale par les UV 27

28 On a alors pu établir un nouveau modèle : Vg1 est réparti de manière homogène, alors que la β-caténine se trouve dans les noyaux des blastomères les plus dorsaux. C'est cette combinaison qui permet de distinguer une zone dorsale et végétative qui serait le centre de Nieuwkoop, alors que les cellules au-dessus seraient l'organisateur de Spemann. Il existe cependant un autre acteur, le Xnr (Xenopus nodal related) : c'est une protéine zygotique et on a constaté que l'injection d'un inhibiteur de nodal dans un embryon empêche l'induction de l'organisateur. En plus, on a montré in vitro que la présence de la β-caténine et de Vg1 dans des blastomères entraîne l'expression de Xnr En fait, la combinaison de la β-caténine et de Vg1 dans le domaine dorsal permet une expression plus importante de nodal que dans les domaines ventraux et intermédiaire. Ce serait ensuite nodal qui serait à l'origine de l'induction de l'organisateur. On retrouve le modèle à 3 signaux de Nieuwkoop, mais il a été complété. A l'opposé, la protéine BMP4 est répartie de manière homogène dans tout l'embryon, sauf au niveau de l'organisateur : elle permettrait l'induction du mésoderme ventral Pour résumer, on a 3 types d'interactions qui se produisent : - la présence de Vg1 et de la β-caténine entraîne une expression importante de Xnr, ce qui assure la différenciation de l'organisateur - la présence de Vg1 seul entraîne une expression faible de Xnr, ce qui provoque la différenciation du mésoderme latéral - la présence de BMP4 entraîne la différenciation du mésoderme ventral. d) Les molécules impliquées dans l'activité de l'organisateur de Spemann L'activité de l'organisateur de Spemann est principalement due à chordine (équivalent de sog chez la drosophile) et noggine, qui inhibent la protéine BMP4. On a vu dans les expériences de Spemann et Mangold que l'organisateur greffé de manière ectopique a une fonction dorsalisante : il 28

29 transforme le devenir des tissus a priori ventraux (l'ectoderme épidermique est transformé en neurectoderme, le mésoderme latéral en corde). L'organisateur doit certainement synthétiser des molécules très particulières : c'est par exemple le cas de goosecoïd, qui est un facteur de transcription. La synthèse de gsc entraînerait l'expression de facteurs diffusibles responsables de la dorsalisation. C'est par exemple le cas de noggine et de chordine, qui sont induites à la suite de la signalisation de type Wnt, et quoi sont donc des produits du génome zygotique. Dès que la gastrulation commence, la lèvre dorsale du blastopore exprime la chordine. Quand la gastrulation est étendue, le domaine d'expression de la chordine s'étend, et à la fin, son domaine d'expression concorde parfaitement avec la future plaque neurale. Il faut savoir que le domaine d'expression de noggine est très semblable A priori, ce protéines devraient avoir une fonction dorsalisante : pour montrer cela, on découpe la zone marginale ventrale et on la met en culture en présence de chordine ou de noggine. On s'attend à obtenir du mésoderme intermédiaire et donc du muscle, et c'est effectivement ce qu'on trouve. De la même manière, une calotte animale mise en culture avec les 2 facteurs donne du neurectoderme (alors que la calotte animale seule donne de l'épiderme). C'est donc bien que chordine et noggine sont des facteurs dorsalisants, qui convertissent l'ectoderme et le mésoderme n structures dorsales. On a recherché activement les récepteurs de noggine et chordine, et donc les voies de transduction déclenchées. En effet, on pensait que les signaux émis depuis la lèvre dorsale du blastopore permettaient la différenciation de l'ectoderme en neurectoderme, puisque l'épiblaste donne du neurectoderme côté dorsal : on supposait que la transformation en tissu neural était active. 29