Mécanismes moléculaires contrôlant le cycle cellulaire : aspects fondamentaux et implications en cancérologie

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1 Cancer/Radiother 2001 ; 5 : Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés S /SSU Mise au point Mécanismes moléculaires contrôlant le cycle cellulaire : aspects fondamentaux et implications en cancérologie J.F. Viallard 1,2 *, F. Lacombe 2, F. Belloc 2, J.L. Pellegrin 1, J. Reiffers 2 1 Service de médecine interne et maladies infectieuses, centre François-Magendie, hôpital du Haut-Lévêque, 5, avenue Magellan, Pessac, France ; 2 laboratoire de greffe de moelle, UMR-CNRS 5540, université Victor-Segalen, 146, rue Léo-Saignat, Bordeaux, France (Reçu le 16 juin 2000 ; accepté le 13 décembre 2000) RÉSUMÉ Introduction. La connaissance des mécanismes régulant la division des cellules eucaryotes a progressé très rapidement au cours des dernières années et les molécules régulatrices du cycle cellulaire jouent un rôle de plus en plus important dans les processus cancéreux. Nous nous proposons dans cette revue de décrire les principaux mécanismes de contrôle du cycle cellulaire. Nous aborderons, par quelques exemples, les liens entre la dérégulation du cycle cellulaire et l oncogénèse. Actualités et points forts. Le cycle cellulaire des cellules de mammifères est divisé en quatre phases survenant selon un ordre établi, chaque phase ne pouvant débuter que si la précédente est totalement terminée. Le déroulement correct des phases successives du cycle cellulaire est assuré par une famille de kinases sérine thréonine dites kinases dépendantes des cyclines (CDK). La chronologie de leur activation est déterminée par leurs modifications post-traductionnelles (phosphorylations/déphosphorylations), et par l association à une cycline, qui constitue la sous-unité régulatrice du complexe enzymatique. On distingue les cyclines dites G 1 (cyclines C, D1-3 et E) qui contrôlent la progression en phase G 1 et la transition G 1 /S, et les cyclines dites mitotiques (cyclines A et B) qui interviennent à la transition G 2 /M et en mitose. Les complexes cycline/cdk activés phosphorylent (et en conséquence inhibent), entre autres, la protéine suppresseur de tumeur prb qui bloque le passage vers la phase S en réprimant l activité transcriptionnelle des facteurs de la famille E2F. Les cyclines D et leurs partenaires CDK4 et CDK6 ont des propriétés pro-oncogènes mais leur fonction est régulée par une série d inhibiteurs qui se lient à eux et inhibent leur activité kinase. On distingue les membres de la famille INK4 *Correspondance et tirés à part. Adresse jean-françois.viallard@chu-bordeaux.fr (J.F. Viallard). (p16 INK4A, p15 INK4B, p18 INK4C, p19 INK4D ) qui interagissent spécifiquement avec CDK4 et CDK6, et les membres de la famille CIP/KIP (p21 CIP1/WAF1, p27 KIP1 et p57 KIP2 ) qui inhibent un grand nombre de CDK. L interaction entre p16 INK4A, cycline D/CDK, et prb/e2f constitue une unité fonctionnelle connue sous le nom de «voie prb». Chacun des composants de cette voie peut être déréglé dans un processus cancéreux, et de plus en plus de données désignent cette voie comme une cible obligatoire des étapes de l oncogénèse dans pratiquement tous les cancers. Perspectives et projets. Les progrès réalisés dans la connaissance des mécanismes régulateurs du cycle cellulaire ont permis une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la cancérisation. Ces progrès ont débouché sur la découverte de nouveaux leviers thérapeutiques, et de nouvelles molécules sont en développement. Enfin, le rôle des molécules régulatrices du cycle dans d autres pathologies que le cancer est probable et reste à définir Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS cycle cellulaire / cycline / inhibiteurs des CDK / kinases dépendantes des cyclines (CDK) ABSTRACT Molecular mechanisms controling the cell cycle: main considerations and implications in oncology. Introduction. Comprehension of cell cycle regulation mechanisms has progressed very quickly these past few years and regulators of the cell cycle have gained widespread importance in cancer. This review first summarizes major advances in the understanding of the control of cell cycle mechanisms. Examples of how this control is altered in tumoral cells are then described. Current knowledge and key points. The typical mammalian cell cycle consists of four distinct phases occurring in a well-defined order, each of which should be completed

2 110 J.F. Viallard et al. successfully before the next begins. Progression of eukaryotic cells through major cell cycle transitions is mediated by sequential assembly and activation of a family of serinethreonine protein kinases, the cyclin dependent kinases (CDK). The timing of their activation is determined by their post-translational modifications (phosphorylations/ dephosphorylations), and by the association of a protein called cyclin, which is the regulatory subunit of the kinase complex. The cyclin family is divided into two main classes. The G 1 cyclins include cyclins C, D1-3, and E, and their accumulation is rate-limiting for progression from the G 1 to S phase. The mitotic or G 2 cyclins, which include cyclin A and cyclin B, are involved in the control of G 2 /M transition and mitosis. The cyclins bind to and activate the CDK, which leads to phosphorylation (and then inhibition) of the tumor suppressor protein, prb. prb controls commitment to progress from the G 1 to S phase, at least in part by repressing the activity of the E2F transcription factors known to promote cell proliferation. Both the D-type cyclins and their partner kinases CDK4/6 have proto-oncogenic properties, and their activity is carefully regulated at multiple levels including negative control by two families of CDK inhibitors. While members of the INK4 family (p16 INK4A, p15 INK4B, p18 INK4C, p19 INK4D ) interact specifically with CDK4 and CDK6, the CIP/KIP inhibitors p21 CIP1/WAF1, p27 KIP1 and p57 KIP2 inhibit a broader spectrum of CDK. The interplay between p16 INK4A, cyclin D/CDK, and prb/e2f together constitute a functional unit collectively known as the prb pathway. Each of the major components of this mechanism may become deregulated in cancer, and accumulating evidence points to the prb pathway as a candidate obligatory target in multistep oncogenesis of possibly all human tumor types. Future prospects and projects. Major advances in the understanding of cell cycle regulation mechanisms provided a better knowledge of the molecular interactions involved in human cancer. This progress has led to the promotion of new therapeutic agents presently in clinical trials or under development. Moreover, the components of the cell cycle are probably involved in other non-cancerous diseases and their role must be defined Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS cell cycle / cyclin / cyclin dependent kinase (CDK) / inhibitors of CDK Jusqu au XIX e siècle, les scientifiques n avaient qu une vague idée des éléments qui constituent les êtres vivants et de la façon dont ceux-ci peuvent se développer et croître. En 1665, l Anglais Robert Hooke avait bien décrit les unités microscopiques qu il discernait, avec un microscope de sa fabrication, dans des coupes de liège. Il les nomma cellules, du latin cellula, petite chambre. À la fin des années 1830, deux Allemands, le botaniste Matthias Schleiden ( ), puis le zoologiste Théodor Schwann ( ), ont proposé la «théorie cellulaire» faisant de la cellule l unité de base de tout organisme vivant. En 1858, l Allemand Rudolf Virchow ( ) a complété cette théorie en formulant le célèbre axiome : «toute cellule provient d une cellule», conduisant au concept de multiplication cellulaire par division. L œuf issu de la fécondation d une cellule sexuelle femelle par un gamète mâle, et qui donne naissance à un embryon à partir duquel se construit, division après division, un organisme aussi complexe que l homme, est devenu, à la fin duxix e siècle, le symbole de ce processus vital. Cependant, au cours du développement embryonnaire, les cellules se différencient pour permettre la formation des divers organes. Au cours de ce processus, la division cellulaire est inhibée dans certaines régions de l embryon. De même, chez les organismes pluricellulaires adultes, il existe une hétérogénéité parmi les cellules. Certaines cellules différenciées ne se divisent plus (cellules du muscle squelettique par exemple), d autres continuent à se diviser pendant toute la vie de l organisme (c est le cas des cellules souches hématopoïétiques), d autres enfin ne se divisent que pour réparer une lésion ou compenser la mort d autres cellules (cellules de la peau par exemple). Toutes ces différences ne peuvent s expliquer que par l existence d un mécanisme de contrôle de la division cellulaire. Il fallait donc identifier les molécules participant à la croissance et à la division de la cellule pour ensuite élucider les mécanismes de régulation du cycle de division. Ces molécules ont été découvertes dans les levures, les œufs d amphibiens puis dans les cellules de mammifères. Les 15 dernières années ont connu une véritable explosion des connaissances des mécanismes qui régulent le cycle cellulaire. Cela a permis de proposer des principes généraux qui semblent régler la division cellulaire chez des êtres vivants aussi différents que l homme, la levure de bière (saccharomyces cerevisiae) ou encore la levure fissile (saccharomyces pombe). Du coup ces découvertes ont ouvert la voie à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la cancérisation qui découle de la multiplication de cellules anormales. Le déroulement ordonné des différentes phases du cycle cellulaire ainsi que leur régulation par les stimuli intra- et extracellulaires sont régulés par des protéines sérine/thréonine kinases : les kinases dépendantes des cyclines ou CDK (cyclin dependent kinase) [120]. Les CDK subissent des phosphorylations qui modulent leur activité. Cette activité est de plus dépendante de l association avec des protéines appelées cyclines dont l expression (synthèse et dégradation) est régulée lors de la progression dans le cycle. À ce jour, pas moins de huit CDK (CDK1 à CDK8) et huit différents types de cyclines ont été mis en évidence et clonés chez les mammifères. Enfin, l activité des CDK est négativement régulée par des inhibiteurs (cyclin dependant kinase inhibitor ou CKI). Ainsi,

3 les mécanismes de régulation du cycle font intervenir trois groupes de protéines : les CDK, les cyclines et les CKI. Nous nous proposons dans cette revue de décrire les principaux aspects fondamentaux qui régissent la progression dans le cycle cellulaire. Par ailleurs, nous verrons, par quelques exemples, quelles répercussions les altérations survenant dans ces mécanismes contribuent au processus de cancérisation. Il ne s agit pas ici de faire une revue exhaustive mais d apporter les bases fondamentales nécessaires à la compréhension du rôle oncologique des protéines du cycle cellulaire. LES ÉTAPES DU CYCLE CELLULAIRE Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 111 Les eucaryotes, de la levure à l homme, ont des cycles de division similaires. Les premières études par microscopie optique ont permis de définir cinq étapes dans le cycle cellulaire : G 0,G 1,S,G 2 et M (figure 1). G 1 signifie «pause 1» (gap = pause, d où le G) car il s agit d une pause dans le cycle durant laquelle on n observe, au microscope, aucun phénomène lié au cycle cellulaire. La plupart des cellules adultes, différenciées, ne se divisant pas, se trouvent en phase G 1 ou en état de quiescence qui définit la phase G 0. S signifie «synthèse» d ADN. C est pendant cette phase que les chromosomes se répliquent. Le brin nouvellement synthétisé est exactement complémentaire à la matrice. G 2 signifie «pause 2», c est le second arrêt du cycle cellulaire, la cellule se préparant à la mitose. L étape M est la mitose. Les chromosomes se condensent et deviennent visibles sous la forme d entités indépendantes. Les deux organisateurs des microtubules, ou corps polaires, se déplacent pour se retrouver chacun d un côté du noyau. Des faisceaux de microtubules se développent à partir des corps polaires pour former le fuseau mitotique. Quelques-uns de ces microtubules s attachent aux kinétochores des chromosomes qui, ainsi attachés, s alignent alors sur la plaque métaphasique qui est un plan situé àmi-chemin entre les corps polaires. Lorsque tous les kinétochores sont attachés aux microtubules et alignés sur la plaque métaphasique, un signal est donné et l anaphase débute. Les chromosomes commencent à se déplacer vers les pôles qui s éloignent par ailleurs l un de l autre. Enfin, la cellule se divise (c est la cytodiérèse) pour produire deux cellules filles en phase G 1. LA NOTION DE POINT DE RESTRICTION Une cellule ne peut entrer en cycle que sous l effet de facteurs stimulateurs appelés mitogènes. Pendant la phase G 1, la cellule décide si elle continue à progresser dans le cycle cellulaire, ce qui aboutira à la division cellulaire, ou si elle quitte le cycle et entre alors dans un état de quiescence (G 0 )oudedifférenciation. Les mécanismes qui Figure 1. Les étapes du cycle cellulaire. contrôlent la croissance cellulaire et la différenciation dans les organismes multicellulaires semblent donc liés à la machinerie du cycle cellulaire présente en phase G 1. Ilya20ans, Temin a montré que des cellules de poulet deviennent indépendantes des signaux mitogènes extérieurs plusieurs heures avant d entrer en phase S [166]. Cette notion a été reprise et développée plus tard par Pardee qui a introduit le terme de point de restriction (R) [113]. R est le moment de G 1 après lequel les cellules peuvent proliférer indépendamment des stimuli extérieurs. La progression en début de phase G 1 des cellules qui sortent de la mitose (cellules dites postmitotiques, pm) est rapidement interrompue si on enlève les facteurs de croissance du milieu de culture ou si on inhibe la synthèse protéique (20 à 50 % d inhibition) [184]. Néanmoins, au-delà d un certain temps après la mitose (qui diffère selon le type de cellule, fibroblastique ou épithéliale par exemple) les cellules ne s arrêtent plus, même si les facteurs mitogènes sont retirés du milieu, mais avancent et effectuent un cycle complet. On distingue donc les cellules dites G 1 -pm (cellules postmitotiques arrêtées par la privation en facteurs de croissance) et les cellules dites G 1 -ps (préphase S) qui sont capables d initier une réplication de l ADN en absence de facteurs mitogènes (figure 2). La transition qui fait passer une cellule de la phase G 1 -pm à la phase G 1 -ps correspond au terme anglo-saxon commitment :c est l engagement irréversible de la cellule vers un cycle chromosomique complet. Cette transition correspond au point R dit de restriction. LES CYCLINES Les cyclines sont une famille de protéines qui subissent des variations de leur taux au cours du cycle et qui partagent toutes un degré de similitude quant à leur composi-

