HEMATOLOGIE TROPICALE PRATIQUE

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1 Prins Leopold Instituut voor Tropische Geneeskunde Institut de Médecine Tropicale Prince Léopold Prince Leopold Institute of Tropical Medicine Instituto de Medicina Tropical Principe Leopoldo Nationalestraat, 155 B 2000 Antwerpen Stichting van Openbaar Nut HEMATOLOGIE TROPICALE PRATIQUE Notions de base Philippe Gillet, Janvier 2006

2 TABLE DES MATIERES TABLE DES MATIERES... 2 PRISE DE SANG :... 2 CAPILLAIRE :... 4 VEINEUX :... 4 DIFFERENCE ENTRE COAGULATION ET SEDIMENTATION :... 5 DOSAGE DE L HEMOGLOBINE... 6 INTRODUCTION :... 6 VALEURS DE REFERENCE :... 7 METHODE HCS (HEMOGLOBINE COLOUR SCALE)... 8 PRINCIPE :... 8 MATERIEL :... 8 PRELEVEMENT :... 8 METHODE :... 8 ENTRETIEN :... 9 METHODE LOVIBOND (méthode simplifiée selon Harrison)... 9 PRINCIPE :... 9 MATERIEL :... 9 PRELEVEMENT : METHODE : PETITS PROBLEMES ET SOLUTIONS : TABLE DE CONVERSION DU % LOVIBOND EN g / 100 ml : METHODE A L HEMATINE ACIDE SELON SAHLI : PRINCIPE : MATERIEL : REACTIFS : PRELEVEMENT : METHODE : METHODE DE DRABKIN (méthode de référence) : PRINCIPE : PRELEVEMENT : REACTIFS : METHODE : HEMOCUE PRINCIPE : MATERIEL : PRELEVEMENT : METHODE : DHT (méthode à l ammoniaque) PRINCIPE : MATERIEL : PRELEVEMENT : REACTIFS : METHODE : Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

3 DETERMINATION DE L HEMATOCRITE (METHODE MICRO, PAR CENTRIFUGATION) PRINCIPE : MATERIEL : PRELEVEMENT : METHODE : REPONSES TYPES : REMARQUES : VALEURS DE REFERENCES : INTERPRETATION DES RESULTATS : INDICES (OU INDEX) : (MCHC) SOURCES D'ERREURS : ASSURANCE QUALITE : NUMERATION DES GLOBULES EN CELLULE DE NUMERATION PRINCIPE GENERAL : MATERIEL GENERAL : LES CELLULES DE NUMERATION : NUMERATION DES GLOBULES BLANCS DANS LE SANG : REACTIFS : PRELEVEMENT : METHODE : VALEURS DE REFERENCES : ASSURANCE QUALITE SOURCES D'ERREURS : NUMERATION DES GLOBULES ROUGES DANS LE SANG : INDICES (OU INDEX) : MCV MCH ANNEXE 1 : LISTE INDICATIVE DE PRIX POUR LES TECHNIQUES DE DETERMINATION DE L ANEMIE ANNEXE 2 : QUELQUES VALEURS DE REFERENCE EN HEMATOLOGIE ANNEXE 3 : MORPHOLOGIE DES ELEMENTS SANGUINS SUR FROTTIS COLORE AU MAY-GRÜNWALD-GIEMSA Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

4 PRISE DE SANG : CAPILLAIRE : La technique la plus utilisée et la moins chère pour la prise d'échantillons hématologiques dans des conditions difficiles est le prélèvement de sang capillaire. Ceci est particulièrement vrai pour les enfants ou lorsque seule une petite quantité de sang est nécessaire (de l'ordre de 100 µl). Cependant, comme aucun anticoagulant n est utilisé, le sang doit être immédiatement analysé. Il est aussi impossible de répéter un test en cas de résultat anormal. Les emplacements de choix pour le prélèvement sont le 3 ième ou le 4 ième doigt de la main gauche (index ou majeur). De préférence sur le côté du doigt qui est moins sensible que l extrémité. Pour les nourrissons de moins de 6 mois, le talon ou le gros orteil peuvent aussi être utilisés (attention à ne pas enfoncer trop profondément la lancette : Risque d ostéomyélite). Ne jamais prélever du sang à un doigt ou un pied infecté. Ne jamais prélever du sang à un bras où coule une perfusion. Le prélèvement capillaire doit être suffisamment profond pour obtenir un écoulement libre du sang. Si une pression importante doit être exercée pour obtenir un volume de sang suffisant, une erreur de dilution du sang par du liquide tissulaire sera introduite. 1. Préparer le matériel nécessaire : Lancette stérile en découpant le papier du côté opposé à la pointe. 2 morceaux de coton. Le premier sec, l autre imbibé d alcool à 70 %, instrument de prélèvement, 2. Si possible, demander au patient de se laver les mains avec un savon doux et de l eau chaude (vasodilatation), puis de les sécher minutieusement. 3. Masser légèrement l endroit à prélever : La main doit être chaude et relaxée. Si nécessaire, la main froide peut être immergée dans de l eau chaude. Les doigts du patient doivent être droits et sans tension, afin d éviter toute stase. 4. Désinfecter l'endroit choisi : D'abord avec un tampon de coton imbibé d'alcool à 70 % (garder le tampon). Ensuite avec un tampon sec pour enlever toute trace d'alcool (garder le tampon). 5. Sortir la lancette de son emballage et piquer d'un coup sec et rapide. Jeter immédiatement la lancette dans un conteneur à aiguilles. 6. Exécutez une pression légère sur le doigt, afin de réaliser un meilleur écoulement de sang. 7. Essuyer la première goutte de sang avec le tampon de coton sec (pour éliminer l'alcool à 70 % qui restait éventuellement. Sauf dans le cadre de la recherche des microfilaires où la sensibilité de la recherche est plus grande dans la première goutte de sang). Jeter le coton dans la poubelle. 8. La goutte de sang doit être assez grande pour compléter le volume à prélever en une seule fois. 9. Prélever le sang pour le test à effectuer, en pressant de votre main gauche le doigt piqué pour faire sortir le sang. 10. Couvrir l'endroit de la piqûre avec le coton imbibé d'alcool à 70 et demander au patient de le maintenir pendant quelques minutes. Note particulière pour la détermination de la glycémie : L usage d éther ou d un désinfectant cutané, quel qu il soit, risque d interférer avec la réaction enzymatique du réactif de la bandelette (glucose désoxyréductase). Pour la glycémie, afin de limiter le risque infectieux et l interférence possible de débris alimentaires (trace de jus d un fruit ou de sucre par exemple), il est recommandé de demander au patient de se laver les mains avec un savon doux puis de les sécher minutieusement avant de réaliser un prélèvement capillaire. VEINEUX : Lorsqu'une plus grande quantité de sang est nécessaire, lorsque différents services doivent travailler sur le même échantillon ou lorsqu'un échantillon de sérum est nécessaire, la prise de sang veineuse est utilisée. Pour éviter la coagulation et pour maintenir les cellules dans un état naturel, l usage d un anticoagulant est alors nécessaire. Les anticoagulants fonctionnent via différents mécanismes : - par élimination des ions calcium libres (exemples : EDTA, citrate trisodique) Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

