GENETIQUE MEDICALE- Étude de ségrégation, ED génétique moléculaire

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1 20/11/2013 GUIMERA Jordan L2 Génétique Médicale C. BEROUD 24 pages Relecteur n 3 Etude de ségrégation, ED génétique moléculaire (haplotype, interprétation des données mutationnelles, notion bio-informatique, mucoviscidose) Plan A. Démarche diagnostique dans les maladies génétiques B. Diagnostic moléculaire des maladies génétiques --- Diagnostic direct (non traité dans ce cours) --- Diagnostic indirect I. Définitions II. Principe III. Marqueurs micro-satellites IV. Exemple V. V. Notion d'informativité VI. Notion de recombinaison VII. Haplotypes 1. Principe 2. Les différentes étapes 3. Exercices A. Démarche diagnostique dans les maladies génétiques 1/24

2 Dans la démarche diagnostique, il y a deux volets : La consultation diagnostique : interrogatoire et examen clinique On étudie l'histoire de la maladie Comme on est dans un contexte diagnostic, on dresse un arbre généalogique qui permet de définir éventuellement un mode de transmission. À partir des connaissances de la pathologie, on va pouvoir entreprendre un examen clinique ciblé. Ne pas oublier l'examen clinique général. Les examens complémentaires Les analyses biologiques qui dépendent du contexte. Imagerie (IRM, Scanner ) Des examens ciblés selon l'orientation entrainée par le diagnostic clinique. Tous ces éléments permettent d'établir un diagnostic clinique. À la fin, on lance des analyses génétiques, qui permet de confirmer le diagnostic clinique par un diagnostic génétique, si tout va bien. Les analyses génétiques Quand on parle de génétique, on pense de suite aux mutations au niveau de l'adn, mais la première chose à réaliser quand on veut faire des analyses génétiques, c'est de la cytogénétique : En première intention, on va faire un caryotype constitutionnel standard. Puis des examens un peu plus complets, comme du FISH (Cf. Cours) Plus rarement, on va avoir besoin de la génétique moléculaire, où l'on différencie deux grandes parties: Le diagnostic direct, c'est à dire qu'on recherche l'anomalie primaire dans le gène, on recherche donc la mutation responsable de la maladie. Le diagnostic indirect, on ne recherche pas l'anomalie, car soit on ne connait pas le gène impliqué, soit parce qu'on a pas identifié la mutation, on va donc utiliser des haplotypes, et on va faire une analyse de ségrégation : on va suivre un chromosome dans une famille. On doit avoir accès à différents membres de la famille (malades et sains) pour pouvoir identifier le chromosome qui ségrège avec la maladie et qui est donc porteur du gène muté. B. Diagnostic moléculaire des maladies génétiques Objectif : Établir un diagnostic précis par l'identification de l'anomalie génétique. Intérêt : Permet d'avoir une certitude diagnostique qui permet une prise en charge adaptée et un conseil génétique pour toute la famille. Deux approches: Diagnostic direct : recherche de l'anomalie génétique primaire, avec l'identification des mutations constitutionnelles délétères Diagnostic indirect : utilisation de marqueurs informatifs (haplotypes) avec la coségrégation d'un phénotype avec un allèle particulier dans une famille. 2/24

3 Le diagnostic indirect est actuellement utilisé surtout dans certaines situations particulières : diagnostic prénatal de certaines maladies (permet de savoir qu'on a bien des cellules de l'embryon, et pas de la mère) et plutôt en complément de l'étude directe diagnostic pré-implantatoire (pas la possibilité de séquencer tout le génome, car on a une trop petite quantité de cellule, et donc on identifie d'abord le chromosome qui ségrège avec la maladie) La technique est aussi utilisée pour : la vérification de l'identité d'un échantillon les empreintes génétiques et d'autres applications Pour cela, on utilise donc des marqueurs pour analyser la coségrégation marqueur/maladie. Il faut donc connaître la localisation du gène morbide ou au moins connaître le chromosome, les marqueurs polymorphes localisés à proximité ou dans le gène (il faut bien les choisir car s'il est trop loin, on peut se tromper à cause du crossing-over, en général, on en prend en amont et en aval du gène étudié afin d'encadrer celui-ci avec des marqueurs microsatellites pour diminuer les erreurs). On étudie la coségrégation familiale phénotype/marqueur. C'est un suivi indirect de la transmission d'une mutation dans une famille. On suit le marqueur qui se transmet en bloc avec le gène responsable de la maladie. On commence par le médecin, avec l'entretien, examen... qui fait penser à une maladie génétique, ce qui implique la famille, qui subit un examen indirect, et on crée un arbre généalogique avec chaque haplotype. 3/24