4 112 J.F. Viallard et al. Figure 2. Modèle du cycle cellulaire basé sur des expériences faites sur des fibroblastes humains. Les cellules sortent de la mitose et entrent à nouveau en phase G 1 -pm. La progression jusqu au point R est dépendante des facteurs de croissance (FC). Si les FC sont enlevés du milieu, les cellules entrent dans un état de quiescence (G 0 ). Lorsque les FC sont réintroduits, les cellules retournent au même point de la phase G 1 -pm qu elles ont quitté lors de leur entrée en quiescence (d après Zetterberg et al. [184]). tion en acides aminés. En effet, les cyclines sont définies par une région commune d environ 100 acides aminés appelée cyclin box qui sert à lier et à activer les CDK [68, 78] (figure 3A). On distingue d une part les cyclines dites «START» ou G 1 qui atteignent leur pic d expression en phase G 1 (cycline C, cyclines D : D1, D2 et D3) ou à la transition G 1 /S (cycline E) et d autre part les cyclines dites mitotiques (cyclines A et B) dont le pic d expression se situe en G 2 /M [119]. La figure 3B est un exemple du profild expression des principales cyclines dans la lignée HeLa au cours du cycle cellulaire. Ces deux types de cyclines varient dans leur structure générale : les cyclines mitotiques ont environ 200 acides aminés situés dans la partie N-terminale (figure 3A) alors que les cyclines START s étendent en C-terminal pour former une région riche en proline, acide glutamique, sérine Figure 3. A : schéma général de la composition des cyclines. B : exemple d expression des cyclines au cours du cycle cellulaire dans la lignée cellulaire HeLa.

5 Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 113 et thréonine appelée «PEST». Cette région PEST joue un rôle dans le renouvellement rapide de ces cyclines et leur confère une demi-vie très courte [69, 80]. Les cyclines D Les cyclines de type D sont au nombre de trois et sont les premières à apparaître lors d une stimulation par des mitogènes. Elles sont synthétisées tout au long de la stimulation tant que le facteur de croissance reste dans le milieu si bien que les taux des cyclines D varient peu au cours du cycle, avec néanmoins un pic d expression en G 1 S. Inversement, dès que le mitogène est retiré du milieu, les cyclines D sont rapidement détruites, quelle que soit la position de la cellule dans le cycle [151] : si la cellule a dépassé le point R, leur destruction est sans effet ; si la cellule est en G 1, la destruction des cyclines D empêche la cellule d aller plus loin dans le cycle. Leur synthèse débuteendébut de G 1 et leur activité sur les kinases ne se fait qu en milieu de G 1 et augmente au fur et à mesure que les cellules approchent de la transition G 1 -S [92, 96]. Les partenaires catalytiques majeurs des cyclines D sont CDK4 et CDK6 [4, 92, 96]. La fonction primaire des cyclines D est de stimuler la progression en phase G 1.Endépit de leur similitude, les membres de la famille des cyclines D sont différemment exprimés selon la lignée cellulaire. Ainsi, la cycline D1 est absente des cellules de la lignée lymphoïde [1]. La cycline E La cycline E est une protéine nucléaire de 50 kd dont l expression est maximale en fin de phase G 1, aprèsl augmentation des cyclines D [69]. Elle agit en fin de phase G 1 en se complexant avec CDK2 [24, 70]. Le complexe cycline E/CDK2 a une forte activité kinase juste avant l entrée des cellules en phase S et phosphoryle la protéine du rétinoblastome (prb) [49, 169]. La surexpression de la cycline E raccourcit la durée de la phase G 1, diminue la taille de la cellule, diminue la dépendance aux facteurs de croissance et prolonge la durée de la phase S [106, 129]. Des cellules bloquées en phase G 1 débutent quand même la réplication de leur ADN quand la cycline E est surexprimée [129]. Des anticorps dirigés contre la cycline E injectés dans des cellules en phase G 1 inhibent l entréeen phase S [106]. Cette inhibition n a pas lieu si l injection se fait dans des cellules en phase S ce qui signifie que la cycline E est indispensable à la transition G 1 /S. Au cours de la phase S, l expression de la cycline E diminue car elle est dégradée par le protéasome après action de l ubiquitine [178]. Les cyclines mitotiques Les cyclines mitotiques comprennent la cycline A et la cycline B. Elles possèdent une séquence d acides aminés partiellement conservée (dénommée destruction box) située en partie N-terminale, indispensable à leur destruction rapide et soudaine spécifiquement pendant la mitose [39]. Cette destruction se fait par la voie de la protéolyse dépendante de l ubiquitine [161]. Le taux des cyclines mitotiques augmente progressivement au cours des phasessetg 2 pour atteindre un pic en mitose. Les cyclines A et B interagissent toutes les deux avec la kinase CDK1 pour déclencher la mitose et la dégradation de ces deux protéines est nécessaire pour que la cellule sorte de la mitose [98, 135]. Cependant, la synthèse et la destruction de la cycline A ont toujours lieu en avance par rapport à la cycline B [98, 135]. La cycline A La cycline A est une protéine de 60 kd qui apparaît à la transition G 1 /S. C est la première cycline qui a été clonée et séquencée [164]. Elle est située en position nucléaire [117]. Elle a d abord été considérée comme une cycline mitotique ne jouant un rôle qu à la transition G 2 /M, mais plusieurs expériences ont permis de démontrer que la cycline A agissait plus précocement dans le cycle cellulaire, étant détectée et activée dès lafin de la phase G 1 juste avant l entrée en phase S [7]. L activité kinase associée à la cycline A à la transition G 1 /S est celle de CDK2 et non pas CDK1 [28, 134]. La surexpression de la cycline A entraîne une entrée prématurée en phase S [133]. Les cyclines E et A sont nécessaires au passage en phase S mais ont des fonctions différentes. La cycline A serait utile pour débuter la réplication de l ADN. Le complexe cycline A/CDK2 se lie au facteur de transcription PCNA (proliferating cell nuclear antigen, qui est une sous-unité de la polymérase δ de l ADN intervenant dans la réplication et la réparation de l ADN) au niveau de certains sites de réplication de l ADN et l inhibition de la cycline A par des anticorps inhibe la synthèse de l ADN dans des cellules humaines [8, 109]. La cycline B Il existe trois cyclines B : B1, B2, B3. La cycline B1 est la mieux connue et joue un rôle important dans les mécanismes de déclenchement de la mitose. La cycline B1 est cytoplasmique pendant l interphase (en association avec les microtubules et les centrosomes) jusqu à la fin de la prophase où elle est transférée brutalement dans le noyau alors que la cycline A reste nucléaire [117, 118]. La cycline B1 est intéressante car c est une des premières protéines du cycle dont la régulation est non seulement temporelle mais aussi spatiale. En effet, les choses ne sont pas figées. La cycline B1 circule continuellement entre le

6 114 J.F. Viallard et al. noyau et le cytoplasme pendant l interphase [41, 42, 167]. Cependant, la cycline B1 s accumule dans le cytoplasme car l import nucléaire est contrebalancé par l export nucléaire qui est plus rapide. En effet, pendant l interphase, le complexe cycline B1/CDK1 est maintenu dans le cytoplasme grâce à l activité d un facteur nucléaire d exportation appelé CRM1 ou exportine. En position N-terminale, la cycline B1 possède un signal dit de rétention cytoplasmique (CRS) qui correspond à une région de 42 acides aminés [118]. Si on injecte dans le noyau de cellules HeLa en phase G 2, de la cycline B1 dépourvue du CRS, la protéine reste nucléaire. Le CRS est donc plus un signal d export nucléaire qu un signal de rétention cytoplasmique. Le CRS possède une région hydrophobe de 11 acides aminés hautement conservée parmi les cyclines de type B chez les mammifères. Dans cette région, il existe quatre résidus sérine qui, s ils sont phosphorylés, empêchent la reconnaissance du CRS par CRM1. En conséquence, c est la phosphorylation de ces quatre résidus sérine qui stoppe la sortie de la cycline B1 du noyau en prophase (figure 4). Les protéines kinases qui phosphorylent la cycline B1 en CRS pour réguler sa rétention nucléaire restent à identifier. Dès que la cycline B1 devient nucléaire, l enveloppe nucléaire explose, signifiant que le complexe cycline B1/CDK1 agit comme une kinase des lamines nucléaires. La cycline B1 se lie alors à l appareil mitotique, en particulier aux pôles du fuseau et à ses fibres principales. En début de métaphase, la cycline B1 s associe transitoirement aux chromosomes condensés. Dès l entrée en anaphase, la destruction de la cycline B1 s opère par la voie de la polyubiquitination ce qui est indispensable à l inactivation du complexe cycline B1/CDK1 et à la sortie de la mitose [39]. La destruction est initiée par le cyclosome [65]. Les cyclines virales Figure 4. La cycline B1 a une localisation cytoplasmique jusqu à la prophase (représentée en gris sur la figure). Il existe un va-et-vient permanent de la cycline B1 entre le noyau et le cytoplasme mais l import nucléaire (assuré par l importine β) est contrebalancé par l export nucléaire (assuré par CRM1) qui est plus rapide si bien que la cycline B1 est cytoplasmique. À la prophase, la phosphorylation de quatre résidus serine dans le site appelé CRS de la cycline B1 empêche la reconnaissance de la cycline B1 par CRM1 si bien que la cycline B1 devient nucléaire. Les virus du groupe herpès dérèglent le cycle cellulaire. Ainsi, l EBV (Epstein-Barr virus) immortalise les lymphocytes B en exprimant deux protéines, EBNALP et EBNA2 qui permettent une surexpression de la cycline D2 [156]. D autres mécanismes d action interviennent et notamment la sécrétion de cyclines dites virales. Des travaux récents ont été rapportés concernant l herpès virus 8 (HHV8) agent du sarcome de Kaposi, mais qui est également associéàla maladie de Castleman et à certains lymphomes survenant notamment chez les sujets infectés par le virus de l immunodéfiscience humaine (VIH). Le génomedel HHV8 contient plusieurs gènes qui partagent de grandes similitudes avec des gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire et de l apoptose [138]. Un de ces gènes qui code pour une protéine homologue aux cyclines de mammifères est dénommé cycline K [11]. Deux autres cyclines virales ont été également identifiées : la cycline V et la cycline M qui sont codées par des herpès virus contaminant des animaux [163]. Ces cyclines ont une homologie de séquence étroite avec les cyclines D ; par ailleurs, les cyclines K et V forment préférentiellement des complexes avec la kinase CDK6 [40]. Les cyclines virales ressemblent donc aux cyclines D tant par leur fonction que par leur séquence. Leur expression entraîne des dérèglements du cycle donnant un avantage prolifératif aux cellules infectées. Implications des cyclines en cancérologie Parmi les cyclines jouant un rôle dans la progression de la phase G 1 et dans le passage à la phase S (cyclines D, cycline E et cycline A), seules les cyclines D sont fréquemment impliquées dans les tumeurs. L exemple le plus marquant est l expression ectopique de la cycline D1 dans les lymphomes B (notamment les lymphomes du manteau folliculaire) [144]. Cette expression anormale est le plus souvent la conséquence de la juxtaposition du gène de la cycline D1 aux régions régulatrices des chaînes lourdes des immunoglobulines par une translocation t(11 ;14)(q13 ;q32). La cycline D1 a été la première cycline D àêtre identifiée dans les macrophages de souris [93]. Elle a également été identifiée comme le produit du gène PRAD1, un réarrangement connu dans les adénomes humains parathyroïdiens [101] (inversion du chromosome 11, le gène de D1 devenant lié au gène codant pour la parathormone,