5 - par interférences avec les facteurs de la coagulation (exemple : Héparine) Pour les examens hématologiques courants (hémoglobine, numération globulaire, groupages sanguins, etc.), le sel dipotassique de l'edta est recommandé par rapport aux autres (complexonii, complexon III, K 3 EDTA, Na 2 EDTA, ) Des tubes contenant de l'anticoagulant peuvent être préparés de la manière suivante : verser 40 µl de la solution du sel dipotassique de l'edta (10 g / 100 ml d'eau distillée) dans un tube de 3 ml. Laisser sécher à température ambiante en protégeant les tubes de la poussière. Boucher les tubes après séchage. Ces tubes doivent être remplis avec 2.5 ml de sang. Il est important de respecter la concentration correcte en anticoagulant (soit plus ou moins 1,5 mg d'edta par ml de sang) : une concentration trop faible en anticoagulant n'évitera que partiellement la coagulation, tandis qu'une concentration trop élevée déformera les cellules. Il faut donc toujours remplir le tube du volume prévu de sang. Pour la vitesse de sédimentation le citrate trisodique est utilisé à la dilution suivante 1 volume d'une solution de citrate trisodique à 32 g/l pour 4 volumes de sang. DIFFERENCE ENTRE COAGULATION ET SEDIMENTATION : Sans anticoagulant Avec anticoagulant Coagulation (Solidification) Sédimentation (ou après centrifugation) Sérum Plasma GB (buffycoat) (GR+GB dans une Culot GR structure de fibrine) Prothrombine Thrombine Fibrinogène Fibrine (en quelques min) puis formation d un réseau spongieux (après quelques heures, formation de grumeaux) SERUM = PLASMA SANS LES PROTEINES INTERVENANT DANS LA COAGULATION Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

6 DOSAGE DE L HEMOGLOBINE INTRODUCTION : L anémie est définie par une diminution du taux de l hémoglobine (et non par une diminution du nombre de globules rouges). L anémie correspond donc à une diminution de la masse totale de l hémoglobine dans l organisme ce qui se traduit par une diminution des valeurs données par l hémogramme. L anémie se définit par une hémoglobine inférieure à 11 g/100 ml (ce qui correspond à un hématocrite inférieur à 33 %). Une hémoglobine inférieure à 7 g/100 ml signe une anémie sévère (soit un hématocrite inférieur à 21 %). Certains auteurs (et peut être dans l avenir l OMS) prennent comme valeur seuil 8 g/100 ml (soit un hématocrite inférieur à 24 %). V o l u m e p l a s m a t i q u e V o l u m e g l o b u l a i r e N o r m a l A n é m i e v r a i e F a u s s e a n é m i e ( h é m o d i l u t i o n ) Fig.1 : Anémie vraie et fausse anémie par hémodilution. Dans certaines circonstances, la diminution des valeurs de l hémogramme est lié à une hémodilution par excès de plasma entraînant une fausse anémie : grossesse, splénomégalie, insuffisance cardiaque, Immunoglobuline monoclonale surtout IgM, L hémoglobine est le principal constituant des globules rouges. C est le pigment qui donne la couleur rouge au sang. L hémoglobine est responsable du transport de l oxygène, du gaz carbonique et des échanges gazeux tissulaires et pulmonaires. L hémoglobine est constituée de 4 chaînes protéiques (les globines) et de 4 molécules d hème. L hème est une protoporphyrine qui comporte un atome de fer divalent (Fe 2+ ). L une des valences de ce fer ferreux se fixe à la globine, l autre fixe l oxygène dans la forme oxygénée (Fig. 2). Chez l adulte, l hémoglobine majoritaire est l hémoglobine A, formée de 2 chaînes α et de 2 chaînes β (α 2 β 2 ). Elle représente plus de 97 % de l hémoglobine totale. Il existe une fraction minoritaire d hémoglobine A 2 (formée de 2 chaînes α et de 2 chaînes δ soit α 2 δ 2). Chez le fœtus et le nouveauné, on retrouve un type particulier d hémoglobine : L hémoglobine fœtale (HbF, formée de 2 chaînes α et de 2 chaînes γ, soit α 2 γ 2). Son taux décroît au cours le la première année de vie, pendant laquelle elle est remplacée par de l hémoglobine A. Au-delà de la première année, elle n est normalement présente qu à l état de trace (moins de 1 %). Fig 2 : Structure de l hémoglobine (Hémoglobine A) globine Fe α β Fe 141 aa 146 aa (2-3 DPG) β α Fe Fe 146 aa 141 aa hème 2-3 DPG = 2-3 diphosphoglycérate Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

