Le cycle de division cellulaire et sa régulation

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1 Oncologie (2003) 5: pringer-verlag Le cycle de division cellulaire et sa régulation L. eijer Équipe Cycle Cellulaire, CNR, tation Biologique, F Roscoff, France ORIGINAL Résumé : Le cycle de division cellulaire est constitué de plusieurs étapes hautement régulées et synchronisées. Les protéine kinases (en particulier les kinases cyclinesdépendantes) et les protéases jouent un rôle prépondérant dans le déclenchement, le déroulement et le couplage de ces étapes. armi les régulateurs du cycle cellulaire décrits, certains constituent la cible de produits potentiellement anticancéreux. Cet article passe en revue les différentes étapes du cycle cellulaire et leur régulation. ots clés : Cycle de division cellulaire rolifération cellulaire Cancer Agents anti-mitotiques Kinases cycline-dépendantes The cell division cycle and its regulation Abstract: The cell division cycle is constituted of several highly regulated and synchronized phases. rotein kinases (cyclin-dependent kinases in particular) and proteases play an essential role in the initiation of, progression through and coupling of these phases. Among the numerous cell cycle regulators that have been described, some constitute the target of potential anti-cancer drugs. This article reviews the different phases of the cell cycle and their regulation. Keywords: Cell division cycle Cell proliferation Cancer Anti-mitotic agents Cyclin-dependent kinases Introduction La division cellulaire est le processus fondamental par lequel une cellule-mère donne deux cellules-filles identiques entre elles et à la cellule dont elles dérivent. Le «cycle cellulaire» est essentiellement constitué de deux temps, l interphase, au cours de laquelle les chromosomes sont répliqués, et la mitose, au cours de laquelle les chromosomes se répartissent entre les deux cellulesfilles (Fig. 1). En réalité, à côté de ce cycle de division chromosomique, existent un cycle cytoplasmique, un cycle centrosomique, un cycle nucléolaire, un cycle de l appareil de Golgi. Tous ces événements sont interdépendants et parfaitement couplés [11, 13, 14]. La division cellulaire est un processus essentiel au développement embryonnaire, bien entendu, mais également vital pendant toute la vie de l organisme adulte. Ainsi l être humain adulte est constitué de milliards de cellules, provenant toutes, par divisions cellulaires successives, de la cellule initiale, l œuf fécondé. Une fois la taille adulte atteinte, les divisions continuent. Tous les jours un milliard de cellules doivent être renouvelées, pour remplacer les cellules qui sont perdues de façon continue, en particulier au niveau de la peau, du tube digestif et du système hématopoïétique. Ce mécanisme de division cellulaire est extrêmement complexe et régulé par un grand nombre de protéines intervenant très transitoirement et dans un ordre précis, permettant ainsi la succession précise des différentes étapes du cycle cellulaire. Il arrive occasionnellement qu une anomalie de régulation de la division apparaisse dans une cellule en cycle. Cette anomalie peut se transmettre dans les cellules-filles, elle libère alors la cellule des multiples régulations qui limitent ses capacités de division. L apparition de ces anomalies est favorisée par les produits cancérigènes (produits de combustion du tabac, amiante, etc.). Une fois les anomalies établies, la cellule devient «cancéreuse». Elle va se développer librement conduisant à une tumeur (1 mm de diamètre : 1 million de cellules cancéreuses ; 1 cm de diamètre : 1 milliard de cellules cancéreuses...), qui, par «métastase», va quitter son tissu de départ et essaimer dans tout l organisme, entraînant des conséquences dramatiques pour tout l organisme. On comprend alors l intérêt d étudier les régulateurs de la division cellulaire, dont les anomalies sont souvent à l origine des cancers. La division cellulaire a été découverte il y a plus de 150 ans, et a fait l objet de très nombreuses études en raison de son caractère fondamental pour toute vie. En revanche sa régulation intracellulaire n est connue que depuis quelques décennies, grâce aux travaux entrepris sur des modèles Abréviations : AhR, aryl hydrocarbon receptor ; AC, anaphase promoting complex ; AT, ataxia telangiectasia mutated ; ATR, AT- and Rad3-related ; CDK, cyclin-dependent kinases ; DDK, Dbf4-dependent kinase ; As, microtubule-associated proteins ; CAK, mammalian centromere-associated kinesin ; C, mini-chromosome maintenance ; D2, murine double minute 2 ; ps1, monopolar spindle ; RLC, myosin regulatory light chain ; NE, nuclear envelope ; NEBD, nuclear envelope breakdown ; ORC, origin recognition complex ; lk1, olo-like Kinase 1 ; IKKs, phosphatidylinositol 3-kinase-like kinases ; pre-rc, complexe pré-réplicatif ; CF, kp1-cullin-f-box ; Tome-1, trigger of mitotic entry.