7 Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 115 inv [11] [p15 ;q13]), le produit de l oncogène bcl-1 [176] (translocation 11 ;14 [q13 ;q32]). La translocation (11 ; 14) est caractéristique des lymphomes du manteau et déplace l enhancer du gène codant pour la chaîne lourde des immunoglobulines dans le locus de la cycline D1, laissant le codage de D1 ininterrompu. La cycline D1 est surexprimée dans beaucoup de cancers soit par amplification de son gène (43 % des carcinomes tête et cou, 34 % des carcinomes de l œsophage, 15 % cancers de la vésicule, 13 % des cancers du sein, 10 % des carcinomes bronchiques à petites cellules et des hépatocarcinomes) soit par translocations ciblant le locus de D1 sur le chromosome 11q13 [44]. La cycline D2 est codée par un gène situé sur le chromosome 12p13 [56]. Ce gène a été identifié comme le site d intégration d un provirus murin responsable d une leucémie T chez la souris et qui entraîne une surexpression de la cycline D2 [45]. La cycline D2 est parfois surexprimée dans certaines proliférations malignes telles que les hémopathies lymphoïdes chroniques B [18] ou dans les lymphocytes B transformés par l EBV [156]. La cycline D3 est codée par un gène situé sur le chromosome 6p21 [56]. Ce gène n a pas été identifié comme un proto-oncogène bien qu il soit réarrangé dans de multiples désordres lymphoprolifératifs. LES KINASES DÉPENDANTES DES CYCLINES (CDK) Toutes les kinases ont dans leur extrémité NH2 terminale une séquence xgxpxxxxrex (où x représente n importe quel acide aminé). Il s agit d une région conservée qui correspond au domaine de liaison aux cyclines [23, 30]. Les CDK sont au nombre de huit. CDK1 (ou p34 cdc2 ) est la première CDK décrite chez l homme. CDK1 est absente des cellules quiescentes. Dans les cellules qui prolifèrent, elle peut être détectée tout au long du cycle mitotique, mais son ARN messager (ARNm) varie au cours du cycle, avec un minimum en phase G 1 [37]. Dans de nombreux types cellulaires, la concentration de la protéine varie peu au cours de l interphase mais dans les cellules lymphoïdes humaines, celle-ci suit les mêmes variations au cours du cycle cellulaire que celles de son ARNm [177]. L activité enzymatique de CDK1 ne se manifeste que pendant une période très courte à la transition G 2 /M, entraînant le déclenchement de celle-ci. L initiation de la mitose est dirigée de façon temporelle et spatiale par une cascade de phosphorylation de protéines qui aboutit à l activation du complexe cycline B1/CDK1 [105]. Durant la phase S, CDK1 s associe à la cycline B synthétisée de novo. CDK1 peut aussi être activée par la cycline A avant l activation par la cycline B. CDK2 a une masse moléculaire de 33 kda. Son gène est localisé sur le chromosome 12 en 12q13 [19]. Elle acquiert une activité kinase en association avec la cycline A ou E [121, 19]. Le complexe cycline A/CDK2 développe une activité kinase dès la phase G 1 tardive jusqu à la métaphase, quand la cycline A est détruite. L activité kinase du complexe cycline E/CDK2 se manifeste aussi dès la phase G 1, atteint son maximum en début de phase S, puis disparaît [121, 19]. Cette kinase, en association avec la cycline E, est indispensable à la mise en route de la réplication de l ADN [169]. Durant la phase S, la cycline E est remplacée dans ce complexe par la cycline A [77]. À la différence de la plupart des CDK connues, CDK4 n a pas d activité kinase sur les histones H1. Son gène est localisé sur le chromosome 12 en 12q13, dans la même région que CDK2 [19]. Ses partenaires régulateurs sont les cyclines D [91]. Le complexe cycline D1/CDK4 devient actif comme kinase au milieu de la phase G 1, avec une activité maximale à la transition G 1 /S, et reste détectable jusqu à la mitose [92]. Les souris knock-out pour CDK4 sont viables, mais sont de petite taille et stériles [128]. Ces souris développent un diabète en raison d un déficit en cellules pancréatiques. CDK4 pourrait être un régulateur spécifique de certains types de cellules. CDK5 est retrouvée à des taux élevés dans les neurones et joue un rôle essentiel dans le métabolisme cérébral. CDK5 est particulière car elle n est pas activée par une cycline et possède des activateurs qui lui sont propres [146]. CDK6 est une protéine de 40 kda formant des complexes avec toutes les cyclines D. Elle a une activité kinase sur prb. Après la stimulation des lymphocytes T par la PHA, cette activité se manifeste dès le milieu de la phase G 1 [96]. CDK7 phosphoryle CDK1, CDK2 et CDK4 respectivement sur les résidus thréonine (Thr) 161, 160 et 172, ce qui conditionne leur activation comme kinase des histones H1. Elle se lie à la cycline H et subit une phosphorylation sur la Thr 170 pour acquérir l activité kinase (homologie avec les Thr 161 de CDK1, 160 de CDK2 et 172 de CDK4 toutes faisant l objet de phosphorylations activatrices). Le complexe cycline H/CDK7 est dénommé CAK (CAK : CDK activating kinase). Ni l expression de la protéine CDK7, ni son activité enzymatique ne varient au cours du cycle mitotique des cellules proliférantes, ce qui suggérerait un mécanisme particulier gouvernant son action sur les autres CDK [14]. CDK8 est le partenaire CDK de la cycline C. Régulation de l activité CDK L activation d une CDK est régulée à trois niveaux : la liaison à une cycline,

8 116 J.F. Viallard et al. la phosphorylation, la liaison à des protéines aux fonctions variables mais en général inhibitrices. La liaison à une cycline est indispensable Une CDK a une structure bilobaire [15, 66, 67] et lie son substrat et l ATP dans une partie située entre les deux lobes. Dans sa forme inactive monomérique, une CDK se lie à l ATP dans une conformation qui rend impossible une attaque nucléophilique par un substrat hydroxyle sur le pont β-γ phosphate de l ATP. De plus, une partie conservée de la kinase (appelée boucle T), cache la fente catalytique et empêche la liaison aux substrats. La liaison à une cycline entraîne un changement de conformation de la CDK (figure 5A). Par exemple, en se liant à la kinase CDK2, la cycline A modifie l orientation de l ATP dans la fente catalytique et provoque un déplacement de la boucle T [58, 60]. Ces deux événements ont pour conséquence une neutralisation des deux facteurs principaux qui gardent CDK2 dans une forme inactive. Les régions de la cycline A et de CDK2 qui interagissent entre elles sont conservées parmi les autres membres des cyclines et des CDK. La liaison à la cycline permet la phosphorylation La liaison à la cycline ne suffit pas pour activer une CDK (figure 5A). La liaison à une cycline fait qu une CDK devient accessible à l action du complexe CAK qui phosphoryle un résidu thréonine (Thr161 pour CDK1, 160 pour CDK2) dans la boucle T [90]. La boucle T devient ainsi positionnée en situation C-terminale loin de la fente catalytique ce qui, dans l exemple concernant CDK2 et la cycline A, stabilise le complexe cycline A/CDK2 [58]. Il existe une phosphatase qui réverse la phosphorylation de la boucle T en Thr par CAK : c est la KAP (CDKassociated phosphatase) [46, 125]. KAP peut se lier aux complexes cycline/cdk, mais peut déphosphoryler une CDK seulement si elle est monomérique. Donc la déphosphorylation d une CDK ne peut nécessairement que suivre la dégradation de la cycline. La phosphorylation d une CDK n est pas forcément synonyme d activation. Seule la phosphorylation de Thr (160 ou 161 selon la kinase) est activatrice. La phosphorylation de Thr14 et tyrosine (Tyr) 15 (qui s effectue par des kinases telles que wee1 ou Myt1 ou Mik1 selon les espèces) inhibe la CDK (figure 5B). Pour être active, une CDK doit donc être déphosphorylée sur la Thr 14 et la Tyr 15 ; c est le rôle de CDC25 qui est une phosphatase [25, 141]. L activité kinase n apparaît que lorsque la phosphatase codée par le gène CDC25 déphosphoryle ces deux acides aminés, débloquant ainsi l enzyme. Le début de la mitose est donc déclenchée par l activation de CDC25 et l inactivation de Wee1 (kinase qui phosphoryle la Tyr15). Il existe trois isoformes de CDC25 [38] : A, B et C. Figure 5. A : activation d une CDK grâce à la liaison à une cycline et grâce à l action de CAK. B : exemple de régulation de l activation de CDK1. CDK1 est activée si plusieurs conditions sont réunies : la liaison à une cycline, la phosphorylation en Thr161 par CAK et l absence de phosphorylation en Thr14 et Tyr15. La phosphorylation de ces deux derniers résidus se fait par des kinases dont le nom varie selon les espèces. CDC25A est impliquée dans la transition G 1 /S ; CDC25B et C sont impliquées dans l initiation de la mitose. LA PROTÉINE DU RÉTINOBLASTOME (prb) prb gardienne du point R La protéine du rétinoblastome (prb) est une sorte de gardienne moléculaire qui empêche la progression en phase G 1 [175]. prb semble agir au point R : c est la gardienne de la porte du point R après lequel la cellule est engagée irréversiblement dans les autres phases du cycle et donc la division cellulaire. prb est hypophosphorylée (forme

9 Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 117 Figure 6. Les complexes cycline/cdk, en phosphorylant prb en finde phase G 1, rendent possible l expression des gènes dépendants des facteurs de transcription de la famille E2F. active de la molécule) lors de la première partie de G 1 et devient hyperphosphorylée (et donc inactive) aux alentours du point R. La cellule, lorsqu elle arrive au point R, ne peut progresser que si prb devient phosphorylée. Selon le schéma le plus probable, les complexes cyclines D/CDK4-CDK6 et cycline E/CDK2 phosphorylent prb, inhibant ainsi son activité antiproliférative. Seules les cyclines de type D (pas les cyclines E ni A) peuvent se lier directement à prb [22, 31]. Il est probable que prb reste phosphorylée au cours des phases S, G 2 et M par les CDK dépendantes des cyclines A et B, et ne se déphosphoryle qu une fois la mitose terminée, les cellules migrant vers la phase G 1 (ou G 0 ). prb se lie aux membres de la famille E2F prb sous forme déphosphorylée exerce une action antiproliférative par son association aux facteurs de transcription de la famille E2F et les empêche ainsi de transactiver des gènes nécessaires à la réplication de l ADN. La phosphorylation de prb, en fin de phase G 1 libère les facteurs E2F de l action inhibitrice de prb (figure 6) [87, 162]. En effet, prb contrôle l activité de plusieurs protéines notamment celles de la famille E2F qui sont des facteurs de transcription régulateurs de la transcription de plusieurs gènes requis pour la progression à travers le cycle cellulaire (par exemple les gènes codant pour la thymidine kinase ou pour les cyclines A ou E) ou impliqués dans la réplication de l ADN (gènes codant par exemple pour l ADN polymérase α ou PCNA) [17, 79, 102, 103]. Les protéines E2F sont des hétérodimères composés d une molécule E2F (E2F-1 à E2F6) et d une des protéines de la famille DP (DP1 ou DP2) [74]. La formation de cet hétérodimère est importante pour la liaison à l ADN et la transactivation des gènes. L activité des facteurs E2F est très strictement contrôlée au cours du cycle cellulaire : ils sont inactifs pendant les deux premiers tiers (environ) de la phase G 1 (car les facteurs E2F sont liés à prb) ; ils sont activés lorsque la cellule passe le point de restriction R. La molécule qui contrôle les facteurs E2F et autorise leur activation est prb qui se lie physiquement au domaine transactivateur des protéines E2F. Cette interaction se fait via la région de prb dans laquelle sont localisées la plupart des mutations observées dans les tumeurs, la «poche A/B» [174]. La «poche A/B» est également le domaine de prb avec lequel interagissent certaines protéines transformantes qui inactivent prb, comme l antigène T de SV40 ou la protéine E1A de l adénovirus. prb est donc un répresseur de la transcription qui masque le domaine transactivateur des facteurs E2F avec lequel la protéine prb interagit directement, les empêchant ainsi de remplir leur fonction transactivatrice. La phosphorylation de prb libère les protéines E2F leur permettant de se lier aux promoteurs des gènes cités. La transcription peut avoir lieu et la progression dans le cycle se poursuit au-delà du point R. Les protéines E2F ont un rôle primordial dans la transition de G 1 à S, le facteur E2F-1 pouvant par exemple à lui seul promouvoir l entrée en phase S de fibroblastes quiescents [59]. Le promoteur de E2F-1 a plusieurs sites de fixation pour les autres facteurs E2F, suggérant que E2F-1 régule sa propre expression d une façon dépendante du cycle, provoquant alors une forte augmentation des taux des protéines E2F libres en fin de phase G 1 [26]. Une fois la cellule passée en phase S, les membres de la famille E2F sont inactivés. Les complexes cycline A/CDK2 (pas les complexes cycline E/CDK2 qui n ont pas cette fonction) se lient aux membres de la famille E2F et phosphorylent DP-1, empêchant ainsi leur liaison à l ADN [71, 72]. LES INHIBITEURS DES KINASES DÉPENDANTES DES CYCLINES (CKI) Quelle stratégie la cellule peut-elle mettre en jeu pour freiner l activité kinase des complexes cycline/cdk? Durant l année 1993, une réponse à cette question a été apportée par la mise en évidence dans les cellules de mammifères d une série de petites protéines capables de lier les complexes cycline/cdk et d inhiber leur activité kinase. Cela fournit à la cellule un moyen d inhiber les complexes cycline/cdk en réponse à divers stimuli et réduit ses possibilités de passer le point R. Ces protéines inhibitrices peuvent participer à la régulation du cycle cellulaire en retardant l activation des divers complexes cycline/cdk spécifiques de G 1 /S jusqu au temps adéquat