7 Pour définir une anémie, il est donc important d avoir une technique fiable et de préférence simple pour déterminer l hémoglobine. Différentes techniques plus ou moins fiables existent. Ces techniques peuvent se regrouper sous 2 grandes familles : 1. Les techniques basées sur la couleur du sang complet, ni dilué ni hémolysé pour estimer l hémoglobine (Talquist, HCS, Lovibond, ). 2. Les techniques basées sur la couleur du sang après hémolyse des globules rouges pour estimer l hémoglobine (DHT, ). 3. Les techniques hémolysant et transformant le sang avant de déterminer l hémoglobine (Sahli, Hemocue, Drabkin, ). Une autre alternative serait d utiliser l hématocrite pour définir l anémie. Le choix de la technique utilisée dépendra de sa fiabilité, de sa reproductibilité, de son prix, de l équipement nécessaire, du degré de difficulté, de la formation du personnel disponible,... VALEURS DE REFERENCE 1 : Les valeurs d hémoglobine varient en fonction de l'âge, du sexe et de l'altitude. Age Sexe Hémoglobine Unités en g/100 ml 3 mois 12 mois Homme et femme 10,0 14,0 1 an 12 ans Homme et femme 10,5 15,0 12 ans 100 ans Homme (Europe) 13,2 17,3 12 ans 100 ans Femme (Europe) 11,7 15,5 1 Les valeurs de références varient en fonction de la population et de la méthode utilisée par le laboratoire. Chaque laboratoire devrait donc valider ces valeurs de références avec le laboratoire de référence pour l'hématologie le plus proche. Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

8 METHODE HCS (HEMOGLOBINE COLOUR SCALE) PRINCIPE : La méthode HCS est une méthode visuelle simple permettant d'estimer la quantité d'hémoglobine. Il s'agit de comparer la couleur du sang total (ni hémolysé, ni dilué) absorbé en couche mince sur un papier buvard spécial, avec une série de couleurs de référence. Les couleurs de références correspondent à différentes valeurs d hémoglobine : 14, 12, 10, 8, 6 et 4 g /100 ml. MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + Kit HCS contenant un livret avec une palette de six couleurs de référence, un distributeur de bandelettes tests et des bandelettes tests (papier buvard spécial. N utiliser que les bandelettes spéciales commercialisées par Copack. D autres bandelettes pourraient donner des résultats erronés. Les bandelettes tests doivent être conservées à l abri de la lumière, de l humidité et de la poussière), alcool à 70 %. PRELEVEMENT : Prélèvement de sang capillaire soit prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'edta dipotassique. METHODE : Trouver un lieu convenable pour réaliser la détermination : Une pièce bien éclairée par la lumière ou par une lumière artificielle, une véranda ou sous un arbre. (EVITER LE PLEIN SOLEIL ET LA PENOMBRE). Lors de la comparaison des couleurs, la source d éclairage doit venir par-dessus l épaule, en évitant l ombre projetée par l utilisateur. 1. Déposer une goutte de sang à l une des extrémités de la bandelette en quantité suffisante pour couvrir toute la surface des cercles découpés dans l échelle de comparaison (environ 1 cm de diamètre). Suffisamment pour que la tache formée soit juste plus grande que la surface des cercles découpés dans les couleurs de références. Trop peu de sang : La surface des cercles découpés ne sera pas entièrement recouverte de sang. Trop de sang : La tache sera trop épaisse et le sang mettra trop de temps à sécher. 2. ATTENDRE ENVIRON 30 SECONDES après avoir déposé le sang. Comparer ensuite immédiatement les couleurs. Tout retard dans la lecture du résultat sera source d erreur car la tâche de sang s éclaircira et donnera donc une valeur faussement plus basse. Déplacer la bandelette-test de haut en bas derrière les ouvertures pratiquées dans l échelle en commençant par la nuance la plus claire (4 g/dl) ou la plus sombre (14 g/dl), jusqu à trouver la couleur de référence qui correspond le mieux à la tache de sang. Pendant la lecture, maintenir la bandelette test tout contre l échelle de manière à éviter toute lumière parasite. Essayer de tenir le livret dans différentes positions : modifier doucement l angle d observation afin de trouver la meilleure position qui permet de distinguer au mieux les six nuances de rouge. Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

9 Si la couleur de la goutte de sang correspond exactement à l une des nuances de rouge de référence, enregistrer le taux d hémoglobine correspondant. Si la couleur de la goutte de sang se situe entre deux teintes, retenir la valeur moyenne entre les deux teintes. En cas de doute entre deux teintes, enregistrer le taux le plus faible. Exemple : 14 g/100 ml : trop claire. 12 g/100 ml: Couleur identique. 10 g/100 ml: Trop sombre. 8 g/100 ml : Trop sombre. 6 g/100 ml : Trop sombre. 4 g/100 ml : Trop sombre. ENTRETIEN : Le nettoyage de l échelle se fait en essuyant sa surface arrière avec un mouchoir en papier humidifié avec de l alcool à 70 %, puis avec un mouchoir sec. L échelle de couleurs de référence doit être nettoyée après chaque usage. L échelle peut servir à des milliers de tests. Cependant, afin d éviter toute dégradation des couleurs, il y a lieu de toujours bien refermer le livret après utilisation et de ne jamais le laisser exposé en plein soleil. Le livret doit être périodiquement replacé (comparer périodiquement les couleurs de références avec un carnet neuf pour décider de son remplacement). METHODE LOVIBOND (méthode simplifiée selon Harrison) PRINCIPE : La méthode Lovibond est une méthode visuelle permettant d'estimer la quantité d'hémoglobine. Il s'agit de comparer la couleur du sang total (ni hémolysé, ni dilué) étalé en couche mince d une épaisseur calibrée dans une cellule spéciale avec une série d'étalons colorés (disques) dans le comparateur LOVIBOND. MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + Comparateur Lovibond, disques Lovibond 5/8 A et 5/8 B, cellule Lovibond 004, compresse, papier doux, alcool 70 %, bécher, solution de chlore à 1 %. Comparateur Lovibond 2000 Disque Cellule Lovibond 004 Pince Lamelle Protubérance Lame La cellule spéciale est composée de deux plaques en verre de dimensions différentes (une lame et une lamelle) que l'on peut accoler au moyen d'une petite pince. Trois protubérances sur la lamelle maintiennent un espace calibré entre les plaques, dans lequel le sang à examiner est introduit latéralement par capillarité (c.-à-d. en faisant MONTER le sang dans la cellule). Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