2 312 ONCOLOGIE biologiques aussi variés que les levures, les embryons d oursin, les ovocytes d étoile de mer et d amphibiens ou les cellules de mammifères en culture. En effet l extrême conservation des gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire a permis des études croisées, des échanges d outils moléculaires. La complémentarité d approche et la convergence des résultats ont finalement abouti à l établissement d un modèle général de contrôle intracellulaire de la division. Tous ces travaux ont été couronnés par l attribution en Octobre 2001 du rix Nobel de hysiologie et de édecine à trois acteurs essentiels du décryptage des mécanismes régulant le cycle cellulaire, les Britanniques Tim Hunt et aul Nurse, et l Américain Leyland Hartwell. Le cycle cellulaire reste un grand sujet d études en biologie cellulaire et moléculaire comme en témoigne la dizaine d articles publiés chaque jour dans ce domaine, les multiples applications possibles de la compréhension de la division cellulaire et, en définitive, l intérêt montré par l industrie pharmaceutique. Interphase DNA replication Interphase Chromosome duplication Restriction point Cell Division Cycle rophase rometaphase etaphase Anaphase Telophase itogenic signals G0 itosis NEBD itosis Cytokinesis Quiescence Fig. 1 Le cycle de division cellulaire. Interphase et mitose Fig. 2 Les phases et les événements majeurs du cycle de division cellulaire Les phases du cycle de division cellulaire Lorsqu elles ne se divisent pas les cellules sont dites en quiescence ou aussi en phase G0. ous l effet de signaux mitogènes, elles entament un cycle de division (Fig. 2). Le cycle cellulaire est classiquement divisé en quatre phases,,,,. Au cours de la phase (de «Gap», intervalle), les cellules passent par le point de restriction, une sorte de point de non-retour à partir duquel le cycle est irréversiblement engagé et l entrée en division ne dépend plus de la présence des facteurs mitogènes. La phase est préparatrice à la phase au cours de laquelle l ADN est répliqué. La phase précède la phase, ou mitose, au cours de laquelle les chromosomes dédoublés sont répartis dans les deux cellules-filles, grâce au fuseau de division (planche I). Cette phase est classiquement découpée en cinq périodes : la prophase (terminée par la rupture de l enveloppe nucléaire ; NEBD, «nuclear envelope breakdown»), la prométaphase, la métaphase, l anaphase et la télophase. La cytokinèse achève la division de la cellule. Lorsque les cellules cessent toute prolifération, sous l effet de signaux anti-mitogènes ou suite à la disparition des agents mitogènes, elles quittent le cycle cellulaire et retournent en phase de quiescence. Ces phases se retrouvent dans la plupart des divisions cellulaires, à l exception notoire des premières divisions embryonnaires chez la Drosophile ou le Xénope, caractérisées par une succession rapide de phases et. Les quatre phases s enchaînent de façon coordonnée, chaque phase ne pouvant commencer que lorsque la précédente s est déroulée correctement. En effet de nombreux mécanismes de contrôle («checkpoints») assurent une sorte de «contrôle qualité» à chaque étape et bloquent le déroulement du cycle lorsqu une anomalie (endommagement de l ADN, ADN non complètement répliqué, chromosomes non attachés au fuseau mitotique, par exemple) est détectée [21, 23]. Les kinases cyclinedépendantes L une des découvertes majeures dans le domaine du cycle cellulaire a été l identification d une famille de protéines kinases, les kinases cyclines-dépendantes («cyclindependent kinases», CDKs). Ces protéines kinases jouent en effet un rôle essentiel dans le déclenchement, le contrôle et la succession harmonieuse des différentes phases du cycle. Les CDKs sont actives uniquement sous forme d un complexe