4 Principales contraintes : nécessite de connaître le gène impliqué (ou le locus) pour choisir les marqueurs à utiliser (problème posé si il y a hétérogénéité génétique, c'est-à-dire que plusieurs gènes sont responsables du même phénotype) Nécessite une certitude du diagnostic clinique chez les sujets Nécessite une étude familiale Nécessite une famille «informative» : parfois non concluant. Mais aussi un marqueur informatif, qui permet par exemple de différencier un chromosome d'origine paternelle ou maternelle. Risque d'erreur ou d'impossibilité de conclure en cas de recombinaison, pour cela, on encadre le gène avec des marqueurs micro-satellites. Ce risque est dû au caractère indirect. Et il faut un bon clinicien en amont! I. Définitions Locus : Emplacement sur un chromosome (d'un gène, d'une séquence,...) Allèle : Une ou plusieurs versions alternatives d'un même gène, d'une même séquence d'adn. S'applique aux mutations, aux polymorphismes, aux marqueurs génétiques, Exemples: Pour un gène : allèle sauvage et allèles mutés Pour un marqueur : différentes tailles (allèle de 8 répétitions, allèle de 10 répétitions, ) Hétérozygote : Un individu est hétérozygote pour un locus lorsqu'il possède deux allèles différents à ce locus. Homozygote : Un individu est homozygote pour un locus lorsqu'il possède deux allèles identiques à ce locus. Hémizygote : un individu est hémizygote pour un locus lorsqu'il possède un seul allèle à ce locus (cas du chromosome X chez l'homme). Génotype : Ensemble des allèles à un ou plusieurs locus chez un individu. Haplotype : L'arrangement linéaire ordonné des allèles sur un chromosome. Les allèles proches sont transmis ensemble («en bloc») sauf s'il y a une recombinaison méiotique entre 2 locus. 1Mb = 1% de recombinaison. II. Diagnostic moléculaire indirect : principe Utilisation d'outils : 4/24

5 Les marqueurs génétiques «anonymes» (petit smiley), ils peuvent être dans les introns, dans les exons, en aval ou en amont du gène, peu importe, l'important c'est que ce marqueur soit le plus polymorphe possible dans la population pour qu'il soit le plus informatif. Le marqueur idéal serait très polymorphe, distribué partout sur le génome (quelque soit le gène que j'étudie, je le trouve), il ne doit avoir aucun impact sur le phénotype. Il faut connaître sa localisation. Il doit être le plus proche possible du gène ou du locus morbide impliqué. Il y a la liste sur internet On peut avoir des marqueurs intragéniques et extragéniques. NB : Les marqueurs n'ont pas d'effet pathologique. Les marqueurs sont utilisés pour suivre indirectement la transmission d'une mutation (connue ou non) dans une famille. Différents types de marqueurs : Microsatellites (ou short tandem repeats/str) Polymorphismes de répétitions (ex : CACACACACA) Répartis uniformément dans le génome, tous les 25 à 100kb Multi-alléliques Les plus utilisés pour le diagnostic indirect La première carte génétique est publié par des français grâce au généthon! Single Nucléotide Polymorphism (SNP) Polymorphismes au niveau d'un nucléotide Très abondants (1SNP/100pb) : plus de 1,5 millions de SNPs connus. Il y a donc une grande probabilité qu'on en trouve un à proximité de la mutation. Répartis uniformément dans le génome Bi-alléliques, il en faudra donc un grand nombre. 5/24

6 Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) Polymorphismes de restriction Autres : délétions, insertions... III.Les marqueurs micro-satellites Le choix de la région d'intérêt dépend du diagnostic clinique et des connaissances. On sélectionne des marqueurs polymorphes de sorte à ce qu'ils soient des marqueurs informatifs dans la famille. L'amplification des régions par PCR permet d'obtenir des quantités suffisantes de séquences d'intérêt pour permettre leur détection (l cellule contient environ 7 picogrammes d'adn, 3 milliards de pb). L'analyse des produits amplifiés permet ainsi: la détection des allèles (taille des produits amplifiés) la détermination du génotype Ce sont des séquences d'adn répétées en tandem d'un motif de 2 à 10pb et dont la taille totale est inférieure à 100 pb. Ils sont très polymorphes et répartis uniformément sur l'ensemble du génome principalement dans les séquences intergéniques et intragéniques (rarement dans les séquences codantes) et constituent d'excellents marqueurs génétiques. On sépare les allèles en fonction de leur taille. On détermine le statut de chaque individu pour le marqueur étudié : 1 bande (ou 1 pic) si c'est un homozygote. 2 bandes (ou 2 pics) si c'est un hétérozygote (pour la plupart des individus). 6/24