10 118 J.F. Viallard et al. et en assurant leur mise en œuvre ordonnée. Ainsi, une lésion de l ADN déclenche l accumulation de p53 qui induit l expression de p21 WAF1/CIP1 qui se lie à tous les complexes cycline/cdk, et l arrêt eng 1 permettant la réparation de l ADN [139]. Deux grandes familles d inhibiteurs des complexes cycline/cdk ont été décrites. La famille des inhibiteurs KIP/CIP (pour CDK inhibiting protein) est constituée des protéines p21 WAF1/CIP1 (p21), p27 KIP1/ICK/PIC2 (p27) et p57 KIP2. Ces protéines partagent la propriété d inhiber la plupart des complexes cycline/cdk. À l opposé, les protéines de la famille INK4 (pour INhibitor of CDK4), p16 INK4a/MTS1/CDKN2/CDK4I (p16), p15 INK4b/MTS2, p18 INK4c/INK6A, et p19 INK4d/INK6B inhibent spécifiquement CDK4/6. Chacune de ces protéines est codée par un unique gène et constituent ainsi les principaux régulateurs de la phosphorylation de prb. La famille des inhibiteurs KIP/CIP Les protéines de cette famille sont nucléaires et ont toutes la propriété de réprimer l activité de toutes les CDK de façon universelle. Leur action d inhibition se fait par l intermédiaire d un domaine situé en position N-terminale et relativement conservé entre les trois protéines [122, 168]. La fixation de p27 sur une CDK entraîne des changements de conformation du domaine catalytique de la CDK bloquant ainsi l accès à l ATP [137]. Par ailleurs, les trois protéines de cette famille CIP/ KIP dirigent les complexes cycline D/CDK vers le noyau. p21 CIP1/WAF1 p21 est indispensable à l arrêt du cycle cellulaire au point de contrôle G 1 en réponse à des lésions de l ADN [20]. Elle inhibe en effet la progression du cycle cellulaire en se liant, par son domaine aminoterminal, aux complexes cycline/cdk de la phase G 1 et, par son domaine carboxyterminal, à l antigène nucléaire PCNA, bloquant ainsi l activation de l ADN polymérase δ [9]. Des études plus récentes ont montré que, parallèlement à cette action antiproliférative, p21 exerce aussi une action antiapoptotique [57, 159]. L ARNm codant pour la protéine p21 est induit dans les fibroblastes durant la transition de G 0 à G 1 [81]. p21 se lie aux complexes cycline D/CDK4 et cycline E/CDK2 durant la phase G 1 donnant à penser qu elle agirait comme un facteur d union de la cycline et de la kinase. Alors que les complexes ne contenant qu une seule molécule de p21 sont actifs (activité catalytique), ceux qui en contiennent plusieurs sont inactifs et les changements dans la stœchiométrie de p21 sont suffisants pour rendre compte de cette conversion [185]. En effet, des complexes p21-cdk2-cycline A existent sous forme active ou inactive selon la stœchiométrie de p21, l effet inhibiteur ne s exerçant que lorsque le taux de la protéine modulatrice devient supérieur à celui des complexes cycline/ CDK. Bien que la saturation du complexe par p21 puisse ainsi bloquer leur activation par CAK, p21 peut également inhiber l activité du complexe qui a déjà subi la phosphorylation par CAK. L expression de p21 est universelle et l expression de son gène est régulée par p53 [47, 180, 27]. Dans les cellules des patients atteints du syndrome de Li-Fraumeni (maladie caractérisée par une absence d expression de p53), p21 est absente des complexes cycline/cdk [182]. Inversement, la synthèse de p21 augmente quand p53 est induite par une lésion de l ADN (radiations ionisantes). En inhibant indirectement l activité CDK, p53 empêche la phosphorylation de prb et la libération des facteurs E2F. Dans les cellules normales, p21 se trouve dans un complexe quaternaire incluant la kinase, la cycline, p21 et PCNA [181]. p21 est capable d inhiber directement la réplication de l ADN dépendante de PCNA lors de l absence de complexes cycline/cdk [171]. p21 est donc un médiateur central du point de contrôle G 1 induit par p53. p27 kip1 Le gène codant pour p27 est localisé sur le chromosome 12p13 [124]. Il a été cloné par divers groupes [122, 157, 168] et son analyse structurale a été publiée en1996 [137]. p27 a été découvert dans les cellules épithéliales de poumon de vison (Mv1 Lu) par Koff et Massagué lors d études concernant l inhibition de la prolifération cellulaire par TGF-β. Le TGF-β induit un arrêt des cellules Mv1 Lu en fin de phase G 1 et empêche la phosphorylation de prb qui précède l entrée en phase S dans les cellules en cycle. En avril 1993, Koff et Massagué ont démontré que ces effets étaient la conséquence de l incapacité des cellules traitées par TGF-β de former des complexes cycline E/CDK2 actifs. C est une protéine dénommée p27 qui, en se liant aux complexes cycline E/CDK2, empêche leur activation par phosphorylation de CDK2 sur la Thr160. Mécanismes d action de p27 Dans les cellules quiescentes, les taux de p27 sont relativement élevés alors que ceux de p21 sont bas mais augmentent en réponse aux signaux mitogéniques durant la progression en G 1. La stimulation de lymphocytes T humains par l interleukine (IL)-2 entraîne une chute du taux de p27 [36]. p27 chute lors de la stimulation de macrophages par CSF1 (colony stimulating factor), mais la costimulation de ces mêmes cellules avec des substances analogues ou inducteurs d AMPc augmente le taux de synthèse de p27 empêchant l activation des complexes cyclines D/CDK et entraînant l arrêt eng 1 [63].

11 Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 119 Figure 7. Représentation schématique de la régulation des protéines CIP/KIP. Après stimulation mitogènique, les complexes cycline D/CDK séquestrent les protéines CIP/KIP ce qui empêche ces dernières d inhiber les complexes cycline E/CDK qui dès lors peuvent phosphoryler prb. Les facteurs transcriptionnels de la famille E2F sont alors libérés et augmentent la transcription du gène de la cycline E. Les complexes cycline E/CDK phosphorylent alors les protéines CIP/KIP qui vont être détruites par le protéasome. Quand la cellule entre en cycle, p27 est captée par les complexes cyclines D/CDK. La séquestration des molécules de p21 et de p27 libres (non liées) par les complexes cycline D/CDK allège la contrainte des molécules CIP/ KIP sur les complexes cycline E/CDK2 facilitant ainsi l activation de ces derniers (figure 7). Il y a une compétition entre les complexes cycline D/CDK et cycline E/CDK2 vis-à-vis des protéines CIP/KIP. Dès que le processus de séquestration de ces protéines diminue le taux de p27 «actif» en-dessous d un seuil, le complexe cycline E/CDK2 facilite sa propre activation en phosphorylant p27 en Thr187 déclenchant ainsi sa dégradation [147, 170]. Les molécules résiduelles de p27 et de p21 restent liées aux complexes cycline D/CDK tout au long des cycles successifs et le pool de ces molécules CIP/KIP liées est libéré quand les facteurs de croissance sont retirés du milieu inhibant ainsi les complexes cycline E/CDK et arrêtant la cellule en phase G 1. Dans les cellules épithéliales de poumon de souris, le TGF-β inhibe la synthèse de CDK4 [32] ce qui augmente le taux de p27 libre (qui n est pas captée par les complexes cycline D/CDK4) qui va donc se fixer sur les complexes cycline E/CDK2 donnant lieu à un arrêt eng 1 [122]. Ainsi la captation de p27 par les complexes cycline D/CDK4 permet de promouvoir l activité kinase des complexes cycline E/CDK2 aidant àétablir l ordre d activation. Comme pour p21, la stœchiométrie de p27 détermine s il est activateur ou inhibiteur. Les protéines CIP/KIP se lient d abord aux cyclines D ce qui permet l assemblage avec CDK4 ou CDK6 et conduit non pas à l inhibition mais à l activation et à la stabilisation du complexe. Dans des souris knock-out pour p27, les taux de complexes cycline D1/CDK assemblés est diminué de plus de dix fois [12]. En fait, les protéines CIP/KIP facilitent dans un premier temps l activité des complexes cycline D/CDK en permettant l assemblage de la cycline D et de la CDK et en stabilisant le complexe [12]. Dans un second temps, quand le nombre de molécules p27 fixées sur les complexes cycline D/CDK augmente, l effet d inhibition est mis en jeu. La régulation de p27 est traductionnelle [52] et posttraductionnelle [110]. Quand des fibroblastes en prolifération sont privés de sérum la synthèse de p27 augmente, mais p27 est également libérée des complexes cycline D/CDK car la cycline D est dégradée. La perte de l activité des CDK dépendantes des cyclines D couplée à l inhibition de CDK2 par p27 induit l arrêteng 1 /S. L utilisation de nucléotides antisens dirigés contre la synthèse de p27 peut empêcher les cellules de devenir quiescentes [13, 132]. Rôles de p27 en pathologie Les souris knock-out pour p27 développent beaucoup de tumeurs notamment hypophysaires (avec 100 % de pénétrance) [34]. Le nombre de tumeurs dépend du nombre de copies du gène (les souris p27-/- développent plus de tumeurs que les souris p27-/+) [33]. De plus, les souris knock-out pour p27 sont très sensibles aux agents carcinogènes. La perte de l expression de la protéine pourrait favoriser le développement et/ou la progression d une tumeur si bien que p27 a étéétudié dans beaucoup de cancers. Néanmoins, à la différence des gènes suppresseurs de tumeurs, les anomalies (mutations, délétions homozygotes) concernant le gène sont exceptionnelles dans les tumeurs [124, 64]. En revanche, l absence ou la diminution d expression de p27 (ou l augmentation de la dégradation de p27) est un facteur pronostic péjoratif puissant dans plusieurs cancers (cancers du sein ou colorectaux par