3 313 ORIGINAL lanche I Les événements morphologiques de la mitose. Observation en microscopie à fluorescence de cellules tk1 fixées au glutaraldéhyde à divers stades de la mitose puis perméabilisées et colorées. Les microtubules (rouge) ont été visualisés par des méthodes d immunofluorescence indirecte, et les chromosomes (vert) mis en évidence par le colorant d ADN Hoechst Échelle (I) : 10 µm. A) Début de prophase : un centrosome proéminent accolé au noyau, dans un abondant réseau de microtubules cytoplasmiques en organisation interphasique. B) Fin de prophase : les centrosomes sont répliqués et se sont répartis de part et d autre du noyau. L enveloppe nucléaire est encore intacte. C) Rupture de l enveloppe nucléaire et début de la pro-métaphase : les chromosomes commencent à interagir avec les centrosomes pour former un fuseau. Le cytoplasme est toujours rempli de microtubules interphasiques. D) ro-métaphase dans une cellule dont tous les chromosomes ne sont pas encore correctement orientés. Le fuseau est très allongé. E) Fin de pro-métaphase : un dernier chromosome n est pas encore aligné. F) étaphase : tous les chromosomes sont bien orientés et alignés à l équateur du fuseau (plaque métaphasique). G) Anaphase : les chromosomes se séparent vers les pôles du fuseau. Ils apparaissent jaunes car ils sont entourés d un réseau microtubulaire dense. H) Télophase : les chromosomes ont atteint les pôles du fuseau. Une structure microtubulaire («mid-body») se forme a mi-chemin entre les deux lots de chromosomes. Une constriction marque le site de la cytokinèse. I) Fin de mitose : les deux cellules-filles produites par une division récente sont encore reliées par une structure microtubulaire («stem body»). (Tiré de CL Rieder & A Khodjakov, itosis and checkpoints that control progression through mitosis in vertebrate somatic cells. rogress in Cell Cycle Research, vol. 3, avec la permission de lenum ress, New York).

4 314 ONCOLOGIE entre une sous-unité catalytique (CDK) et une sous-unité régulatrice (cycline). D après le séquençage du génome humain il existerait 13 CDKs et 25 cyclines, mais toutes les possibilités de formation de complexes CDK/cycline ne sont pas encore connues. ar ailleurs certaines CDKs sont impliquées dans des fonctions autres que la régulation du cycle cellulaire. ar exemple, CDK5 et 1 ont des fonctions neuronales ; CDK7, CDK8, CDK9 jouent un rôle dans la transcription. chématiquement (Fig. 3), CDK4 et CDK6, associées à des cyclines de type D, régulent le déroulement de la phase. uis /cycline E prend le relais pour assurer la transition /, suivie par / cycline A qui assure le contrôle de la phase. /cycline A intervient en, /cycline B régule la transition / et l entrée en mitose. Quatre niveaux de régulation contribuent à l activité transitoire de ces CDKs : l assemblage transitoire des complexes CDKs/cyclines, lié à une durée de vie des cyclines généralement courte (succession rapide de synthèse, d interaction avec une CDK, de dégradation ubiquitinedépendante) (Fig. 3) ; des modifications post-traductionnelles essentiellement des phosphorylations/déphosphorylations (Fig. 4) conduisant à l activation ou à l inactivation des CDKs. Ainsi les CDKs sont phosphorylées sur deux résidus adjacents (Thréonine-14 et Tyrosine-15 pour ) situés au bord de la poche de fixation de l AT. Cette phosphorylation inhibitrice est levée par une famille de phosphatases très particulières, les phosphatases CDC25 A, B, C. En revanche la phosphorylation d un résidu situé sur la «boucle T», Thr161 pour, est essentielle à l activation des CDKs. Cette phosphorylation est catalysée par CDK7 associé à la cycline H et un co-facteur, at1 ; des associations transitoires avec des inhibiteurs protéiques (Fig. 5). Il en existe deux types, la famille INK4, dont les membres Fig. 3 Cyclin E Les CDKs contrôlent le cycle cellulaire D Fig. 4 CDC25B CDC25A Cyclin E CDK4-6 Cyclin D CDC25B CDK4-6 Cyclin D CDK7 AT1 Cyclin H hosphorylations et déphosphorylations régulent les CDKs E CDC25B p21 CI1 p57 KI2 Fig. 5 p27 KI1 CDC25A p16 INK4A p15 INK4B p18 INK4C p19 INK4D Cyclin E CDC25B CDK4-6 Cyclin D Les CDKs sont régulées par des inhibiteurs protéiques CDK7 AT1 Cyclin H CDK7 AT1 Cyclin H CDK7 AT1 Cyclin H CDC25A CDC25B CDC25C CDC25A CDC25B CDC25C