7 Séquençage : Pourquoi cette technique n'est-elle pas utilisée? Car on a un mélange des deux allèles, ils se superposent, et c'est impossible de s'en sortir. Dans quelles situations est-elle intéressante? (le prof n'a pas répondu à la question) Séparation des allèles en fonction de leur taille, c'est une électrophorèse (migration sur un gel), et l'adn migre vers le + car il est chargé négativement. Et on obtient : 2 bandes = 2 allèles différents. Avant on utilisait la radioactivité, et maintenant on utilise la fluorescence, c'est moins dangereux et ça coûte moins cher. Tout est automatisé. 7/24

8 Récapitulatif : On va étudier la liaison marqueur-maladie : utilisation de marqueurs polymorphes intragéniques ou extragéniques (il faut qu'il soit très proche du gène étudié) pour analyser la coségrégation d'un phénotype avec un allèle particulier dans une famille. Par des PCRs des marqueurs situés dans le locus morbide (si possible) afin de minimiser les risques d'erreurs dus à des événements de recombinaison. Plus on est proche du gène/du locus morbide, plus on réduit le risque d'erreur lié aux recombinaisons. Les marqueurs microsatellites sont des marqueurs de choix. IV. Exemples On voit que les 4 individus sont tous hétérozygotes. Il y a un allèle à 105 pb, un à 113 et un à 115. Chez le père, l'allèle 113 du marqueur est sur le même chromosome que la mutation impliquée dans la maladie. Lorsque le père transmet le chromosome avec la mutation, il transmet AUSSI l'allèle n'est pas responsable de la maladie, il est juste à côté de l'allèle qui porte la mutation impliquée dans la maladie. 8/24

9 Permet de suivre indirectement la transmission de la mutation sans mise en évidence directe de celle ci. On dit que l'allèle 113 coségrège avec la maladie. On le sait car il est commun aux 2 personnes malades. Maladie autosomique récessive : Quels allèles du marqueur sont liés au locus morbide? Il aide dans les questions, il donne des réponses dans les énoncés des questions d'après, et là, il écrit «AllèleS». En génétique, on est des gens gentils. L'allèle 3 paternel et l'allèle 5 maternel sont liés au locus morbide. Coségrégation de ces allèles du marqueur avec les allèles mutés du gène. Il est ici possible de conclure : la famille est dite informative. Quel est le statut du fœtus si son génotype est : 1/2;2/5;1/3;3/5? 1 / 2 : vraisemblablement sain, mais il peut y avoir un double crossing over, et on se retrouve avec un enfant malade et deux marqueurs «sains», très rare. 2 / 5 : sain mais porteur asymptomatique 1 / 3 : sain mais porteur asymptomatique 3 / 5 : il est vraisemblablement malade, mais c est pas sur, il y aurait pu avoir une recombinaison entre le marqueur et le locus morbide En pratique, on utilise pas qu'un seul marqueur! Ici les données ne permettent pas de distinguer quels allèles du marqueur sont liés aux allèles mutés du gène en cause. Il n'est donc pas possible de conclure et la famille est dite «non informative». Il faut poursuivre l'analyse en utilisant d'autres marqueurs. En effet, l'utilisation d'un grand nombre de marqueurs revêt tout son intérêt si la famille est non informative et réduit la possibilité de recombinaison. 9/24

10 V. Notion de recombinaison (Ces deux diapos n'ont pas été traitées en cours) 10/24

11 Maladie récessive liée à l'x avec recombinaison méiotique : L'allèle initialement associé à la pathologie est le 1 car il a été transmit par la grand-mère (pas de transmission père-fils dans les maladies liées à l'x). 11/24

12 On voit qu'il y a recombinaison car sur les deux garçons atteints, il y en a un qui a un génotype 1 et l'autre 4. Donc soit le marqueur est mal choisi, soit il y a eu recombinaison au niveau de la mère. On ne sait pas si toutes les cellules de la mère sont recombinées. Si la recombinaison a eu lieu au stade foetal, alors c'est très probable que toutes les cellules germinales soient recombinées, ou alors, elle a eu lieu dans les cellules germinales, et on se retrouve avec une mosaïque avec une partie recombinée et une autre non. En pratique donc : Utilisation simultanée de PLUSIEURS marqueurs de locus proches, en fait plusieurs marqueurs au sein d'un même locus global. Permet de réduire les problèmes de NON-informativité et de recombinaison. Au lieu de déterminer les allèles d'un marqueur lié à l'allèle muté (...du gène impliqué dans la famille étudiée), nous allons déterminer les allèles de PLUSIEURS marqueurs liés à l'allèle muté = HAPLOTYPE lié à l'allèle muté. Haplotype = combinaison d'allèle «verticalement» sur un même chromosome. VI. Haplotypes Comment déterminer les haplotypes à partir des données brutes? 1) Démarche Les indispensables : Connaître l'ordre des marqueurs sur le chromosome. Connaître les génotypes des individus. Disposer de l'arbre généalogique. 12/24