10 PRELEVEMENT : Prélèvement de sang capillaire [ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'edta dipotassique]. METHODE : 1. Rincer et essuyer la cellule à l'eau filtrée. 2. Rincer et essuyer la cellule à l'alcool (Ethanol 70 %). 3. Monter la cellule de telle façon que le chiffre 004 soit lisible sur la lamelle. Fixer la lamelle avec la pince. Une cellule est fragile et coûteuse : Toujours effectuer le montage au-dessus d'une table. Manipuler toujours la cellule pince dirigée vers le bas. 4. Vérifier l'état de propreté des disques de comparaison. S'ils sont sales, les nettoyer avec un chiffon doux. Vérifier la coloration des conjonctives du patient. En fonction de leur coloration, choisir le disque A pour les faibles valeurs d'hémoglobine ou le disque B pour les valeurs élevées d'hémoglobine. Introduire le disque choisi dans le comparateur en s'assurant que les références numérotées font face à l'utilisateur. Régler le comparateur sur la plus faible valeur d hémoglobine du disque. VERIFIER LA CELLULE AVANT UTILISATION : Il faut que la cellule soit préalablement décontaminée à l'eau de Javel puis désinfectée à l'alcool à 70 %. Il faut qu'elle soit propre et sèche (pas de trace d'eau, d'alcool, de doigts ou de poussière). Il faut que le chiffre 004 soit lisible sur la lamelle. Il faut que la lamelle ne dépasse pas latéralement de la lame. 5. Utiliser du sang provenant d'une piqûre au doigt (prélèvement de sang capillaire) pour remplir COMPLETEMENT la cellule en faisant MONTER le sang dans la cellule. S'il y a des bulles d'air dans la cellule, recommencer au point 1 en utilisant une nouvelle cellule. 6. Eliminer le sang qui est sur la lamelle ou sous la lame avec un papier doux. Ne pas éliminer le sang qui est sur le côté de la lame. 7. Enlever la pince. 8. Introduire la cellule dans la partie gauche du comparateur, lame dirigée vers l'observateur. Tenir la cellule avec le doigt pour qu'elle soit parfaitement verticale dans le comparateur. Chercher IMMEDIATEMENT, en lumière diffuse à 50 cm des yeux, la couleur correspondante sur l'un des deux disques (La lecture doit être rapide pour éviter la coagulation et le séchage du sang). Noter la valeur trouvée. POUR OBTENIR UNE LUMIERE DIFFUSE : La journée, diriger le comparateur en direction d une surface blanche dans la direction opposée au soleil. La nuit, diriger le comparateur vers une surface blanche qui est éclairée par une lampe mate. En dirigeant directement le comparateur vers le soleil ou vers une lampe, la détermination ne sera pas correcte. Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

11 9. Convertir le % trouvé en g/100 ml de sang à l'aide de la table de conversion. 10. Décontaminer la cellule (bain de 30 minutes dans une solution de Chlore à 1 %). 11. Rincer et essuyer la cellule à l'eau filtrée. 12. Rincer et essuyer la cellule à l'alcool (éthanol 70 ). 13. RANGER LES DISQUES IMMEDIATEMENT DANS LEURS COFFRETS DE PROTECTION ET LES CONSERVER A L'ABRI DE LA LUMIERE. (La lumière a un effet décolorant sur les couleurs) 14. Monter les cellules dès la fin de leur désinfection pour être prêt pour un autre patient ou une urgence. Protéger les cellules montées en les enroulant dans du papier doux (papier hygiénique ou serviette en papier). PETITS PROBLEMES ET SOLUTIONS : TOUJOURS VERIFIER LA CONCORDANCE ENTRE LA VALEUR DE L'HEMOGLOBINE ET LA COLORATION DES CONJONCTIVES. 1. Aucune valeur n'apparaît dans l'ouverture inférieure du comparateur. Le disque est placé à l'envers. Enlever le disque et retourner le. 2. Aucune couleur ne correspond à la coloration du sang du patient. Le disque utilisé ne correspond pas à la valeur d'hémoglobine attendue. Utiliser l'autre disque. Le patient a un ictère (jaunisse). Ses conjonctives supérieures sont jaunes. Trouver la couleur la plus proche et signaler dans votre réponse la présence de l'ictère. La couleur du sang est inférieure au minimum du comparateur. Donner comme résultat < à 20 % soit < à 3,3 g/100 ml. 3. La Valeur d'hémoglobine mesurée semble trop basse. S'assurer que la lamelle est mise dans le bon sens (chiffre 004 lisible). Si ce n'est pas le cas, recommencer le dosage avec une autre cellule. S'assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air entre la lame et la lamelle. Si c'est le cas, recommencer le dosage avec une autre cellule. Vérifier la propreté du disque de comparaison et le cas échéant, nettoyer le disque avec un chiffon doux. Vérifier la propreté de la plaque translucide du comparateur et le cas échéant, la nettoyer avec une solution de chlore à 1 % puis à l'eau filtrée. Si aucune de ces solutions ne marche et que les valeurs sont systématiquement trop basses, effectuer une comparaison entre des nouveaux et des anciens disques (la couleur des disques se dégrade avec la lumière). 4. Valeur d'hémoglobine trop haute. Le dessus de la lamelle ou le dessous de la lame sont souillés par du sang. Eliminer le sang qui est sur ou sous la lame avec un papier doux. Le désinfectant utilisé pour le prélèvement est coloré (Bétadine par exemple). Recommencer le dosage en utilisant de l'ethanol à 70 %. Vérifier la propreté de la plaque translucide du comparateur et le cas échéant, la nettoyer à l'eau de Javel puis à l'eau filtrée. Le patient a un ictère (jaunisse). Ses conjonctives supérieures sont jaunes. Pas de solution, signaler dans votre réponse la présence de l'ictère. Le patient est déshydraté (ce qui provoque une hémoconcentration). Pas de solution, signaler la déshydratation dans votre réponse. Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