5 F G0/ transition des changements très importants de localisation intracellulaire, en général également régulée par phosphorylations et déphosphorylations. 315 G yc Farnesyl transferase transcription Ras-Rho/GT ax Erk1/2 AKT AK1/ROCK G0 EK1 DK1 cdc42/rac Raf-1 I3K I3K Tyrosine kinase receptors G rotein coupled receptors Fig. 6 Régulation de la transition G0/ Growth factors itogen stimuli AhR prb transcription? transcription prb E2F D E2F prb D Cyclin E CDK4-6 kp1 Cyclin D kp2 p21 CI1 p27 KI1 p16 INK4A AKT progression E2F prb D p130 E2F p107 E2F La transition G0/ Il existe une grande variété de facteurs mitogènes, dont la description dépasse le cadre de ce chapitre [10]. Ces facteurs agissent, en général, par l intermédiaire de récepteurs trans-membranaires de type tyrosine kinases ou encore couplés à des protéines G. Les protéines G de type Rho, Ras sont souvent modifiées de façon post-traductionnelle par prénylation du coté C-terminal. Ces prénylations, catalysées par une farnésyltransférase et une géranylgéranyl transférase, sont essentielles pour le fonctionnement de la voie de signalisation. ensuit alors l activation d une cascade de protéine kinases, de type AKKK/ AKK/AK, telle Raf/EK1/ Erk1/2 ou bien I3K/DK1/AKT, par exemple, comme illustré très schématiquement dans la Fig. 6. En général ces cascades conduisent à la stimulation de la transcription de gènes essentiels pour l entrée en division (en particulier cyclines D, CDKs). Une autre voie importante également impliquée dans l entrée en division est celle de l oncogène yc. yc forme un dimère avec la protéine ax, dimère qui active la transcription des gènes de cyclines D et E, de CDC25A, de CDK4, d E2F [24]. ORIGINAL Fig. 7 Régulation de la progression en interfèrent avec la fixation des cyclines de type D sur la CDK, et la famille CI/KI, dont les membres se fixent sur les complexes CDK/ cyclines et les inactivent [6]. De façon surprenante, p21 CI1 et p27 KI1 se fixent sur CDK4 sans en inhiber l activité kinase, ils sont en fait nécessaires pour l assemblage du complexe CDK4/cycline D et sa translocation dans le noyau. ar contre ces deux protéines sont d excellents inhibiteurs de / cycline E. L apparition de p21 CI1 et p27 KI1 permet donc la formation des complexes CDK4/cyclines D, tout en retardant l activation des complexes /cycline E. Enfin, /cycline E, en phosphorylant p27 KI1, conduit à son ubiquitination par kp1/kp2, et à sa destruction par le protéasome [4]. Cette élimination de p27 KI1 contribue à l entrée en phase ; La progression en Le début du cycle cellulaire nécessite la transcription d un certain nombre de gènes, tels ceux des cyclines D et E, p21 CI1, p27 KI1 et des gènes sous le contrôle des facteurs de transcription de la famille E2F, comme la cycline E (Fig. 7). Les cellules sont maintenues en grâce aux protéines de la famille du rétinoblastome, prb, p107 et p130 («pocket proteins»). Ces suppresseurs de tumeurs bloquent le cycle cellulaire en s associant avec E2F. En effet, en complexe avec prb, les facteurs E2F, associés au co-facteur