13 A partir de maintenant, je vais essayer d'être clair, c'est une espèce de jeu de logique, style sudoku. 2) Les étapes 1-Disposer les chromosomes : On considère que c'est un autosome. 13/24

14 2- Ordonner les marqueurs 3- Placer les homozygotes On fait toujours par rapport au tableau Pour l'instant on construit l'arbre. 14/24

15 4- Identifier les individus de la famille car ils se transmettent les chromosomes. 5- Ordonner les chromosomes Le père à gauche et la mère à droite, ou inversement, mais c'est important de toujours faire dans le même ordre pour ne pas s'embrouiller. 15/24

16 6- Commencer par le haut On peut commencer aussi par le bas, mais c'est nettement plus facile par le haut. A chez la grand mère, elle est 1 / 2. Comme c'est le premier, on sait pas si 1 vient du père ou de la mère. Ceci ce complique quand on passe au locus de B, car après il y a un seul haplotype. On regarde les enfants. Le garçon II/2 est 3/1, donc le 3 vient du père et le 1 de la mère. La fille II/3 est 3/2, donc le 3 vient du père et le 2 vient de la mère. Idem pour le garçon II/5 et la fille II/7. 16/24

17 On fait alors la génération III. Et donc on place le 1 qui vient du père II/ 2 pour les enfants III/1 et III/2 et les chromosomes qui viennent de la pièce rapportée. On fait ça aussi pour les autres. A partir de là, on a fait le premier locus. 17/24

18 Maintenant ça se complique, avec le locus de B. Le grand père est 2/4, et comme il est homozygote sur le locus de A, on le place facilement. Pour la grand mère qui est 1 / 2 sur A, donc elle est soit A1B1/A2B3 ou alors A1B3/A2B1. Pour trancher, on regarde les enfants. Le premier fils a hérité d'un 2 de son père et d'un 3 de sa mère. Donc le 1 et le 3 sont sur le même chromosome (sauf recombinaison). On fait la même chose avec sa soeur, et elle est 1/2, le 2 vient forcément du père, et le 1 de la mère. Et on fait ça de proche en proche. Et on monte et on descend. Quand on part d'en haut, il y a seulement 2 chromosomes. 18/24

19 3) Exemples Petit exercice tout simple : Il suffisait de lire les 3 premières lignes pour pouvoir pratiquement tout remplir. L'individu II/1 est 1/5 au premier locus. Le 1 vient obligatoirement du père et le 5 de la mère. En B, il est 1/3, or le 1 vient forcément du père et le 3 vient donc de la mère. La même pour le 3ème, le 2 vient forcément du père, et le 1 vient de la mère. On a déjà un chromosome, et après par différence, on complète les autres et on arrive à faire les chromosomes 19/24

20 grand-parentaux. Et à la dernière génération, il y a un recombinant. Les deux diapos suivantes sont à titre indicatif car elles ont été sautées par le prof. 20/24

21 Exercice 2 : recherches de paternité. Pour le gène LDLR, l'enfant est homozygote donc les parents doivent être A/A ou A/B. Les 2 pères sont probables. Pour le gène GYPA, l'enfant est B/B et la mère est B/B. Le père doit être A/B ou B/B. Or le père 2 n'est pas compatible. On continu, et on trouve que les pères potentiels sont tous compatibles pour les autres gènes. On exclue le père 2 car il n'est pas compatible avec le gène GYPA. Le bon père est le N 1. 21/24

22 Pour le cas n 2, la méthode est la même, c'est-à-dire qu'on raisonne gène par gène et on recherche si un deux 2 pères est incompatible. Donc dans ce cas, le père 1 n'est pas compatible pour le gène LDLR car l'enfant est AB, la mère BB, donc le père de cet enfant devra être soit AB soit AA. Or le père 1 est BB. Le bon père est le N 2. CQFD En pratique, on ne se contente pas d'1 seul marqueur. Plus on utilise de marqueurs, plus on a de chances de mettre en évidence des incompatibilités paternelles... et donc plus on augmente la certitude de paternité pour l'autre père! Il faut quand même avouer que c'est vachement important d'avoir des résultats fiables si on veut éviter certains quiproquos ;-) 22/24

23 Fini, j'ai pas le temps pour faire une petite dédicace, donc je remercie Jessica pour les photos, et je suis vraiment désolé si vous êtes pas arrivé à comprendre, mais je pense que quelqu'un de «matheux» dans votre entourage peut vous aider. Quelques petits conseils du prof : les réponses aux premières questions sont souvent soit dans l'énoncé direct, soit dans les questions suivantes. «En génétique nous sommes des personnes gentilles». Il faut savoir faire un haplotype : «ce n'est pas exclut que ça soit à l'exam». 23/24

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