12 120 J.F. Viallard et al. exemple) [84]. À la différence des autres CKI dont l abondance est régulée par le taux de transcription de la protéine, les taux de p27 sont surtout régulés par un mécanisme post-traductionnel, c est-à-dire par les voies qui assurent sa dégradation [2]. La dégradation de p27 se fait par la voie de l ubiquitine et du protéasome [85] et nécessite d une part sa phosphorylation, et d autre part son transfert du noyau vers le cytoplasme. Il existe donc une régulation temporelle et spatiale. Dans une récente étude, Loda et al. montrent le caractère significativement péjoratif de l absence de p27 chez des patients affectés d un cancer du côlon, et prouvent que cette perte d expression de la protéine est liée non pas à une anomalie du gène mais à une forte activation des mécanismes de dégradation de la protéine [85]. Ce mécanisme est tout à fait original et doit se vérifier dans d autres tumeurs. Par ailleurs, p27 aurait un rôle dans la différenciation mais aussi dans la protection contre l inflammation. Récemment, Ophascharoensur et al. montrent que les lésions de glomérulonéphrite induites expérimentalement chez les souris knock-out pour p27 sont significativement plus importantes que chez les souris normales suggérant un rôle de p27 dans la protection contre l inflammation [108]. La famille des inhibiteurs INK4 Les protéines INK4 sont des polypeptides de 15 à 19 kda qui partagent près de 40% d homologie entre elles. Elles sont largement conservées parmi les espèces, les protéines murines ayant 90 % d identité avec les protéines correspondantes de l homme. Elles sont composées de motifs ankyrine plusieurs fois répétés qui jouent un rôle dans les interactions protéine protéine [142]. Le troisième motif est crucial pour l interaction des protéines INK4 avec CDK4 ou CDK6 [104]. Les signaux qui conduisent à la synthèse de ces protéines sont peu connus, mais il est clair par exemple que p15 INK4b est induite par le TGF-β et contribue à sa capacité d induire un arrêt en phase G 1 [130, 131]. p16 s accumule progressivement au fur et à mesure que les cellules vieillissent, jouant un rôle probable dans la sénescence [143, 188] alors que p18 INK4C et p19 ARF sont focalement exprimées durant le développement fœtal jouant un rôle dans la différenciation terminale [188, 100]. Mécanismes transcriptionnels La région 9p21 comporte deux gènes codant pour p16 INK4a et p15 INK4b. Les deux gènes ont une homologie de séquence très importante suggérant une duplication ancestrale, et sont situés à environ 30 kb l un de l autre. Le gène codant pour p15 INK4b comporte deux exons et génère deux transcrits, p15 et p10, utilisant le même cadre de lecture. En revanche, le gène codant pour p16 (appelé locus INK4a/ARF) est remarquable par son organisation génomique, puisqu un exon est partagé par deux gènes qui codent pour des protéines fonctionnellement différentes (figure 8) [126, 160]. Alors que les virus utilisent souvent cette organisation de gènes se chevauchant dans le but d optimiser au maximum les séquences codantes, une telle organisation est très inhabituelle dans le génome humain. En effet, le locus INK4a/ARF a une structure pour le moment unique : un premier transcrit (correspondant à p16) est généré àpartir d un exon 1α et des exons 2 et 3 [126, 160]. Un deuxième transcrit dénommé p19 ARF est également généréàpartir des exons 2 et 3 mais aussi par un deuxième exon 1 situé 13 kb en amont de l exon 1α et dénommé exon 1β. Laprotéine appelée p19 ARF (ARF pour alternative open reading frame) est donc traduite par un autre cadre de lecture [76]. Il n y a donc aucune homologie de p19 ARF avec les protéines de la famille INK4. La protéine p19 ARF a en revanche la propriété de bloquer les cellules en phase G 1 et G 2, par un mécanisme récemment élucidé (figure 8) [62, 123, 186]. La protéine p19 ARF participe à la dégradation de la protéine mdm2, cette dernière ayant pour fonction de bloquer l activité transactivatrice de p53 [149]. p19 ARF serait donc un activateur indirect de p53 [62]. Récemment, plusieurs groupes ont montré que p19 ARF inhibe la prolifération cellulaire en activant p53. En effet, les signaux de prolifération émanant de l expression de certains oncogènes (tels que myc, E1A, E2F1 ou ras V12) aboutissent à l augmentation des taux de p19 ARF permettant ainsi d initier une cascade d événements qui aboutissent à la stabilisation et à l activation de la protéine p53 [62, 123, 16]. Par contraste, les signaux qui régulent p16 restent à identifier. Cependant, l intérêt de ce locus INK4/ARF semble crucial en cancérologie car il code pour deux protéines qui interviennent dans deux voies différentes d inhibition des tumeurs, la voie de prb et celle de p53. Fonctions des protéines INK4 Les protéines INK4 se lient spécifiquement à CDK4 et à CDK6 et inhibent leur activité [148]. Rappelons que CDK4 et CDK6 sont liées aux cyclines D et ont pour substrat principal prb [144]. Dans les cellules proliférantes, CDK4 (ou CDK6) existe sous trois formes [89] : un complexe de 450-kDa composé de CDK4 (ou CDK6) et de Hsp90/cdc37 ; un complexe de kDa composé d une cycline D, de CDK4 (ou CDK6), et de p21 ou p27 ; un complexe de 50 kda composé de CDK4 (ou CDK6) et d une protéine INK4. Dans les cellules quiescentes, CDK4 est complexée avec Hsp90/cdc37 [75, 158]. Au fur et à mesure de la progression en phase G 1, CDK4 forme des complexes avec les cyclines D nouvellement synthétisées et p21 ou p27 (figure 7). Plus en avant dans le cycle, p27 est libérée des

13 Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 121 Figure 8. Représentation schématique du locus INK4a/ARF situé entre les gènes de l interféron et le gène MTAP dans la région chromosomique 9p21. Le locus INK4a/ARF code pour deux protéines différentes, p16 INK4a et p19 ARF.p16 INK4a est codée par les exons 1α, 2 et 3 (rectangles noirs) ; p19 ARF est codée par les exons 1β, 2 et 3 (rectangles hachurés). p16 INK4a se lie aux complexes cycline D/CDK4-6 et les inhibe empêchant ainsi la phosphorylation de prb ce qui entraîne un arrêt des cellules en G 1.p19 ARF interagit avec mdm2, protéine qui inhibe p53. En permettant la dégradation de mdm2, p19 ARF active indirectement p53 et entraîne un arrêt de la cellule en G 1 et en G 2. complexes cycline E/CDK2 et cycline A/CDK2, événement qui permet l activation de ces complexes cycline E/CDK2 et cycline A/CDK2 qui, en retour, peuvent d une part phosphoryler p27 et promouvoir sa dégradation, et d autre part phosphoryler prb. Alors les cellules peuvent entrer en phase S (figure 7). Alternativement, dans l hypothèse d une situation où une protéine INK4 serait exprimée, une CDK4 nouvellement synthétisée peut entrer en contact avec une protéine INK4 et former un hétérodimère inactif (figure 9A) mais stable car CDK4 ne peut plus alors être recrutée dans un complexe actif avec la cycline D [43, 114]. Il y a donc une compétition entre les protéines INK4 d un côté et les protéines CIP/KIP couplées aux cyclines D de l autre côté pour l association à CDK4 [115]. L induction et l augmentation des taux de p16 non seulement entraîne un déplacement des molécules nouvellement synthétisées de CDK4 vers p16, mais peut également provoquer la rupture des complexes CDK4/cdc37/Hsp90 déjà formés libérant CDK4 qui sera ainsi pris en charge par p16 (figure 9B). En conséquence, il y a augmentation du nombre de complexes CDK4/INK4, les cyclines D non liées étant alors rapidement dégradées par la voie du protéasome [21]. La perte des cyclines D empêche alors la séquestration des molécules p27 qui peuvent alors exercer librement leur action inhibitrice sur les complexes cycline E/CDK2 et cycline A/CDK2, entraînant l absence de phosphorylation de prb et donc un arrêt de la cellule en G 1. La surexpression des protéines de la famille INK4 est donc responsable d un arrêt des cellules en G 1 mais d une façon dépendante de l intégrité de prb [87, 94]. En effet, la perte de la fonction de prb empêche la capacité de blocage en G 1 des protéines INK4. La perte de prb libère les molécules E2F ce qui a pour conséquence l augmentation du taux et de l activité des complexes cycline E/CDK2 [53, 55] qui phosphorylent p27 dont la protéolyse est alors accélérée (figure 10) [147, 170, 112]. Les cellules qui n ont pas une prb fonctionnelle ont des taux très élevés de p16, suggérant que prb régule p16 négativement [114]. Dans une cellule normale, le taux de p16 est maximal en phase S. En fait, il existe physiologiquement une boucle de régulation positive entre prb et p16. Après phosphorylation par les complexes cycline D/CDK4 ou CDK6, prb libère les facteurs de transcription qui activent la transcription de p16. Ainsi, p16 se lie et dissocie les complexes cyclines D/CDK4 ou CDK6. Quand l action inhibitrice des membres de la famille CIP/KIP sur les complexes cycline E/CDK2 et cycline A/CDK2 est neutralisée, les CDK dépendantes des cyclines D ne sont plus utiles pour la progression dans le cycle cellulaire (figure 11). Les cellules n exprimant ni p27 ni p21 n ont pas pour autant des cycles perturbés en dépit du fait que l activité des kinases dépendantes des cyclines D soit faible [12]. Inversement, l activité des complexes cycline E/CDK2 est très élevée et prb est périodiquement phosphorylée pendant le cycle même sur les sites préférentiellement reconnus par CDK4 ou CDK6. De telles cellules sont évidemment résistantes à l action inhibitrice de p16 mais pas à l action de p27. En l absence des membres de la famille CIP/KIP, la fonction de séquestration des complexes cyclines D/CDK est rendue superflue et les kinases dépendantes des cyclines E et A sont suffisantes pour phosphoryler prb. Ainsi, de telles cellules tolèrent parfaitement une réduction de l activité des kinases dépendantes des cyclines D. Ces observations sont à rapprocher de celles constatées chez les souris déficientes en

14 122 J.F. Viallard et al. A B Figure 9. A : une molécule CDK4 nouvellement synthétisée se lie à cdc37 et Hsp90. Si elle se complexe à une cycline D elle devient active ; si elle est liée à une protéine de la famille INK4 elle est inactive. B : l induction et l augmentation des taux de p16 INK4a peut également provoquer la rupture des complexes CDK4/cdc37/Hsp90 déjà formés libérant CDK4 qui sera ainsi pris en charge par p16 INK4a. En conséquence, il y a augmentation du nombre de complexes CDK4/INK4, avec arrêt de la séquestration des protéines de la famille CIP/KIP qui sont libérées et qui vont donc pouvoir inhiber les complexes cycline E/CDK2. cycline D1 et/ou D2 qui sont viables en dépit de quelques anomalies de développement [153, 154]. De récentes observations démontrent que le remplacement de la cycline D1 par la cycline E permet de corriger les anomalies du développement de ces animaux et sont compatibles avec l idée que la cycline E peut fonctionner sans la cycline D1. LA NOTION DE CHECKPOINT Figure 10. Dans les cellules déficientes en prb, les facteurs de transcription E2F ne sont pas inhibés par prb si bien que leur activité se fait pleinement notamment sur la transcription de la cycline E. Cela entraîne une augmentation du nombre de complexes cycline E/CDK2 qui phosphorylent les protéines CIP/KIP dont la dégradation s accélère. Les complexes cycline D/CDK se désunissent et les protéines CDK4 sont alors mobilisées dans des complexes avec p16 INK4a. Il existe plusieurs transitions au cours du cycle cellulaire. Une transition correspond à un changement unidirectionnel de la cellule qui se déplace d un état où elle effectuait un certain nombre de processus vers un autre état où elle va effectuer d autres processus. Comment ces transitions sont-elles coordonnées pour survenir à un temps bien précis et dans un ordre bien défini? Pour que les événements cellulaires se fassent dans un ordre voulu, il faut que chaque étape précédant un événement soit complètement et correctement effectuée. Il existe des circuits de régulation qui sont des mécanismes de surveillance qui surveillent l achèvement de certains événements cruciaux pour la cellule et ainsi autorisent la survenue d une transition et la progression dans le cycle. Il y a deux classes de circuits : les mécanismes intrinsèques opérant à chaque cycle cellulaire pour ordonner des événements succes-

15 Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 123 Le checkpoint G 1 /S Figure 11. La perte des protéines CIP/KIP a pour conséquence une désunion des complexes cycline D/CDK4-6 entraînant une destruction des cyclines D et une séquestration des molécules CDK4 dans des complexes avec p16 INK4a.Ilenrésulte une augmentation de l activité des complexes cycline E/CDK2 ce qui suffit pour phosphoryler prb et compenser la perte des complexes cycline D/CDK. sifs ; les mécanismes extrinsèques induits seulement pour agir quand un défaut est détecté (altération de l ADN par exemple). La perte de ces voies de contrôle réduit la fidélité des événements cellulaires tels que la réplication et la ségrégation chromosomiques. De telles altérations peuvent conduire à une prolifération non contrôlée et à la cancérisation. Checkpoint est le nom donné àdes sous-unités particulières de ces mécanismes intrinsèques et extrinsèques [48]. C est une voie biochimique qui s assure de la dépendance d un processus vis-à-vis d un autre. Cette définition est large mais dans le langage scientifique courant, on parle de checkpoint en référence au contrôle des transitions du cycle cellulaire. Le mot conjugue à la fois un terme de lieu (frontière) et un terme d examen. Parfois le terme est utiliséàla place du mot transition mais il devrait être restreint aux voies biochimiques qui assurent la dépendance d un processus vis-à-vis d un autre. Par exemple, le DNA-damage checkpoint est le mécanisme qui détecte une altération de l ADN et génère un signal qui arrête les cellules dans la phase du cycle où elles se trouvent et induit la transcription de gènes réparateurs. La position d arrêt dans le cycle dépend de la phase à laquelle la lésion de l ADN a lieu. Les checkpoints sont des points de décision où des mécanismes de contrôle opèrent et empêchent la progression dans le cycle si les étapes précédentes n ont pas été complètes ou si l ADN est altéré. Ainsi, en G 1, une cellule doit surveiller sa taille, la présence de nutriments et l intégrité de son ADN avant de commencer le processus d initiation de la synthèse d ADN. En G 2 il existe un checkpoint qui, dans le cas où l ADN est endommagé ou non répliqué, empêche la cellule d entrer en mitose. Chez les mammifères, les réponses vis-à-vis d une lésion de l ADN sont les mêmes que chez la levure avec en plus la possibilité d entrer en apoptose (le but n est pas la survie d une cellule endommagée mais la survie de l organisme). Le checkpoint en G 1 en réponse à une lésion de l ADN est le mieux connu. Trois gènes le contrôlent : ATM (ataxia telangiectasia mutated,legène muté dans la maladie ataxie télangiectasie) [111, 140], p53 [83] et p21 [5]. p53 est le gène suppresseur de tumeur le plus fréquemment muté dans les cancers humains [150]. Il code pour un facteur de transcription qui est activé en réponse à une lésion de l ADN ou une perturbation du pool de nucléotides. p53 activée est capable d inhiber le cycle cellulaire et de promouvoir l apoptose [99]. Les cellules dépourvues de p53 sont incapables de s arrêter en phase G 1 en réponse à une irradiation γ et ont une apoptose réduite. Une partie de la capacité de p53 à arrêter la cellule en phase G 1 vient de l activation de la transcription de p21 inhibiteur des CDK qui contrôlent l entrée enphases [29]. Les fibroblastes embryonnaires de souris qui n ont pas p21 ne s arrêtent que partiellement en phase G 1 suggérant l existence d une autre voie dépendante de p53 permettant l arrêt en phase G 1. Cette voie est inconnue. Le produit du gène ATM a été impliqué dans la régulation de p53. Ce gène, qui code pour une protéine kinase, est muté dans le syndrome ataxie télangiectasie. Les cellules qui n ont pas ce gène ont une activation réduite et retardée de p53 en réponse à une lésion de l ADN [86]. L action de la protéine kinase ATM ne passe pas par p19 ARF. Lors d une lésion de l ADN, ATM phosphoryle la partie N-terminale de p53 ce qui stabilise p53 et empêche sa dégradation [155]. D autres kinases (telles que la DNA-PK, DNA-dependent protein kinase) capables de phosphoryler p53 ont été mises en évidence et joueraient le même rôle qu ATM en réponse à des lésions de l ADN [179]. L activation de p53 (par l expression d oncogènes ou par lésions de l ADN) est associée à une stabilisation post-translationnelle de la protéine. Cette stabilisation résulte en partie de l inhibition de la protéine mdm2 qui promouvoit la dégradation de p53 [73]. Le fait que les gènes codant pour p53 et ATM soient fréquemment mutés dans les cancers humains [54] suggère que la fonction des checkpoints est importante dans la prévention des cancers. On en sait plus sur les checkpoints de la levure que chez l homme et tout va dépendre des degrés de conservation entre les mécanismes de l homme et de la levure. Cela dit, la perte de p21 entraîne peu de cancers [5, 20] et les mutations de p21 sont rares dans les tumeurs [152]. Donc le fait de dire que la perte