6 316 ONCOLOGIE de transcription D, restent inactifs : prb et p107, p130 maintiennent donc la cellule en. Au cours de, les CDKs phosphorylent prb, ce qui conduit à la dissociation du complexe Rb/E2F, et donc à la libération de facteurs E2F actifs. Il semblerait que CDK4-6, associée aux cyclines D, initie le processus et permette une activation transcriptionnelle partielle. Une phosphorylation supplémentaire de prb par /cycline E permet la libération complète des facteurs E2F, et donc leur action complète comme activateurs transcriptionnels. La famille E2F régule l expression de gènes impliqués dans la transition /, mais aussi de gènes codant des protéines contrôlant la réplication (C, cdc6), des enzymes nécessaires à la synthèse d ADN. E2F1, E2F2 et E2F3 sont des activateurs transcriptionnels puissants contrôlés par prb. E2F4 et E2F5 sont des activateurs plus faibles contrôlés par p107 et p130. On comprend pourquoi les inhibiteurs naturels de CDKs, des familles INK4 et CI1/KI, en maintenant prb sous forme hypo-phosphorylée, donc liée à E2F, constituent des inhibiteurs puissants du cycle cellulaire. L inactivation de ces inhibiteurs permet la progression de la cellule à travers la phase et la transition /. Un autre facteur, mal connu, pourrait jouer un rôle important dans la régulation de la transition /. Il s agit du récepteur orphelin AhR («Aryl Hydrocarbon Receptor»), également connu sous le nom de «récepteur de la dioxine». En présence d un ligand, AhR migre dans le noyau et devient un activateur transcriptionnel (il induit notamment par exemple la p27 KI1 ). AhR se lie à prb, mais on ne connaît pas la fonction de cette interaction. La fin de préparation à la transition / Fig. 8 cdt1 C2-7 cdc6 pre-rc C2-7 ORC ORC ORC La préparation à la transition / commence tout d abord par l assemblage d un complexe préréplicatif (pre-rc) (Fig. 8). L ORC («Origin Recognition Complex»), un complexe de six sous-unités (Orc1-6), lie l AT, puis se fixe sur l ADN au niveau des origines de réplication. L ORC recrute ensuite deux facteurs essentiels, cdc6, une ATase, et Cdt1, un facteur de transcription. Ces deux facteurs essentiels interviennent ultérieurement pour permettre l accrochage des six protéines (C2-7) du complexe C («mini-chromosome maintenance»). Inhibition de la re-réplication pendant les autres phases du cycle AT Quatre mécanismes importants empêchent que plusieurs mécanismes réplicatifs se succèdent en phase, et (Fig. 9). Tout d abord, les CDKs actives phosphorylent trois substrats, C, cdc6 et Late progression DNA ise en place des complexes pré-réplicatifs en fin de geminin CDKs Cyclins cdt1 C cdc6 pre-rc C2-7 ORC ORC Inhibition of re-replication DNA Fig. 9 écanismes d inhibition de la re-réplication pendant les phases, et ORC, empêchant ainsi la formation de nouveaux complexes préréplicatifs. La phosphorylation de cdc6 par l inactive en provoquant sa dégradation ou son export hors du noyau. ar ailleurs cdt1 est la cible de la geminine, un inhibiteur naturel de réplication qui apparaît dès le début de la phase et qui reste présent pendant, et. Enfin la présence de l enveloppe nucléaire contribue à l inhibition de la re-réplication. La transition / lusieurs protéines et complexes protéiques doivent s associer aux complexes pré-réplicatifs afin que la synthèse d ADN puisse commencer (Fig. 10). La protéine C10/ Dna43 se fixe tout d abord au complexe pré-réplicatif. La kinase cdc7 commence par activer le complexe pré-réplicatif en fin de

7 Fig. 10 p27 KI1 p27 KI1 kp1 kp2 roteasome Régulation de la transition / 3 5 leading strand lagging strand 3 Fig replication fork Cyclin E cdc7 Dbf4 C2-7 ORC pre-rc Okazaki fragments DNA replication phase (Fig. 10). La kinase /cyclin E intervient ensuite et le complexe peut alors fixer cdc45, un facteur essentiel qui permettra l accrochage de l ADN polymérase α. L activité est indispensable pour l association de cdc45 à la chromatine. Une ADN hélicase est alors activée au niveau des fourches de réplication, et les ADN polymérases peuvent commencer à agir. La topologie de l ADN est maintenue par l activité de plusieurs topoisomérases [2]. L assemblage de la machinerie de synthèse de l ADN