Gestion de la fermentation de grands vins rouges par des levures non-saccharomyces

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1 Gestion de la fermentation de grands vins rouges Management of the fermentation of high quality wines using non-saccharomyces yeasts 25 résumé La fermentation alcoolique (FA) est une étape essentielle de la vinification durant laquelle, sous l action des levures et du vinificateur, le moût de raisin devient le vin. Lors de l élaboration de grands vins rouges, bien au-delà de la simple transformation des sucres en éthanol, la FA constitue la principale phase d extraction des composés qualitatifs du raisin et la première étape de maîtrise des flores microbiennes d altération. Ces phénomènes sont bien plus complexes qu ils n y paraissent. Les levures «positives» doivent rapidement prendre le dessus sur les germes d altération, sans toutefois provoquer un départ trop explosif de la fermentation qui serait néfaste aux travaux d extraction du vinificateur. Les récentes études d écologie microbienne et la compréhension des interactions entre les levures permettent désormais de piloter l enclenchement de la FA également par l usage adapté de levures Torulaspora delbrueckii. En inoculant le moût à l encuvage avec Torulaspora le milieu est rapidement colonisé et la cinétique d enclenchement de la FA est «naturellement» ralentie. Mots clés Fermentation alcoolique, vinification en rouge, torulaspora delbrueckii, qualité des vins, brettanomyces. abstract Alcoholic fermentation (AF) is an essential step of the winemaking, during under yeasts and winemakers actions, the grape must is becoming the wine. During the red wines elaboration, beyond the simple conversion of sugars into ethanol, the AF is also an essential phase for the extraction of the grape compounds and also the first step to control the microbial germs of alterations. These phenomena are much more complex than it seems appear. «Positive» yeasts should quickly take over the alteration germs without causing an explosive start of the fermentation which would be detrimental to the work of extracting the winemaker. Recent studies of the wine microbial ecosystem and the understanding of the interactions between the different yeasts allow controlling the engagement of the AF by the use of the specie Torulaspora delbrueckii. By inoculating the must with an appropriate strain of Torulaspora delbrueckii the medium is rapidly colonized and the kinetic engagement of AF is «naturally» slowed down. Vincent RENOUF LAFFORT - CS Bordeaux cedex vincent.renouf@laffort.com Keywords Alcoholic fermentation, red wine elaboration, torulaspora delbrueckii, wines qualities, brettanomyces. Vincent RENOUF

2 Gestion de la fermentation de grands vins rouges 26 L ors de l élaboration de grands vins rouges, la fermentation alcoolique (FA) est une étape importante. Toutefois la réelle contribution aromatique des levures de la FA sur les qualités finales des vins rouges élaborés en phase solide est nettement moins probante que pour les vins élaborés en phase liquide (vins blancs, rosés et certains vins rouges issus de thermovinification par exemple). En phase solide, la FA est essentielle à d autres égards. Au travers de l activité des levures, le milieu aqueux que constitue le jus de raisin va devenir un milieu alcoolique, le vin, ce qui va profondément influencer les phénomènes d extraction et de diffusion des composés de la Laffort partie solide (le raisin) dans le liquide (le jus en fermentation) et au final, les qualités gustatives et chromatiques des vins. Idéalement la cinétique du premier tiers de la FA doit être relativement lente. Ceci laisse le temps au vinificateur de réaliser les opérations d extraction adéquates et d optimiser ainsi les potentiels des raisins, tout en assurant une protection du milieu visà-vis des risques d altération microbienne, car si les levures fermentaires tardent à s activer, d autres germes peuvent en profiter (Brettanomyces et/ou bactéries lactiques d altération) pour impacter négativement les qualités finales (acidité volatile, phénols volatils ). Un dernier