12 TABLE DE CONVERSION DU % LOVIBOND EN g / 100 ml : AU MOMENT OU VOUS PENSEZ AVOIR TROUVE LA BONNE COULEUR, VERIFIEZ QUE LA COULEUR PRECEDENTE EST PLUS CLAIRE ET QUE LA COULEUR SUIVANTE EST BIEN PLUS FONCEE QUE L'ECHANTILLON. DISQUES POURCENTAGE g / 100 ml Disque N 5/8 A (Couleurs claires) Pour faibles valeurs d'hémoglobine Disque N 5/8 B (Couleurs foncées) Pour fortes valeurs d'hémoglobine METHODE A L HEMATINE ACIDE SELON SAHLI : PRINCIPE : Une quantité précise de sang est diluée avec une solution acide dans un tube spécial. La solution lyse les globules rouges, libère l hémoglobine et transforme l hémoglobine en un composé brunâtre (l hématine acide). Le mélange sang acide est dilué avec de l eau distillée, jusqu à obtenir la même couleur que la couleur de référence de l hémoglobinomètre de Sahli. La lecture de la graduation obtenue sur le tube donne la concentration en hémoglobine en g/100 ml. La méthode de Sahli, encore bien utilisée est à déconseiller : Elle ne donne pas un dosage exact de l hémoglobine. En effet, tous les types d hémoglobine ne se transforment pas en hématine acide, les changements de couleurs ne sont pas très sensibles et la couleur brune du verre de référence n est pas vraiment semblable à celle de l hématine acide. MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + hémoglobinomètre de Sahli, bâtonnet en verre pour mélanger, pipette de Sahli, système d aspiration de sécurité, tube gradué de Sahli, pipettes pasteur ou flacons compte-gouttes. L hémoglobinomètre de Sahli est un support pour tube encadré de part et d autre par des bâtonnets colorés en brun. Ces bâtonnets servent de couleur de référence pour la détermination de l hémoglobine. Le tube de Sahli qui s insère au centre du support est gradué en g/100 ml. Il peut aussi porter une deuxième graduation en % (100 % en Sahli correspondent à 16 g/100 ml). Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

13 REACTIFS : Solution d acide chlorhydrique à 0,1 N : Acide chlorhydrique concentré : 9,5 ml Eau distillée : jusque 1 litre ATTENTION, l acide chlorhydrique est nocif et extrêmement corrosif. Il est aussi irritant pour les yeux. Ce produit est à manipuler avec une extrême prudence, fenêtres ouvertes (ou sous hotte chimique). Ne jamais verser d'eau dans de l'acide Chlorhydrique concentré. L'addition d'une faible quantité d'eau dans un acide produit suffisamment de chaleur pour faire exploser la bouteille. Mesurer 500 ml d eau distillée dans un cylindre de 500 ml et la verser dans un ballon de ml. Utiliser une pipette et un ballon à pipeter pour ajouter lentement 9,5 ml d Acide chlorhydrique dans le jaugé. Le contenu s échauffera. Après refroidissement, ajuster à ml avec de l eau distillée. La solution ainsi préparée est stable au moins 1 an à température ambiante. Eau distillée (ou éventuellement filtrée). PRELEVEMENT : Prélèvement de sang capillaire ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'edta dipotassique. METHODE : 1. Remplir à l aide du compte-gouttes le tube gradué avec la solution d HCl 0,1 N, et ce jusqu au premier trait de la graduation (le fond du ménisque doit être au niveau du premier trait). 2. Vérifier la pointe de la pipette de Sahli. Eliminer toute pipette ébréchée (erreur de volume). 3. Aspirer dans la pipette de Sahli un peu plus de 20 µl de sang, provenant d un prélèvement capillaire. Essuyer le sang sur la paroi et rapporter le volume de sang à exactement 20 µl en touchant la pointe de la pipette au moyen d un papier absorbant. 4. Souffler les 20 µl de sang de la pipette au fond du tube contenant l HCl 0,1 N. 5. Rincer à 3 reprises la pipette avec le mélange sang-hcl du fond du tube et homogénéiser le tube. 6. Laisser reposer 1 minute pour permettre l hémolyse des globules rouges et la dénaturation de l hémoglobine en hématine acide. 7. Ajouter goutte à goutte de l eau distillée au moyen du compte-gouttes, tout en remuant le contenu du tube au moyen du bâtonnet en verre, et ce jusqu à obtenir dans le tube la même teinte que celles des comparateurs de référence. Vérifier l égalisation progressive des couleurs en tenant l appareil à environ 50 cm des yeux, sous lumière diffuse. 8. Après égalisation des couleurs, rechercher la graduation de l échelle en g/100 ml qui se trouve à hauteur de la partie la plus basse du ménisque du liquide. 9. Noter le résultat. Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