16 124 J.F. Viallard et al. des capacités à arrêter les cellules en G 1 conduit à une instabilité génomique et donc à un cancer reste à prouver. Le checkpoint G 2 /M Le checkpoint G 2 /M est moins connu dans les cellules de mammifères que le checkpoint G 1 /S. Ce checkpoint empêche une ségrégation impropre des chromosomes, phénomène fréquent en cancérologie humaine [116]. Les études génétiques menées chez les levures ont permis d identifier des gènes contrôlant ce checkpoint et certains sont conservés entre la levure et les cellules de mammifères. Les protéines intervenant dans le contrôle de ce checkpoint sont en cours d identification mais il semble que CDC25 et p53 soient des modulateurs de la transition G 2 /M. ALTÉRATIONS DE L AXE DE RÉGULATION DE LA PHOSPHORYLATION DE prb DANS LES TUMEURS L interaction entre p16, cycline D/CDK, et prb/e2f constitue une unité fonctionnelle connue sous le nom de «voie prb» (prb pathway). Chacun des composants de cette voie peut être déréglé dans un processus cancéreux, et il devient de plus en plus évident que cet axe constitue une cible obligatoire du processus oncologique de pratiquement toutes les tumeurs humaines. Les analyses biochimiques et moléculaires de lignées et tumeurs primaires ont montré des anomalies extrêmement fréquentes d expression des molécules impliquées dans cet axe. Par exemple, une mutation ou une surexpression de CDK4 est souvent présente dans des tumeurs telles que les mélanomes ou les glioblastomes [3, 50] ; la surexpression de la cycline D1 est un facteur pronostic négatif dans une grande variété de tumeurs solides [97] ; une délétion du gène codant pour p16 est présente dans un grand nombre de tumeurs solides et reste l altération génétique la plus fréquemment observée dans les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) T de l adulte [61, 127]. Ainsi, l inactivation fonctionnelle de prb serait une étape obligatoire de la genèse des tumeurs. La molécule prb elle-même joue un rôle fondamental [174] et les anomalies retrouvées peuvent être classées schématiquement en deux groupes selon que la fonction et/ou l expression de prb est anormale ou normale. Le premier groupe d anomalies comprend les défauts d expression de prb par délétion, mutation ponctuelle ou inhibition transcriptionnelle. Les conséquences fonctionnelles de ces anomalies sont proches de celles dues à des protéines virales (telle la protéine E7 du papillomavirus) qui inhibent la fixation de prb aux facteurs de transcription (cancer du col de l utérus). Dans les hémopathies malignes, des délétions, mutations ponctuelles ou inhibitions d expression ont été retrouvées de façon assez fréquente dans les leucémies aiguës myéloïdes, les leucémies aiguës lymphoïdes Ph1+, les leucémies lymphoïdes chroniques et les lymphomes malins de haut grade [187]. Lorsque la structure de prb est normale et que la protéine est correctement exprimée, les altérations aboutissant à un raccourcissement de la phase G 1 sont dues à des anomalies touchant les molécules impliquées dans la phosphorylation de prb ou dans sa régulation. Selon que ces molécules jouent un rôle positif ou négatif dans ces phosphorylations, les anomalies seront diamétralement opposées. Les anomalies touchant les molécules régulant positivement la phosphorylation de prb sont des surexpressions ou des expressions ectopiques et les gènes impliqués sont des oncogènes candidats. Inversement, des défauts d expressions de certains régulateurs négatifs sont retrouvés dans les tumeurs, les gènes correspondants se comportant comme des gènes suppresseurs de tumeurs. À titre d exemple, nous détaillerons le rôle de p16 dans certaines tumeurs. Anomalies de p16 et cancer Il existe désormais de nombreux liens chez l homme entre l oncogénèse et les altérations génétiques du locus INK4a/ARF. Des délétions homozygotes de ce gène ont été découvertes dans un grand nombre de tumeurs incluant notamment des sarcomes, des lymphomes et des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) de l enfant [61, 136, 107]. p16, protéine s associant à CDK4 et CDK6, a été mise en évidence pour la première fois par l équipe de Xiong et al. [182] puis ultérieurement clonée par le système des doubles hybrides [142]. Cette protéine a suscité rapidement un grand intérêt encancérologie car sur les 290 lignées tumorales étudiées par Kamb et al., 46 % présentaient des délétions au niveau de p16 : 82 % des astrocytomes, 71 % des gliomes, 60 % des ostéosarcomes et des carcinomes mammaires, 58 % des mélanomes et 56 % des cancers rénaux présentaient de telles altérations [61]. Seuls les cancers du côlon et les neuroblastomes échappaient au phénomène. p16 se voyait dotée d un statut égal à celui de p53. En revanche, la fréquence des délétions de p16 observées dans les tumeurs primaires (et non plus dans les lignées établies) chute à moins de 20 % [6]. Le gène codant pour la protéine p16 est fréquemment muté dans les cas de mélanomes notamment à expression familiale [88]. Par ailleurs, des mutations de ce gène sont fréquemment observées dans les adénocarcinomes pancréatiques, les carcinomes œsophagiens, et, moins fréquemment, dans les cancers du poumon non à petites cellules et les carcinomes de la tête et du cou [82]. Enfin, il est désormais établi que les réarrangements chromosomiques intéressant ce locus représentent un événement géné-

17 Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 125 tique caractéristique des leucémies aiguës lymphoïdes de type T [150]. En effet, de nombreuses études ont démontré de fréquentes délétions des gènes codant pour p16 et p15 INK4b [10, 51, 165]. Les altérations du gène codant pour p16 sont dans la majorité des cas des délétions. En fait, une délétion au niveau de ce gène peut entraîner non seulement un déficit en protéine p16 mais également, du fait de son mécanisme transcriptionnel particulier, en deux autres protéines (p15 INK4b et p19 ARF ) ce qui donne à la cellule cancéreuse un avantage prolifératif plus important que si elle ne possédait qu un déficit en une seule de ces protéines. D autres mécanismes d inactivation peuvent intervenir. L équipe de Sidranski a mis en évidence que certaines lignées cellulaires (cancer du poumon ou des voies aérodigestives) ne possédaient plus qu une seule copie du gène p16 mais que celle-ci était indemne de toute mutation. Néanmoins, aucune expression transcriptionnelle du gène ne pouvait être mise en évidence, suggérant une anomalie au niveau des signaux de régulation. L analyse de la région 5 du gène p16 montre qu elle contient une région très riche en dinucléotides CpG (îlot CpG). La méthylation des résidus C présents dans ces îlots participe à la régulation de l expression génétique. En général, l hyperméthylation de ces régions s accompagne de l inactivation de l expression du gène adjacent à l îlot CpG. L analyse de l îlot CpG situé en 5 du gène p16 a montré que celui-ci était hyperméthylé dans 42 % des cas (onze lignées sur 26) [95]. Dans tous les cas, cette hyperméthylation était associée à l absence d expression du gène. Dans les tumeurs primaires, les auteurs ont observé une méthylation dans 20 % des cas. Si le rôle suppresseur de tumeur de la protéine p16 est maintenant fermement établi, il reste à comprendre si son expression survient dans les cellules normales d où dérivent les tumeurs. Plusieurs travaux laissent imaginer que l expression de p16 agisse comme un mécanisme suppresseur d événements oncogéniques, son inactivation secondaire aboutissant à une sélection et une prolifération des cellules transformées [173]. Anomalies des facteurs transcriptionnels E2F1 et cancer E2F1 tient une place particulière [172]. Son action transformante in vitro en fait un bon oncogène candidat. Dans ce contexte, le phénotype des souris E2F1-/- apparaît étonnant [35, 183]. Ces souris sont en effet caractérisées par une incidence élevée de tumeurs spontanées. E2F1 apparaît donc comme un gène possédant à la fois les propriétés d oncogène et de gène suppresseur de tumeur. Bien que ce phénomène reste encore mal compris, il est peut-être à rapprocher des fonctions différentes des formes libres d E2F1 et des formes liées à prb. E2F1 associée à prb semble en effet capable de se lier aux régions régulatrices de certains gènes et d en inhiber la transcription. E2F libre en revanche est capable de stimuler la transcription de gènes impliqués dans le passage et/ou le déroulement de la phase S. CONCLUSION Les progrès considérables réalisés au cours de la dernière décennie dans la connaissance des mécanismes régulateurs du cycle cellulaire ont permis une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la cancérisation. Malgré la profusion de travaux sur le sujet, aucune implication de pratique clinique ne s est réellement dégagée, mais de nouvelles stratégies thérapeutiques sont en cours d évaluation [145]. Par exemple, de nouveaux inhibiteurs des CDK sont en développement, ainsi que des molécules capables d inhiber les checkpoints des cellules cancéreuses permettant ainsi d augmenter les réponses cytotoxiques des chimiothérapies déjà en cours d utilisation. De même, quelques travaux de thérapie génique ont été publiés mais se heurtent à des problèmes techniques tels que la vectorisation. Enfin, il est probable que les molécules régulatrices du cycle cellulaire, du fait de leurs fonctions dépassant la simple stimulation de la prolifération, soient impliquées dans la pathogénie d autres maladies. REuFEuRENCES 1 Ajchenbaum F, Ando K, De Caprio JA, Griffin JD. Independent regulation of human D-type cyclin gene expression during G1 phase in primary human T lymphocytes. J Biol Chem 1993 ; 268 : Alessandrini A, Chiaur DS, Pagano M. Regulation of the cyclindependent kinase inhibitor p27 by degradation and phosphorylation. Leukemia 1997 ; 11 : Bartkova J, Lukas J, Guldberg P, Alsner J, Kirkin AF, Zeuthen J, et al. The p16-cyclin D/Cdk4-pRb pathway as a functional unit frequently altered in melanoma pathogenesis. Cancer Res 1996 ; 56 : Bates S, Bonetta L, MacAllan D, Parry D, Holder A, Dickson C, et al. CDK6 (PLSTIRE) and CDK4 (PSK-J3) are a distinct subset of the cyclin-dependent kinases that associate with cyclin D1. Oncogene1994;9: Brugarolas J, Chandrasekaran C, Gordon JI, Beach D, Jacks T, Hannon GJ. Radiation-induced cell cycle arrest compromised by p21 deficiency. Nature 1995 ; 377 : Cairns P, Mao L, Merlo A, Lee DJ, Schwab D, Eby Y, et al. Rates of p16 (MTS1) mutations in primary tumors with 9p loss. Science 1994 ; 265 : Carbonaro-Hall D, Williams R, Wu L, Warburton D, Zeichner- David M, MacDougall M, et al. G1 expression and multistage dynamics of cyclin A in human osteosarcoma cells. Oncogene 1993;8: Cardoso MC, Leonhardt H, Nadal-Ginard B. Reversal of terminal differentiation and control of DNA replication : cyclin A and Cdk2 specifically localize at subnuclear sites of DNA replication. Cell 1993 ; 74 :