3 27 point à prendre à considération est qu à la fin de la FA, le processus fermentaire n est pas encore terminé pour les vins rouges car la FML doit également se réaliser. Là aussi la FA peut influencer la fermentescibilité malolactique à venir car suivant les métabolismes des levures qui ont réalisé la FA, la FML sera plus ou moins facile à s enclencher. Pour résumer, en mettant de côté les impacts aromatiques des levures de la FA qui sont encore sujets à controverse ou pas encore véritablement démontrés, lors de l élaboration de grands vins rouges en phase solide, la FA doit être marquée par un départ non explosif. Elle doit également être sécuritaire vis-à-vis des germes d altérations, assurer une faible production d acidité volatile (afin d encaisser l inéluctable hausse d AV qui aura lieu lors des élevages relativement longs auxquels ces vins sont destinés) et assurer une bonne fermentescibilité malolactique. Pour arriver à ces objectifs, les études d écologie microbienne (Renouf 2006, Zott 2009, Renault 2010) et la compréhension des interactions entre les différentes espèces de levures du moût de raisin permettent d envisager une piste de travail intéressante. Sans ajout de levain, les levures Saccharomyces indigènes ne sont jamais seules en début de vinification, elles cohabitent toujours avec des non- Saccharomyces, qui sont plus nombreuses et plus promptes à entrer en action dans le moût fraîchement foulé pour démarrer elles-mêmes la fermentation. Parmi ces levures, certaines souches appartiennent à l espèce Torulaspora delbrueckii. Cette espèce présente notamment l aptitude à résister à des chocs osmotiques importants (tel que celui encaissé par les levures présentes à la surface de baies de raisin au vignoble qui, après foulage, sont projetées dans un milieu très riche en solutés et notamment en sucres). Elle a, initialement, été étudiée par les microbiologistes du vin pour tenter de limiter la production d acidité volatile dans les vins liquoreux ou moelleux. Mais outre cette aptitude à produire peu d acidité volatile en réponse à un choc osmotique intense en début de vinification, Torulaspora présente la particularité de fermenter lentement. 24 ou 48 h après inoculation, la perception du pétillement en dégustation avec Torulaspora est très faible Protocole cuve SO 2 ajouté à la vendange 3 g/hl Ajout d une LSA Saccharomyces «classique» dès l encuvage : l Actiflore F33* (LAFFORT) à 20 g/hl. La LSA est préparée en présence d un préparateur, le Superstart (LAFFORT) à 20 g/hl. Pour la nutrition azotée, Thiazote (LAFFORT) a été ajouté à 10 g/hl à l encuvage puis le troisième jour de fermentation 20 g/hl Nutristart OrganiQ ont été ajoutés. et ressemble plus à du «perlé» qu à un véritable dégagement de CO 2 inhérent à une activité de FA, qui pourrait être celle de n importe quelle Saccharomyces par exemple. L usage de Torulaspora delbrueckii lors de la l élaboration de vins rouges pourrait donc avoir pour objectif de démarrer la FA avec une faible cinétique, tout en respectant les autres critères listés précédemment, et notamment l imposition d une flore majoritaire (ici celle de Torulaspora) qui contrôlerait les populations d altération (Brettanomyces). Ce travail décrit donc comment avec une souche de Torulaspora delbrueckii adaptée, et convenablement associée (stade, dose et mode de préparation) à une LSA Saccharomyces «classique», il est possible de disposer d un outil biotechnologique pour ralentir à des fins qualitatives l enclenchement de la FA, tout en assurant une protection microbienne, une faible production d AV et une bonne fermentescibilité malolactique. Matériel et méthodes Protocole cuve essai SO 2 ajouté à la vendange 3 g/hl Ajout de la Zymaflore TD Alpha (souche sélectionnée de Torulaspora delbrueckii, LAFFORT) à 30 g/hl dès l encuvage avec ajout de Thiazote (LAFFORT) à 10 g/hl. Deux jours après, une LSA Saccharomyces «classique» est ajoutée : Zymaflore RB2* (LAFFORT) à 20 g/hl après avoir été préparée avec du Superstart (20 g/hl, LAFFORT). Le troisième jour de fermentation du Nutristart OrganiQ est ajouté à 20 g/hl. NB : L Actiflore F33 a été retenue dans la modalité bien que la Zymaflore RB2 d ordinaire soit utilisée par le domaine où l essai a été mené, car l Actiflore 33 est une référence en termes de faible production d acidité volatile, de bonne fermentescibilité malolactique et de protection vis-à-vis de Brettanomyces. L objectif est de comparer la synergie de la Zymaflore TD Alpha et Zymaflore RB2 face à une modalité optimale sur ces critères. tableau 1 Protocole d essai. Principales caractéristiques physicochimiques du moût de merlot étudié. tableau 2 Paramètre TAVP Lors des millésimes 2011 et 2012 de nombreux essais de co-levurage Torulaspora delbrueckii / Valeur 14,4 % vol. ph 3,62 Acide-L-malique Azote assimilable 1,4 g/l 114 mg/l