14 METHODE DE DRABKIN (méthode de référence) : PRINCIPE : Il s agit de la méthode de référence (Standard d or ou golden standard) Le sang est dilué dans du réactif de Drabkin qui hémolyse les hématies et libère l hémoglobine. Ce même réactif transforme l hémoglobine en un complexe stable : La cyanométhémoglobine. Hb + K 3 Fe(CN) 6 MHb MHb + KCN CNMHb [Hb = hémoglobine, MHb = méthémoglobine, CNMHb = cyanométhémoglobine] Cette réaction se déroule à un ph stabilisé par du phosphate monopotassique pour obtenir une réaction complète en un temps raisonnable. L addition d un détergent facilite l hémolyse et prévient la turbidité due aux protéines plasmatiques. Une quantité précise de sang est diluée dans un volume donné de réactif de Drabkin. Après hémolyse et transformation de l hémoglobine, la densité optique de cette solution est déterminée au photomètre à la longueur d onde d absorption maximale de la cyanométhémoglobine (540 nm). Cette densité optique est proportionnelle à la quantité d hémoglobine présente dans le sang. La quantité d hémoglobine est déterminée par comparaison avec les densités optiques mesurées pour des concentrations connues d hémoglobine. PRELEVEMENT : Prélèvement de sang capillaire soit prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'edta dipotassique. Le sang prélevé sur anticoagulant peut être congelé et conservé au moins deux ans (utilisation comme contrôle). MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + spectrophotomètre (ou colorimètre) permettant mesurer des densités optiques à 540 nm, pipette de Sahli avec un système d aspiration de sécurité (ou pipette automatique de 20 µl), pipette graduée de 5 ml et ballon à pipeter (ou distributeur automatique de 5 ml), tubes à essai, cuvettes pour colorimètre, différents ballons jaugés et pipettes jaugées (pour la dilution des calibrateurs), papier millimétré. REACTIFS : Réactif de dilution de Drabkin (aussi disponible «prêt à l emploi» exemple Sigma D 5941) : Ferricyanure de potassium (K 3Fe(CN) 6) : 0,20 g Cyanure de potassium (KCN) : 0,05 g Phosphate monopotassique (KH 2PO 4) : 0,14 g Tween 20 : 1 ml Eau distillée : jusque 1 litre (Le Tween 20 peut être remplacé par 0,5 ml Brij-35 à 30%) ATTENTION, le cyanure de potassium est hautement toxique. La solution obtenue doit être jaune pâle et limpide. Elle se conserve dans un flacon brun hermétiquement bouché pendant plusieurs mois. Si un trouble apparaît, elle ne doit plus être utilisée. Solution de Référence cyanométhémoglobine (CNMHB) pour calibration : Des solutions de calibration sont disponibles commercialement (ex. Haemoglobin standard de IGMA, HiCN BS3985 de BDH, ). Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

15 Suivre le mode d emploi du fabricant (exemple pour l haemoglobin standard de SIGMA) : - Ajouter 50,0 ml de réactif de Drabkin au flacon Haemoglobin standard. - Mélanger pour dissoudre le contenu. - Attendre au minimum 30 minutes avant emploi. Conservée à l obscurité entre 2 et 8 C, cette solution de calibration est stable au moins 6 mois. Réaliser une courbe de calibration sur base de différentes dilutions de cette solution de calibration. A 540 nm, régler le zéro de la densité optique (D.O.) sur base d une cuvette de réactif de Drabkin, puis lire les D.O. des solutions de calibration. La calibration est linéaire et passe par l origine. Exemple de dilution : Sur base d'un calibrateur contenant 18 g% d équivalente hémoglobine diluée dans 50,0 ml de Drabkin, on peut effectuer une courbe sur base de quelques points intéressants de dilution facile : Tube N Volume de Drabkin en ml Volume de calibrateur dilué en ml Concentration finale en g % METHODE : 1. Allumer le spectrophotomètre, sélectionner la longueur d onde et laisser chauffer la lampe. 2. Préparer une série de tubes à essai (nombre d analyses à prévoir). 3. Pipeter exactement 5,0 ml de réactif de Drabkin dans ces tubes à essai. 4. Ajouter 0,02 ml (20 µl) de sang capillaire ou sang prélevé sur EDTA à un des tubes. 5. Rincer 3 fois la pipette avec le réactif. 6. Mélanger et attendre 5 minutes pour avoir une réaction complète (attention, la réaction peut prendre jusqu à 30 minutes pour un échantillon contenant une proportion élevée de carboxy hémoglobine). 7. Mesurer la densité optique (D.O.) à 540 nm dans le même spectrophotomètre que celui utilisé pour la réalisation de la courbe de calibration : Remplir une cuvette de réactif de Drabkin pour régler le zéro du spectrophotomètre à 540 nm (blanc). Lire les D.O. des analyses et de la (ou des) solution(s) de contrôle(s). La couleur est stable durant quelques heures. Sur base de la courbe de calibration, déterminer la valeur en hémoglobine pour chaque échantillon. D.O. ou Calcul : [Hb] en g/100 ml D.O. analyse x concentration du calibrateur = Hb concentration échantillon D.O. calibrateur Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