et l initiation de son activité sont donc contrôlés par deux kinases, cdc7 et. L activité de cdc7 dépend de la présence transitoire de Dbf4, comme l activité des CDKs dépend de la présence transitoire des cyclines. DNA topoisomerases DNA polymerase DNA helicase sliding clamp newly synthesized strands hase, réplication de l ADN adapté de Alberts [1] 5 3 cdc45 C10 C2-7 ORC C10 C2-7 ORC replication forks DNA polymerase DNA helicase clamp loader / transition leading strand template RNA primer DNA primase parental DNA DNA topoisomerase ssdna-binding protein lagging strand template Le niveau de Dbf4 est maximal en phase et est la résultante des activités de synthèses protéiques et de destructions protéolytiques. Cette régulation de cdc7/dbf4 explique qu on lui donne parfois le nom de DDK (Dbf4-dependent kinase) [12]. Cdc7/Dbf4 phosphoryle essentiellement les protéines C, en particulier C2. Le recrutement de aux origines de réplications se fait grâce aux ORC et à cdc6. L activité CDK est indispensable à la réplication de l ADN, mais la plupart des substrats qui doivent être phosphorylés restent encore inconnus. /cycline E phosphoryle p27 KI1, ce qui stimule son ubiquitination par kp1/kp2, et conduit à sa destruction par le protéasome, contribuant à la transition / [4]. La phase Les mécanismes moléculaires de la réplication de l ADN sont complexes et dépassent le cadre de ce chapitre. Nous ne les décrirons que très brièvement (Fig. 11) [1]. La réplication de l ADN est catalysée par l ADN polymérase, une enzyme qui utilise un brin d ADN comme base de synthèse («template») de l autre brin par additions successives, sur l extrémité 3, de nucléotides complémentaires fournis par les précurseurs dat, dtt, dgt et dct. L élongation de la chaîne d ADN se fait donc dans le sens 5 3. Dans la cellule, la réplication de la molécule d ADN doublebrin se fait dans une structure en forme de «Y», la fourche de réplication («replication fork»). Celle-ci progresse graduellement le long de la double hélice parentale, générant deux doubles hélices filles derrière elle, formant les deux bras du «Y». Chacune avance dans une direction chimique différente, 3 5 et 5 3. L ADN polymérase ne fonctionne que sur un des brins, dans le sens 5 3 («leading strand»). La synthèse de l ADN sur l autre brin (3 5, «lagging strand») fait donc appel à un autre mécanisme. En effet, sur ce brin, l ADN polymérase produit de longues séries de fragments, les «fragments d Okazaki», qui sont ensuite reliés les uns aux autres par une ADN ligase. armi les nombreuses protéines qui interviennent (au moins 27 au niveau de la fourche de réplication), mentionnons simplement l ADN hélicase, qui déploie la double hélice et l ADN primase qui produit les amorces pour les fragments d Okazaki. La phase, généralités La phase comporte des phases décrites essentiellement sur la base de la morphologie des chromosomes et de l enveloppe nucléaire, phases décrites il y a plus de cent ans (Fig. 12, lanche I) : la prophase correspond à la fin de condensation des chromosomes, rupture de l enveloppe nucléaire ; 317 ORIGINAL

8 318 ONCOLOGIE la prométaphase est la période de formation du fuseau et du début d alignement des chromosomes ; la métaphase est la phase d alignement des chromosomes dans le fuseau, à équidistance des pôles ; l anaphase voit la disjonction des chromosomes ; la télophase est une période caractérisée par le mouvement des chromosomes vers les pôles, la disparition du fuseau, la décondensation des chromosomes et le début de la cytokinèse. Une nouvelle nomenclature, s appuyant également sur les événements moléculaires qui contrôlent et accompagnent ces événements morphologiques, a été proposée récemment [20] (Fig. 12). Elle comporte cinq transitions, chacune étant caractérisée par l activité de protéines kinases bien particulières