4 Gestion de la fermentation de grands vins rouges 28 densité figure 1 acidité volatile (g/l d H 2 SO 4 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 figure figure 3 essai nombre de jours modalité modalité essai Différence de suivi de densité entre les modalités et l essai. fin de FA fin de FML 2 mois après la fin de la FML volume en bouche astringence Différences d acidité volatile entre les deux modalités. essai Résultats de dégustation sur les critères gustatifs de volume en bouche et d astringence. 27 dégustateurs ont noté ces critères de 0 à 5 (5 le plus de volume et le plus d astringence). Saccharomyces cerevisiae ont été réalisés lors de l élaboration de vins rouges. Ces essais consistaient à inoculer le moût à l encuvage avec une préparation commerciale d une souche sélectionnée de Torulaspora delbrueckii, la Zymaflore TD Alpha (LAFFORT) à 30 g/hl puis 24 à 48 h après, d ajouter une LSA Saccharomyces «classique» à 20 g/hl. L essai détaillé ici illustre les phénomènes observés dans la plupart des cas. Il permet de préciser les intérêts de la technique. Cet essai a été mené sur un lot de merlot lors du millésime 2012 dans un domaine réputé du vignoble Bordelais. Les protocoles de travail sont listés dans le tableau 1 et les caractéristiques du moût dans le tableau 2. Dans les deux modalités, la consigne de température a été maintenue entre 20 C (au démarrage) et 28 C (en fin de FA). Les mêmes travaux de remontage, délestage et d arrosage des marcs ont été appliqués dans les deux cas. La durée totale de cuvaison a également été identique (16 jours dans les deux cas). Le suivi de la cinétique fermentaire est réalisé par un contrôle quotidien des densités. Les dynamiques microbiennes sont suivies par PCR quantitatives. Une PCR quantitative levures totales est réalisée pour estimer la population de levures constituées par toutes les espèces présentes. Une PCR quantitative spécifique de l espèce Torulaspora delbrueckii est également réalisée ainsi qu une PCR quantitative spécifique de l espèce Brettanomyces bruxellensis. Ces points PCR sont réalisés quotidiennement durant la première moitié de la FA, puis à mi-fa, en fin FA et en fin de FML (dernière analyse 2 mois après le sulfitage post-fml). Le contrôle d implantation des LSA est réalisé classiquement par PCR delta (Lonvaud et al. 2010) sur colonies à mi-fa. Pour s assurer de l implantation de la Zymaflore TD Alpha, il ne s agit pas de vérifier l identité génétique de la souche majoritaire de Torulaspora mais de déduire par soustraction la population de Zymaflore TD Alpha en comparant la population de Torulaspora indigènes présente dans la modalité à la population de Torulaspora présente dans la modalité d essai et qui est, elle, consti-

5 29 tuée de Zymaflore TD Alpha et de souches indigènes. Les analyses courantes : acidité volatile, acide- L-malique, intensité colorante sont réalisées selon les recommandations OIV. La fermentescibilité malolactique des vins à la fin de la FA est estimée par un dosage de l acide octanoïque et de l acide décanoïque, deux acides gras produits par les levures durant la FA et qui inhibent les bactéries de la FML (Renouf et al. 2010). Le dosage des acides gras est réalisé en fin de FA. Outre l acidité volatile et la population en levures d altération Brettanomyces, les qualités des vins sont évaluées d un point de vue chromatique : mesure des densités optiques et de l intensité colorante, ainsi que détermination de la stabilité de la matière colorante (test de tenue au froid, protocole interne laboratoire SARCO). La teneur en polyphénols est estimée par un dosage des densités optiques à 280 nm (IPT) et à 320 nm. Enfin une mesure d Indice de Protéines Salivaires (SPI, méthode interne laboratoire SARCO) est réalisée sur vin fini (2 mois après la fin de la FML) pour évaluer les différences d astringence (Rinaldi et al. 2011). Des dégustations ont également été réalisées deux mois après la fin de la FML. Durant ces dégustations, un focus particulier a été demandé aux dégustateurs sur les notes gustatives de volume en bouche et d astringence. Résultats et discussion Stade Sortie du fouloir (avant l ajout des LSA) 1 er remontage d homogénéisation, après ajout de la Zymaflore TD Alpha dans la modalité essai et de l Actiflore F33 dans la modalité J+1 J+2 (avant l ajout de la Zymaflore RB2 dans la modalité essai) J+3 (après l ajout de la Zymaflore RB2 dans la modalité essai) Mi-FA Fin de FA Fin de FML 15 jours après la fin de la FML 2 mois après la fin de la FML Population La figure 1 illustre l évolution de la densité dans les deux modalités. Au deuxième jour de fermentation, c est-à-dire avant que ne soit ajoutée la Zymaflore RB2 dans la modalité essai, la différence est frappanvs tendent alors à se rapprocher. Aucune différence significative n est à relever en ce qui concerne la fin de la FA. Les deux modalités atteignent toutes les deux une densité de 992 au 7e jour de fermentation Le tableau 3 présente les suivis des populations microbiennes. La