16 HEMOCUE PRINCIPE : L Hemocue est un exemple d hémoglobinomètre robuste, portable et précis. Bien que son coût d utilisation le rende inabordable pour un hôpital de district, il peut être utile dans des enquêtes épidémiologiques. Le sang est introduit dans une cuvette réactive spéciale à usage unique. Cette cuvette, d un volume précis contient un réactif qui hémolyse les globules rouges et transforme complètement, en moins d une minute, l hémoglobine en azideméthémoglobine (réaction de Vanzetti modifiée, basée sur l azide de sodium). La densité optique de cette solution est déterminée par un HemoCue (photomètre spécial utilisant deux longueurs d ondes (570 nm et 880 nm). La densité optique à 570 nm, corrigée en fonction de la turbidité (880 nm) est proportionnelle à la quantité d hémoglobine présente dans le sang et est automatiquement convertie en g/100 ml. Ce système est commercialisé par Hemocue : Site internet : MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + cuvettes HemoCue à usage unique, lecteur HemoCue, cuvette HemoCue de contrôle, batteries. PRELEVEMENT : Prélèvement de sang capillaire [ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'edta dipotassique]. METHODE : 1. Vérifier le fonctionnement du photomètre HemoCue : insérer dans l appareil la cuvette de contrôle. Le résultat obtenu dans être dans les limites recommandées par le fabricant (soit pour notre cellule de contrôle N entre 11,0 et 11,6 g/100 ml) 2. Par prélèvement de sang capillaire, remplir COMPLETEMENT une cellule Hemocue neuve en faisant MONTER le sang dans la cuvette. 3. Remplir en une fois toute la cuvette de la cellule. N essayez jamais d ajouter du sang après le premier remplissage. S'il y a des bulles d'air dans la cellule, recommencer en utilisant une nouvelle cellule. 4. Enlevez l excès de sang à l extérieur de la cuvette à l aide de papier absorbant, sans aspirer le sang contenu dans la cellule. 5. Insérer immédiatement la cuvette remplie dans le portoir du lecteur Hemocue. 6. Repousser le portoir de cuvette dans la position de mesure. 7. Le résultat d hémoglobine de sang en g/100 ml (ou g/l ou mmol/l en fonction de l appareil) apparaît après 30 à 50 secondes sur l écran de l appareil. La cuvette doit être analysée dans les 10 minutes qui suivent le remplissage de la cuvette. Après ce délai, le résultat mesuré ne sera plus fiable suite à l évaporation du liquide de la cellule). Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

17 DHT (méthode à l ammoniaque) PRINCIPE : Une quantité précise de sang est diluée dans un volume précis d une solution hémolysante (ammoniaque à 0,04 %). L hémoglobine libérée des globules rouges donne la couleur rouge au liquide. L intensité de cette couleur est mesurée à 523 nm (longueur d onde d absorption maximale commune de la majorité des types d hémoglobines) dans un photomètre qui transforme cette valeur en concentration. La mesure de la concentration en hémoglobine (en g/l) est automatiquement effectuée lors de l introduction d une cuvette dans l appareil. La valeur mesurée reste affichée durant 30 secondes, puis l appareil passe automatiquement en position «stand by» ce qui lui permet de faire périodiquement des autocontrôles. Ce système est commercialisé par DHT : Site internet : Cuvette Fenêtre en verre Filtre d interférence Photodiode LED (Diode émettant une lumière verte) MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + hémoglobinomètre DHT, tubes à hémolyse, pipette de Sahli avec un système d aspiration de sécurité, (ou pipette automatique de 20µl), pipette graduée de 2 ml (ou distributeur automatique de 2 ml), ballon à pipeter, tubes à essai, cuvettes pour colorimètre, ballon jaugé de ml. PRELEVEMENT : Prélèvement de sang capillaire [ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'edta dipotassique]. REACTIFS : Solution d ammoniaque à 0,04 % (v/v) : Préparation sur base d une solution d ammoniaque à 28 % : Ammoniaque à 28 % Eau distillée 1,4 ml (pipettes en verre de 5 ml) ad 1.000,0 ml (ballon jaugé de 1.000ml) ATTENTION : L ammoniaque concentrée produit des vapeurs irritantes et toxiques. N ouvrir la bouteille que dans un local bien ventilé (ou sous hotte chimique). Cette préparation donne une concentration finale en ammoniaque de 0,0392 %. La solution diluée est stable 4 semaines dans un flacon blanc hermétiquement bouché à température ambiante. Formule utilisée pour la calculer la dilution : C1 x V1 = C2 x V2 Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