18 126 J.F. Viallard et al. 9 Cayrol C, Ducommun B. Interaction entre l inhibiteur des kinases dépendantes des cyclines p21 et le PCNA : un lien entre un cycle cellulaire, la réplication et la réparation de l ADN. Med Sci 1997 ; 13 : Cayuela JM, Hebert J, Sigaux F. Homozygous MTS1 (p16ink4a) deletion in primary tumor cells of 163 leukemic patients [letter]. Blood 1995 ; 85 : Chang Y, Moore PS, Talbot SJ, Boshoff CH, Zarkowska T, Godden-Kent, et al. Cyclin encoded by KS herpes virus [letter]. Nature 1996 ; 382 : Cheng M, Olivier P, Diehl JA, Fero M, Roussel MF, Roberts JM, et al. The p21(cip1) and p27(kip1) CDK inhibitors are essential activators of cyclin D-dependent kinases in murine fibroblasts. EMBO J 1999 ; 18 : Coats S, Flanagan WM, Nourse J, Roberts JM. Requirement of p27kip1 for restriction point control of the fibroblast cell cycle. Science 1996 ; 272 : Darbon JM, Devault A, Taviaux S, Fesquet D, Martinez AM, Galas S, et al. Cloning, expression and subcellular localization of the human homolog of p40mo15 catalytic subunit of cdkactivating kinase. Oncogene 1994 ; 9: De Bondt HL, Rosenblatt J, Jancarik J, Jones HD, Morgan DO, Kim SH. Crystal structure of cyclin-dependent kinase 2. Nature 1993 ; 363 : De Stanchina E, McCurrach ME, Zindy F, Shieh SY, Ferbeyre G, Samuelson AV, et al. E1A signaling to p53 involves the p19(arf) tumor suppressor. Genes Dev 1998 ; 12 : De Gregori J, Kowalik T, Nevins JR. Cellular targets for activation by the E2F1 transcription factor include DNA synthesis and G1/S regulatory genes. Mol Cell Biol 1995 ; 15 : (published erratum appears in Mol Cell Biol :5846-7). 18 Delmer A, Ajchenbaum-Cymbalista F, Tang R, Ramond S, Faussat AM, Marie JP, et al. Overexpression of cyclin D2 in chronic B-cell malignancies. Blood 1995 ; 85 : Demetrick DJ, Zhang H, Beach DH. Chromosomal mapping of human CDK2, CDK4, and CDK5 cell cycle kinase genes. Cytogenet Cell Genet 1994 ; 66 : Deng C, Zhang P, Harper JW, Elledge SJ, Leder P. Mice lacking p21 WAF1 undergo normal development, but are defective in G1 checkpoint control. Cell 1995 ; 82 : Diehl JA, Zindy F, Sherr CJ. Inhibition of cyclin D1 phosphorylation on threonine-286 prevents its rapid degradation via the ubiquitin-proteasome pathway. Genes Dev 1997 ; 11 : Dowdy SF, Hinds PW, Louie K, Reed SI, Arnold A, Weinberg RA. Physical interaction of the retinoblastoma protein with human D cyclins. Cell 1993 ; 73 : Ducommun B, Brambilla P, Felix MA, Franza BR Jr, Karsenti E, Draetta G. cdc2 phosphorylation is required for its interaction with cyclin. EMBO J 1991 ; 10 : Dulic V, Lees E, Reed SI. Association of human cyclin E with a periodic G1-S phase protein kinase. Science 1992 ; 257 : Dunphy WG, Kumagai A. The cdc25 protein contains an intrinsic phosphatase activity. Cell 1991 ; 67 : Duronio RJ, Brook A, Dyson N, O Farrell PH. E2F-induced S phase requires cyclin E. Genes Dev 1996 ; 10 : El-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, Levy DB, Parsons R, Trent JM, et al. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell 1993 ; 75 : Elledge SJ, Richman R, Hall FL, Williams RT, Lodgson N, Harper JW. CDK2 encodes a 33-kDa cyclin A-associated protein kinase and is expressed before CDC2 in the cell cycle. Proc Natl Acad Sci USA 1992 ; 89 : Elledge SJ. Cell cycle checkpoints : preventing an identity crisis. Science 1996 ; 274 : Endicott JA, Nurse P, Johnson LN. Mutational analysis supports a structural model for the cell cycle protein kinase p34. Protein Eng 1994;7: Ewen ME, Sluss HK, Sherr CJ, Matsushime H, Kato J, Livingston DM. Functional interactions of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclins. Cell 1993 ; 73 : Ewen ME, Sluss HK, Whitehouse LL, Livingston DM. TGF beta inhibition of Cdk4 synthesis is linked to cell cycle arrest. Cell 1993 ; 74 : Fero ML, Randel E, Gurley KE, Roberts JM, Kemp CJ. The murine gene p27kip1 is haplo-insufficient for tumour suppression. Nature 1998 ; 396 : Fero ML, Rivkin M, Tasch M, Porter P, Carow CE, Firpo E, et al. A syndrome of multiorgan hyperplasia with features of gigantism, tumorigenesis, and female sterility in p27(kip1)-deficient mice. Cell 1996 ; 85 : Field S, Tsai F, Kuo F, Zubiaga A, Kaelin W Jr, Livingston D, et al. E2F-1 functions in mice to promote apoptosis and suppress proliferation. Cell 1996 ; 85 : Firpo EJ, Koff A, Solomon MJ, Roberts JM. Inactivation of a Cdk2 inhibitor during interleukin 2-induced proliferation of human T lymphocytes. Mol Cell Biol 1994 ; 14 : Fisher RP, Morgan DO. A novel cyclin associates with MO15/ CDK7 to form the CDK-activating kinase. Cell 1994 ; 78 : Galaktionov K, Beach D. Specific activation of cdc25 tyrosine phosphatases by B-type cyclins : evidence for multiple roles of mitotic cyclins. Cell 1991 ; 67 : Glotzer M, Murray AW, Kirschner MW. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature 1991 ; 349 : Godden-Kent D, Talbot SJ, Boshoff C, Chang Y, Moore P, Weiss RA, et al. The cyclin encoded by Kaposi s sarcomaassociated herpes virus stimulates cdk6 to phosphorylate the retinoblastoma protein and histone H1. J Virol 1997 ; 71 : Hagting A, Jackman M, Simpson K, Pines J. Translocation of cyclin B1 to the nucleus at prophase requires a phosphorylationdependent nuclear import signal. Curr Biol 1999 ; 9: Hagting A, Karlsson C, Clute P, Jackman M, Pines J. MPF localization is controlled by nuclear export. EMBO J 1998 ; 17 : Hall M, Bates S, Peters G. Evidence for different modes of action of cyclin-dependent kinase inhibitors : p15 and p16 bind to kinases, p21 and p27 bind to cyclins. Oncogene 1995 ; 11 : Hall M, Peters G. Genetic alterations of cyclins, cyclin-dependent kinases, and Cdk inhibitors in human cancer. Adv Cancer Res 1996 ; 68 : Hanna Z, Jankowski M, Tremblay P, Jiang X, Milatovich A, Francke U, et al. The Vin-1 gene, identified by provirus insertional mutagenesis, is the cyclin D2. Oncogene 1993 ; 8: Hannon GJ, Casso D, Beach D. KAP : a dual specificity phosphatase that interacts with cyclin-dependent kinases. Proc Natl Acad Sci USA 1994 ; 91 : Harper JW, Adami GR, Wei N, Keyomarsi K, Elledge SJ. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclindependent kinases. Cell 1993 ; 19 : Hartwell LH, Weinert TA. Checkpoints : controls that ensure the order of cell cycle events. Science 1989 ; 246 : Hatakeyama M, Brill JA, Fink GR, Weinberg RA. Collaboration of G1 cyclins in the functional inactivation of the retinoblastoma protein. Genes Dev 1994 ; 8: He J, Allen JR, Collins VP, Allalunis-Turner MJ, Godbout R, Day RS 3rd, et al. CDK4 amplification is an alternative mechanism to p16 gene homozygous deletion in glioma cell lines. Cancer Res 1994 ; 54 : Hebert J, Cayuela JM, Berkeley J, Sigaux F. Candidate tumorsuppressor genes MTS1 (p16ink4a) and MTS2 (p15ink4b) display frequent homozygous deletions in primary cells from T- but not from B-cell lineage acute lymphoblastic leukemias. Blood 1994 ; 84 : Hengst L, Reed SI. Translational control of p27kip1 accumulation during the cell cycle. Science 1996 ; 271 : Herrera RE, Sah VP, Williams BO, Makela TP, Weinberg RA, Jacks T. Altered cell cycle kinetics, gene expression, and G1 restriction point regulation in Rb-deficient fibroblasts. Mol Cell Biol 1996 ; 16 : Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC. p53 mutations in human cancers. Science 1991 ; 253 :