population de levures totales dans le jus à la sortie du fouloir correspond à une population moyenne de levures indigènes (Renouf 2006). Les Torulaspora delbrueckii indigènes représentent environ 2% des levures présentes et les Brettanomyces environ 0,1%. Dès le premier remontage d homogénéisation qui succède à l ajout de la Zymaflore TD Alpha dans la modalité essai et de l Actiflore F33, les différences de populations de levures totales et de Torulaspora delbrueckii deviennent remarquables. La population de levures totales est nettement plus importante dans la modalité et inversement celle de Torulaspora delbrueckii est plus importante dans la modalité essai. Ce dernier point témoigne de l implantation positive de la Zymaflore TD Alpha dans cette modalité. Jusqu à l ajout de la Zymaflore RB2, la population de levures totales dans la modalité a toujours été plus de 10 fois supérieure à la population de levures totales dans la modalité essai (ce Modalité Modalité essai Levures totales E E4 T.delbrueckii E2 6,2.10 E2 B. bruxellensis 4,2.10 E1 3,6.10 E1 Levures totales 4,4.10 E6 4,9.10 E5 T. delbrueckii 9,4.10 E2 4,4.10 E5 B. bruxellensis 5.10 E1 3,7.10 E1 Levures totales 3,2.10 E8 6,4.10 E5 T. delbrueckii 2,2.10 E1 3,9.10 E5 B. bruxellensis 2,2.10 E1 2,5.10 E1 Levures totales 1,2.10 E8 2,1.10 E6 T. delbrueckii Non détecté 9,8.10 E5 B. bruxellensis 1,2.10 E1 1,5.10 E1 Levures totales 5,2.10 E7 4,7.10 E7 T. delbrueckii Non détecté 2,7.10 E5 B. bruxellensis 1,2.10 E1 1,1.10 E1 Levures totales 3,6.10 E6 5,8.10 E6 T. delbrueckii Non détecté 4,3.10 E3 Levures totales 8,4.10 E5 4,4.10 E6 Levures totales 4,4.10 E5 3,4.10 E5 B. bruxellensis 2.10 E E1 tableau 3 Résultats des suivis microbiens réalisés en PCR quantitative. (population en Eq. UFC/mL)

6 Gestion de la fermentation de grands vins rouges 30 Modalité Delta NTU Indice SPI Témoin 136 3,32 ± 0,06 Essai 94 3,14 ± 0,07 tableau 4 Résultat de la mesure de la stabilité de la matière colorante (Delta NTU, plus le Delta NTU plus la matière colorante est instable) et la mesure de l indice SPI 2 mois après la fin des fermentations. Laffort résultat concourt aussi à la différence de cinétique évoquée ci-dessus). L absence de différence significative concerne Brettanomyces. A chaque point de contrôle la population de Brettanomyces de la modalité est semblable à celle de la modalité essai. En début de procédé, la biomasse de Torulaspora delbrueckii dans la cuve essai a donc exercé le même effet protecteur que la biomasse de Sac- charomyces dans la cuve, celle-ci étant pourtant nettement plus élevée. 2 mois après la fin des fermentations, la teneur en 4-éthylphénol + 4-éthylgaïacol était de 48 µg/l dans la modalité essai et de 53 µg/l dans le, traduisant un contrôle parfait de la pression Brettanomyces dans les deux cas. La figure 2 représente l acidité volatile lors des deux suivis : elle ne laisse apparaitre aucune différence significative. Fin de FA, les teneurs en acide octanoïque et en acide décanoïque sont respectivement de 1,2 mg/l et 0,8 mg/l dans la modalité d essai et 1,5 mg/l et 1 mg/l dans la modalité. Cette différence n est pas significative. Dans les deux cas, les valeurs obtenues sont nettement inférieures au seuil d inhibition des bactéries de la FML, estimé à 25 mg/l en somme des deux acides gras, (Renouf et al. 2010). Le déroulement de la FML géré par l ajout d un levain malolactique (Lactoenos B28 PreAc, LAFFORT) a été optimal. La FML s est achevée 14 jours après l ajout du levain dans la modalité essai et après15 jours dans la modalité, ce qui a entretenu une pression efficace contre les Brettanomyces. D un point de vue chromatique, aucune différence significative d intensité des couleurs ne peut être mise en évidence. Par contre la matière colorante semble plus stable dans la modalité essai que (tabl. 4) même si les deltas NTU observés sont dans les deux cas importants, au regard du seuil retenu pour estimer le vin totalement stable (delta NTU < 2). Cet écart laisse toutefois supposer une différence en termes de composés phénoliques extraits dans IFV les deux modalités. L IPT et la DO 320 ne laissant apparaître aucune différence, ce n est peutêtre pas la quantité de polyphénols qui varie mais leurs qualités. L analyse de l indice SPI va dans le sens de cette hypothèse. Cet indice est significativement plus élevé dans la modalité que dans l essai (tabl. 4). Cette différence est confirmée par la dégustation. Sur 27 dégustateurs, 21 ont reconnu l échantillon différent lors du test triangulaire. Les notes moyennes obtenues sur les critères de volume en bouche et d astringence sont nettement en faveur de la modalité d essai (fig. 3).