18 Où C1 = Concentration de la solution concentrée en ammoniaque V1 = Volume de la solution concentrée en ammoniaque à utiliser C2 = Concentration en ammoniaque à atteindre V2 = Volume de la solution diluée à préparer Exemple : C1 = 28 % V1 =? C2 = 0,04 % V2 = ml Soit : 28 % x V1= 0,04 % x 1000 ml soit V1 = 1,429 ml METHODE : VERIFICATION DE LA CALIBRATION DE L HEMOGLOBINOMETRE : (Attention : Les valeurs données ne sont valables que pour l hémoglobinomètre N 0931 de l ITG) Eviter de salir les surfaces optiques des cuvettes. Ne jamais toucher les surfaces optiques. Toujours manipuler les cuvettes en les tenant par leurs faces mates. Toutes traces de doigts, de salissures ou de condensation doivent être enlevées avec un papier doux avant mesure. Lors du remplissage de la cuvette, éviter la formation de bulles d air qui affecterait la mesure. A. REGLAGE DU BLANC : Insérer une cuvette PROPRE ET SECHE dans l appareil. Attention, la cuvette doit être du même type que celles utilisées pour les dosages. La valeur obtenue doit être comprise entre 14 et 24 g/l (pour l appareil N 0931). Si ce n est pas le cas, faites les vérifications suivantes : CAUSES POSSIBLES Cuvette mal insérée dans l appareil : Cuvette griffée : Cuvette sale, ou humide : ACTIONS Insérer la cuvette en sorte que le trajet optique rencontre les faces transparentes de la cuvette. Changer de cuvette. Revérifier la valeur obtenue avec une cuvette neuve et sèche. Laver et sécher la cuvette. Revérifier la valeur obtenue avec la cuvette propre et sèche. Facteur de calibration (M) incorrect : Vérifier et ajuster si nécessaire le facteur de calibration : Enfoncer et maintenir pendant deux secondes la touche R. Le symbole HHH sera afficher puis la valeur du facteur. Relâcher la touche R dès que la valeur est affichée. Si la valeur affichée n est pas 162 (pour l appareil N 0931), augmenter cette valeur en appuyant sur la touche L ou diminuer cette valeur en appuyant sur la touche R. Après ajustement, revérifier la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche. Réglage du zéro électronique de l appareil incorrect : Le type de cuvette utilisée n est pas le même que celle utilisée pour la calibration : La fenêtre optique de l appareil est sale : Remplir une cuvette propre d eau distillée. Insérer la cuvette dans l appareil, puis enfoncer et maintenir la touche L jusqu à l émission d un bruit. La nouvelle valeur du zéro est alors enregistrée. Revérifier la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche. Remplir une cuvette propre d eau distillée. Insérer la cuvette dans l appareil, puis enfoncer et maintenir la touche L jusqu à l émission d un bruit. La nouvelle valeur du zéro est alors enregistrée. Revérifier la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche. Nettoyer la fenêtre optique à l aide d un petit coton-tige imbibé d alcool à 70. Laisser sécher. Revérifier la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche. B. VERIFICATION ET REGLAGE DU ZERO DU DOSAGE : Insérer dans l appareil une cuvette contenant 2 ml d une solution d ammoniaque à 0,04 %. La valeur mesurée et affichée doit être égale à 0. Si la valeur obtenue n est pas 0, enlever la cuvette et dans les deux secondes qui suivent enfoncer et maintenir la touche L jusqu à l émission d un signal sonore. Insérer dans l appareil une cuvette contenant 2 ml d une solution d ammoniaque à 0,04 %. La valeur mesurée et affichée doit être égale à 0. Ce contrôle est à faire avant chaque série de mesures. Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

19 C. VERIFICATION DE LA CALIBRATION : Une cuvette de contrôle (N 0931 pour notre appareil) est fournie avec chaque lecteur. La valeur attendue pour notre cuvette de contrôle doit être comprise entre 133 et 143. Ce contrôle est à effectuer avant chaque série de mesures Insérer dans l appareil la cuvette de calibration. Si la valeur mesurée n est pas comprise dans cet intervalle, réaliser les vérifications suivantes : CAUSES POSSIBLES Cuvette de contrôle mal insérée dans l appareil : Cuvette de contrôle griffée : Cuvette sale, ou humide : ACTIONS Insérer la cuvette en sorte que le trajet optique rencontre les faces transparentes de la cuvette. Acheter une nouvelle cuvette de contrôle. Revérifier la valeur obtenue avec une cuvette neuve et sèche. Laver et sécher la cuvette. Revérifier la valeur obtenue avec la cuvette propre et sèche. Facteur de calibration (M) incorrect : Vérifier et ajuster si nécessaire le facteur de calibration : Enfoncer et maintenir pendant deux secondes la touche R. Le symbole HHH sera afficher puis la valeur du facteur. Relâcher la touche R dès que la valeur est affichée. Si la valeur affichée n est pas 162 (pour l appareil 0931), augmenter cette valeur en appuyant sur la touche L ou diminuer cette valeur en appuyant sur la touche R. Revérifier la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche. Réglage du zéro électronique de l appareil incorrect : Le type de cuvette utilisée n est pas le même que celle utilisée pour la calibration : La fenêtre optique de l appareil est sale : Remplir une cuvette propre d eau distillée. Insérer la cuvette dans l appareil, puis enfoncer et maintenir la touche L jusqu à l émission d un bruit. La nouvelle valeur du zéro est alors enregistrée. Revérifier la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche. Remplir une cuvette propre d eau distillée. Insérer la cuvette dans l appareil, puis enfoncer et maintenir la touche L jusqu à l émission d un bruit. La nouvelle valeur du zéro est alors enregistrée. Revérifier la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche. Nettoyer la fenêtre optique à l aide d un petit coton-tige imbibé d alcool. Laisser sécher. Revérifier la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche. REALISATION D UN DOSAGE : ATTENTION : La précision de la mesure dépend de la bonne concentration en ammoniaque, de la qualité de l eau distillée utilisée pour la préparation du réactif d hémolyse, de la précision de la mesure du volume d ammoniaque et de la précision de la mesure du volume de sang. 1. Pour chaque échantillon, prévoir un tube contenant 2,0 ml du réactif d hémolyse 2. Vérifier si la pipette de Sahli est propre, sèche et non ébréchée. 3. Prélever 20 µl de sang (pipette de Sahli sur laquelle est adaptée une seringue à insuline). 4. Aspirer le sang un peu au dessus du trait de jauge. 5. Essuyer l excès de sang sur la paroi extérieure de la pipette avec un papier hygiénique et ajuster au trait de jauge avec le papier hygiénique. 6. Refouler le sang dans le tube contenant 2 ml du liquide d hémolyse. 7. Rincer 3 fois par refoulement la pipette de Sahli avec le mélange de sang et de liquide d hémolyse (L hémolyse ne demande que quelques secondes). 8. Après homogénéisation, transférer le contenu du tube dans une cuvette optique. La couleur reste stable pour 6 à 8 heures. 9. Insérer la cuvette dans l appareil 10. Lire la valeur (en g/l) affichée sur l appareil. Attention, si le signal sonore se termine avant que la cuvette soit totalement insérée dans l appareil, la valeur affichée sera fausse. Attendre le signal sonore suivant pour utiliser la valeur. Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

20 Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module / 37

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