19 Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire Hurford RK Jr, Cobrinik D, Lee MH, Dyson N. prb and p107/ p130 are required for the regulated expression of different sets of E2F responsive genes. Genes Dev 1997 ; 11 : Inaba T, Matsushime H, Valentine M, Roussel MF, Sherr CJ, Look AT. Genomic organization, chromosomal localization, and independent expression of human cyclin D genes. Genomics 1992 ; 13 : Javelaud D, Wietzerbin J, Delattre O, Besançon F. Induction of p21 WAF1 by TNF-α requires NF-kB activity and inhibits apoptosis in Ewing tumor cells. Oncogene 2000 ; 19 : Jeffrey PD, Russo AA, Polyak K, Gibbs E, Hurwitz J, Massague J, et al. Mechanism of CDK activation revealed by the structure of a cyclina-cdk2 complex. Nature 1995 ; 376 : Johnson DG, Ohtani K, Nevins JR. Autoregulatory control of E2F1 expression in response to positive and negative regulators of cell cycle progression. Genes Dev 1994 ; 8: Johnson LN, O Reilly M. Control by phosphorylation. Curr Opin Struct Biol 1996 ;6: Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, Liu Q, Harshman K, Tavtigian SV, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science 1994 ; 264 : Kamijo T, Weber JD, Zambetti G, Zindy F, Roussel MF, Sherr CJ. Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2. Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 95 : Kato JY, Matsuoka M, Polyak K, Massague J, Sherr CJ. Cyclic AMP-induced G1 phase arrest mediated by an inhibitor (p27kip1) of cyclin-dependent kinase 4 activation. Cell 1994 ; 79 : Kawamata N, Morosetti R, Miller CW, Park D, Spirin KS, Nakamaki T, et al. Molecular analysis of the cyclin-dependent kinase inhibitor gene p27/kip1 in human malignancies. Cancer Res 1995 ; 55 : King RW, Peters JM, Tugendreich S, Rolfe M, Hieter P, Kirschner MW. A 20S complex containing CDC27 and CDC16 catalyzes the mitosis-specific conjugation of ubiquitin to cyclin B. Cell 1995 ; 81 : Knighton DR, Zheng JH, Ten Eyck LF, Ashford VA, Xuong NH, Taylor SS, et al. Crystal structure of the catalytic subunit of cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase. Science 1991 ; 253 : Knighton DR, Zheng JH, Ten Eyck LF, Xuong NH, Taylor SS, Sowadski JM. Structure of a peptide inhibitor bound to the catalytic subunit of cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase. Science 1991 ; 253 : Kobayashi H, Stewart E, Poon R, Adamczewski JP, Gannon J, Hunt T. Identification of the domains in cyclin A required for binding to, and activation of, p34cdc2 and p32cdk2 protein kinase subunits. Mol Biol Cell 1992 ; 3: Koff A, Cross F, Fisher A, Schumacher J, Leguellec K, Philippe M, et al. Human cyclin E, a new cyclin that interacts with two members of the CDC2 gene family. Cell 1991 ; 66 : Koff A, Giordano A, Desai D, Yamashita K, Harper JW, Elledge S, et al. Formation and activation of cyclin-cdk2 complex during the G1 phase of the human cell cycle. Science 1992 ; 257 : Krek W, Ewen ME, Shirodkar S, Arany Z, Kaelin WG Jr, Livingston DM. Negative regulation of the growth-promoting transcription factor E2F-1 by a stably bound cyclin A-dependent protein kinase. Cell 1994 ; 78 : Krek W, Xu G, Livingston DM. Cyclin A-kinase regulation of E2F-1 DNA binding function underlies suppression of an S phase checkpoint. Cell 1995 ; 83 : Kubbutat MH, Jones SN, Vousden KH. Regulation of p53 stability by Mdm2. Nature 1997 ; 387 : La Thangue NB. E2F and the molecular mechanisms of early cellcycle control. Biochem Soc Trans 1996 ; 24 : Lamphere L, Fiore F, Xu X, Brizuela L, Keezer S, Sardet C, et al. Interaction between Cdc37 and Cdk4 in human cells. Oncogene 1997 ; 14 : Larsen CJ. p16ink4a : a gene with a dual capacity to encode unrelated proteins that inhibit cell cycle progression. Oncogene 1996 ; 12 : Lees E, Faha B, Dulic V, Reed SI, Harlow E. Cyclin E/cdk2 and cyclin A/cdk2 kinases associate with p107 and E2F in a temporally distinct manner. Genes Dev 1992 ; 6: Lees EM, Harlow E. Sequences within the conserved cyclin box of human cyclin A are sufficient for binding to and activation of cdc2 kinase. Mol Cell Biol 1993 ; 13 : Leone G, De Gregori J, Yan Z, Jakoi L, Ishida S, Williams RS, et al. E2F3 activity is regulated during the cell cycle and is required for the induction of S phase. Genes Dev 1998 ; 12 : Lew DJ, Dulic V, Reed SI. Isolation of three novel human cyclins by rescue of G1 cyclin (Cln) function in yeast. Cell 1991 ; 66 : Li Y, Jenkins CW, Nichols MA, Xiong Y. Cell cycle expression and p53 regulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21. Oncogene 1994 ;9: Liggett WH, Sidransky D. Role of the p16 tumor suppressor gene in cancer. J Clin Oncol 1998 ; 16 : Livingstone LR, White A, Sprouse J, Livanos E, Jacks T, Tlsty TD. Altered cell cycle arrest and gene amplification potential accompany loss of wild-type p53. Cell 1992 ; 70 : Lloyd RV, Erickson LA, Jin L, Kulig E, Qian X, Cheville JC, et al. p27kip1:a multifunctional cyclin-dependent kinase inhibitor with prognostic significance in human cancers. Am J Pathol 1999 ; 154 : Loda M, Cukor B, Tam SW, Lavin P, Fiorentino M, Draetta GF, et al. Increased proteasome-dependent degradation of the cyclindependent kinase inhibitor p27 in aggressive colorectal carcinomas.natmed1997;3: Lu X, Lane DP. Differential induction of transcriptionally active p53 following UV or ionizing radiation : defects in chromosome instability syndromes? Cell 1993 ; 75 : Lukas J, Parry D, Aagaard L, Mann DJ, Bartkova J, Strauss M, et al. Retinoblastoma-protein-dependent cell-cycle inhibition by the tumour suppressor p16. Nature 1995 ; 375 : MacGeoch C, Bishop JA, Bataille V, Bishop DT, Frischauf AM, Meloni R, et al. Genetic heterogeneity in familial malignant melanoma. Hum Mol Genet 1994 ; 3: Mahony D, Parry DA, Lees E. Active cdk6 complexes are predominantly nuclear and represent only a minority of the cdk6 in T cells. Oncogene 1998 ; 16 : Marshall CJ. Hot lips and phosphorylation of protein kinases [letter]. Nature 1994 ; 367 : Matsushime H, Ewen ME, Strom DK, Kato JY, Hanks SK, Roussel MF, et al. Identification and properties of an atypical catalytic subunit (p34psk-j3/cdk4) for mammalian D type G1 cyclins. Cell 1992 ; 71 : Matsushime H, Quelle DE, Shurtleff SA, Shibuya M, Sherr CJ, Kato JY. D-type cyclin-dependent kinase activity in mammalian cells. Mol Cell Biol 1994 ; 14 : Matsushime H, Roussel MF, Ashmun RA, Sherr CJ. Colonystimulating factor 1 regulates novel cyclins during the G1 phase of the cell cycle. Cell 1991 ; 65 : Medema RH, Herrera RE, Lam F, Weinberg RA. Growth suppression by p16ink4 requires functional retinoblastoma protein. Proc Natl Acad Sci USA 1995 ; 92 : Merlo A, Herman JG, Mao L, Lee DJ, Gabrielson E, Burger PC, et al. 5 CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumour suppressor p16/cdkn2/mts1 in human cancers. Nat Med 1995 ; 1: Meyerson M, Harlow E. Identification of G1 kinase activity for cdk6, a novel cyclin D partner. Mol Cell Biol 1994 ; 14 : Michalides R, Van Veelen N, Hart A, Loftus B, Wientjens E, Balm A. Overexpression of cyclin D1 correlates with recurrence in a group of forty-seven operable squamous cell carcinomas of the head and neck. Cancer Res 1995 ; 55 : Minshull J, Pines J, Golsteyn R, Standart N, Mackie S, Colman A, et al. The role of cyclin synthesis, modification and destruction in the control of cell division. J Cell Sci 1989 ; 12 Suppl : Miyashita T, Reed JC. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell 1995 ; 80 :

20 128 J.F. Viallard et al. 100 Morse L, Chen D, Franklin D, Xiong Y, Chen-Kiang S. Induction of cell cycle arrest and B cell terminal differentiation by CDK inhibitor p18(ink4c) and IL-6. Immunity 1997 ; 6: Motokura T, Bloom T, Kim HG, Juppner H, Ruderman JV, Kronenberg HM, et al. A novel cyclin encoded by a bcl1-linked candidate oncogene. Nature 1991 ; 350 : Muller H, Moroni MC, Vigo E, Petersen BO, Bartek J, Helin K. Induction of S-phase entry by E2F transcription factors depends on their nuclear localization. Mol Cell Biol 1997 ; 17 : Nevins JR, Leone G, DeGregori J, Jakoi L. Role of the Rb/E2F pathway in cell growth control. J Cell Physiol 1997 ; 173 : Noh SJ, Li Y, Xiong Y, Guan KL. Identification of functional elements of p18ink4c essential for binding and inhibition of cyclindependent kinase (CDK) 4 and CDK6. Cancer Res 1999 ; 59 : Ohi R, Gould KL. Regulating the onset of mitosis. Curr Opin Cell Biol 1999 ; 11 : Ohtsubo M, Theodoras AM, Schumacher J, Roberts JM, Pagano M. Human cyclin E, a nuclear protein essential for the G1-to-S phase transition. Mol Cell Biol 1995 ; 15 : Okuda T, Shurtleff SA, Valentine MB, Raimondi SC, Head DR, Behm F, et al. Frequent deletion of p16ink4a/mts1 and p15ink4b/mts2 in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood 1995 ; 85 : Ophascharoensuk V, Fero ML, Hughes J, Roberts JM, Shankland SJ. The cyclin-dependent kinase inhibitor p27kip1 safeguards against inflammatory injury. Nat Med 1998 ; 4: Pagano M, Pepperkok R, Verde F, Ansorge W, Draetta G. Cyclin A is required at two points in the human cell cycle. EMBO J 1992 ; 11 : Pagano M, Tam SW, Theodoras AM, Beer-Romero P, Del Sal G, Chau V, et al. Role of the ubiquitin-proteasome pathway in regulating abundance of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Science 1995 ; 269 : Painter RB, Young BR. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia : a new explanation. Proc Natl Acad Sci USA 1980 ; 77 : Palmero I, McConnell B, Parry D, Brookes S, Hara E, Bates S, et al. Accumulation of p16ink4a in mouse fibroblasts as a function of replicative senescence and not of retinoblastoma gene status. Oncogene 1997 ; 15 : Pardee AB. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proc Natl Acad Sci USA 1974 ; 71 : Parry D, Bates S, Mann DJ, Peters G. Lack of cyclin D-Cdk complexes in Rb-negative cells correlates with high levels of p16ink4/mts1 tumour suppressor gene product. EMBO J 1995 ; 14 : Parry D, Mahony D, Wills K, Lees E. Cyclin D-CDK subunit arrangement is dependent on the availability of competing INK4 and p21 class inhibitors. Mol Cell Biol 1999 ; 19 : Paulovich AG, Toczyski DP, Hartwell LH. When checkpoints fail. Cell 1997 ; 88 : Pines J, Hunter T. Human cyclins A and B1 are differentially located in the cell and undergo cell cycle-dependent nuclear transport. J Cell Biol 1991 ; 115 : Pines J, Hunter T. The differential localization of human cyclins A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. EMBO J 1994 ; 13 : Pines J. Cyclins and their associated cyclin-dependent kinases in the human cell cycle. Biochem Soc Trans 1993 ; 21 : Pines J. The cell cycle kinases. Semin Cancer Biol 1994 ;5: Pines J, Hunter T. Human cyclin A is adenovirus E1A-associated protein p60 and behaves differently from cyclin B. Nature 1990 ; 346 : Polyak K, Kato JY, Solomon MJ, Sherr CJ, Massague J. Roberts JM, et al. p27kip1, a cyclin-cdk inhibitor, links transforming growth factor-beta and contact inhibition to cell cycle arrest. Genes Dev1994;8: Pomerantz J, Schreiber-Agus N, Liegeois NJ, Silverman A, Alland L, Chin L, et al. The Ink4a tumor suppressor gene product, p19arf, interacts with MDM2 and neutralizes MDM2 s inhibition of p53. Cell 1998 ; 92 : Ponce-Castaneda MV, Lee MH, Latres E, Polyak K, Lacombe L, Montgomery K, et al. p27kip1 : chromosomal mapping to 12p12-12p13.1 and absence of mutations in human tumors. Cancer Res 1995 ; 55 : Poon RY, Hunter T. Dephosphorylation of Cdk2 Thr160 by the cyclin-dependent kinase-interacting phosphatase KAP in the absence of cyclin. Science 1995 ; 270 : Quelle DE, Zindy F, Ashmun RA, Sherr CJ. Alternative reading frames of the INK4a tumor suppressor gene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycle arrest. Cell 1995 ; 83 : Quesnel B, Preudhomme C, Philippe N, Vanrumbeke M, Dervite I, Lai JL, et al. p16 gene homozygous deletions in acute lymphoblastic leukemia. Blood 1995 ; 85 : Rane SG, Dubus P, Mettus RV, Galbreath EJ, Boden G, Reddy EP, et al. Loss of Cdk4 expression causes insulin-deficient diabetes and Cdk4 activation results in beta-islet cell hyperplasia. Nat Genet 1999 ; 22 : Resnitzky D, Gossen M, Bujard H, Reed SI. Acceleration of the G1/S phase transition by expression of cyclins D1 and E with an inducible system. Mol Cell Biol 1994 ; 14 : Reynisdottir I, Massague J. The subcellular locations of p15(ink4b) and p27(kip1) coordinate their inhibitory interactions with cdk4 and cdk2. Genes Dev 1997 ; 11 : Reynisdottir I, Polyak K, Iavarone A, Massague J. Kip/Cip and Ink4 Cdk inhibitors cooperate to induce cell cycle arrest in response to TGF-beta. Genes Dev 1995 ; 9: Rivard N, L Allemain G, Bartek J, Pouyssegur J. Abrogation of p27kip1 by cdna antisense suppresses quiescence (G0 state) in fibroblasts. J Biol Chem 1996 ; 271 : Rosenberg AR, Zyndy F, Le Deist F, Mouly H, Métézeau P, Bréchot C, et al. Overexpression of human cyclin A advances entry into S phase. Oncogene 1995 ; 10 : Rosenblatt J, Gu Y, Morgan DO. Human cyclin-dependent kinase 2 is activated during the S and G2 phases of the cell cycle and associates with cyclin A. Proc Natl Acad Sci USA 1992 ; 89 : Roy LM, Swenson KI, Walker DH, Gabrielli BG, Li RS, Piwnica- Worms H, et al. Activation of p34cdc2 kinase by cyclin A. J Cell Biol 1991 ; 113 : Ruas M, Peters G. The p16ink4a/cdkn2a tumor suppressor and its relatives. Biochim Biophys Acta 1998 ; 1378 : F115-F Russo AA, Jeffrey PD, Patten AK, Massague J, Pavletich NP. Crystal structure of the p27kip1 cyclin-dependent-kinase inhibitor bound to the cyclin A-Cdk2 complex. Nature 1996 ; 382 : Russo JJ, Bohenzky RA, Chien MC, Chen J, Yan M, Maddalena D, et al. Nucleotide sequence of the Kaposi sarcomaassociated herpesvirus (HHV8). Proc Natl Acad Sci USA 1996 ; 93 : Sanchez Y, Wong C, Thoma RS, Richman R, Wu Z, Piwnica- Worms H, et al. Conservation of the Chk1 checkpoint pathway in mammals : linkage of DNA damage to Cdk regulation through Cdc25. Science 1997 ; 277 : Savitsky K, Bar-Shira A, Gilad S, Rotman G, Ziv Y, Vanagaite L, et al. A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase. Science 1995 ; 268 : Sebastian B, Kakizuka A, Hunter T. Cdc25M2 activation of cyclindependent kinases by dephosphorylation of threonine-14 and tyrosine-15. Proc Natl Acad Sci USA 1993 ; 90 : Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cellcycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature 1993 ; 366 : Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16ink4a. Cell 1997 ; 88 : Seto M, Yamamoto K, Lida S, Akao Y, Utsumi KR, Kubonishi I, et al. Gene rearrangement and overexpression of PRAD1 in lymphoid malignancy with t(11 ;14)(q13 ; q32) translocation. Oncogene1992;7: Shapiro GI, Harper JW. Anticancer drugs targets : cell cycle and checkpoint control. J Clin Invest 1999 ; 104 :