7 31 Conclusion Les objectifs fixés : départ non-explosif de la FA, faible production d acidité volatile, maîtrise des populations de Brettanomyces, bonne fermentescibilité malolactique ont tous été atteints par l usage de la Zymaflore TD Alpha lors d un premier levurage du moût à l encuvage. La stratégie de colevurage Torulaspora debrueckii / Saccharomyces est donc pertinente afin d allonger la fenêtre d extraction en phase aqueuse, tout en assurant une sécurité fermentaire optimale et une bonne maîtrise des germes d altération. Des premières analyses laissent supposer que cela permet d impacter positivement les qualités finales des vins. Il ne s agirait pas ici d une contribution directe des microorganismes mis en jeu comme cela peut être le cas lorsqu il y a production ou révélation de tel ou tel arôme, mais d une conséquence indirecte de leurs activités et notamment de leurs cinétiques fermentaires. La FA s enclenchant de façon moins explosive, les qualités des molécules extraites du solide vers le liquide, et notamment des polyphénols, seraient différentes, ce qui impacterait certaines données chromatiques (notamment la stabilité de la matière colorante) et gustatives (volume en bouche et rondeur). Des analyses plus fines des composés, préférentiellement selon les deux itinéraires, devront être réalisées pour confirmer ces hypothèses. Remerciements L essai détaillé ici représente un essai parmi de nombreux réalisés ces deux derniers millésimes grâce à l aide de nombreux vinificateurs que l auteur souhaite vivement remercier : Cécile Bernier, Jean-Emmanuel Danjoy, Frédéric Faure, Alexandra Lebossé, Jean-Philippe Masclef, Philippe Nunes, Anthony Yaigre L auteur remercie également Néréa Irtumendi, Stéphane Laguerche Philippe Louazil, Virginie Moine et le laboratoire SARCO pour l aide analytique apportée. Bibliographie Lonvaud A., Renouf V., Strehaiano P La microbiologie du vin, bases fondamentales et applications. Edition Tec & Doc. Lavoisier, Paris. France. Renault P Caractérisation phénotypique de l espèce Torulaspora delbrueckii en conditions œnologiques. Application à la co-inoculation avec l espèce Saccharomyces cerevisaie. Thèse de doctorat. Université Bordeaux 2, France. Renouf V Description et caractérisation de la diversité microbienne durant l élaboration du vin : Interactions et équilibres Relation avec la qualité du Vin. Thèse de doctorat. INP Toulouse. France Renouf V., La Guerche S., Moine V. &Murat M.L., Fermentescibilité malolactique des vins : rôle essentiel des acides octanoïque et décanoïque. Problématique et solution. Rev. Fr. Oenol., 243, Rinaldi A., Gambuti A. & Moio L.,2011. Application of the SPI (Saliva Precipitation Index) to evaluate the effect of fining agents on Agliano (Vitis Vinifera cv.) wine. Actes de colloques du 9e symposium international d Oenologie de Bordeaux. Editions Dunod. Zott K Les levures non-saccharomyces : dynamique, caractérisation et interaction avec Saccharomyces durant les étapes pré-fermentaires et la fermentation alcoolique. Thèse de doctorat. Université Bordeaux 2. France