et par la succession de destructions protéolytiques de certains substrats : la transition 1 chevauche la fin de et la plus grande partie de la prophase. Elle est caractérisée par l activité des kinases CDK/ cycline A, lk1, Aurora-A. endant cette période /cycline B est inactive et cytoplasmique ; la transition 2 est caractérisée par l activation de /cycline B par CDC25 et sa translocation vers le noyau, suivie par la rupture de l enveloppe nucléaire ; la transition 3 correspond bien à la prométaphase. Un certain nombre de critères comme l attachement des kinétochores au fuseau, l activation de l «anaphase promoting complex» (AC/cdc20) (voir paragraphe sur le contrôle de l attachement des chromatides aux microtubules) modulé par l attachement des microtubules au kinétochore, doivent être satisfaits pour que la mitose se termine. La cycline A est détruite à ce stade, alors que la cycline B reste présente ; la transition 4. Au cour de cette phase, les kinétochores étant tous reliés à des microtubules, cdc20 n est plus inhibée par AD2, L phase Fig. 12 ro Telo transition 1 ret eta Ana hase, généralités / transition Aurora-A lk1 transition 2 transition 3 cdc20 transition 4 transition 5 urvivin Lamins Nucleolin CDK7 AT1 Cyclin H Condensin eroxiredoxin et peut donc activer complètement l activité AC. AC peut donc s attaquer d une part à la sécurine, conduisant à la disjonction des chromatides, et, d autre part, à la cycline B, permettant l entrée en télophase [9] ; la transition 5 est caractérisée par le fait que, la cycline B étant détruite, est inactivée et une nouvelle enveloppe nucléaire peut se reformer. La cytokinèse a lieu, et la cellule se retrouve en interphase. Cdc20 est dégradée et remplacée par cdh1 (ou hct1, «fizzy-related protein») qui se lie à l AC, permettant la dégradation de nouvelles protéines, telles Aurora-A et Tome-1. AC cdh1 AC Nuclear translocation Cyclin F Importin > AD2 cdc20 CDC25C CDC25B CDC25A Wee1 yt1 Fig. 13 Régulation de la transition / et de l activité de /cycline B chromosome condensation NEBD chromosome alignment spindle formation chromosome alignment on plate cytokinesis spindle disassembly NE reformation lk1 KA Tome-1 AC ROTEOLYI Wee1 securin cdc20 Tome-1 Aurora-A KB/AKT p90rk Erk1/2 AC/cdh1 reste présent dans la cellule jusqu à l entrée dans le prochain cycle de division. Les transitions / et prophase/métaphase (Fig. 13) La phase est souvent présentée comme une phase «de préparation» à la mitose, mais ces mots masquent davantage notre méconnaissance de cette partie du cycle cellulaire. Elle est marquée par le début de la condensation des chromosomes. La kinase /cycline A est active en, mais ses fonctions demeurent inconnues. a participation à l activation de / cycline B est une hypothèse.

9 N phase Fig. 14 Chromosome condensation ro ret Telo eta Ana NEBD Chromosome decondensation Régulation de la condensation de la chromatine???? Histone H3 CEN-A Histone H1 Condensin CA-C Topo II CA-E CA-D2 umo CA-G CA-H Histone H3 dephosphorylation La transition prophase/métaphase, souvent abusivement nommée transition /, est contrôlée par la kinase /cycline B. En - début de prophase, est présente sous forme monomérique inactive. uis, au fur et à mesure de la synthèse de cycline B, le complexe /cycline B s accumule pour atteindre un niveau maximal en prophase. À ce stade, le complexe est encore inactif car les deux résidus Thr-14 et Tyr-15 sont phosphorylés par les kinases Wee1 et yt1. En revanche la Thr-161, dont la phosphorylation est indispensable à l activité de la kinase, est phosphorylée par CDK7/ cycline H/at1. Quatre mécanismes sont responsables de l activation de / cycline B lorsque la cellule est prête à entrer en phase (Fig. 13) : tout d abord les kinases inhibitrices Wee1 et yt1 sont inactivées par phosphorylation par les kinases KB/AKT et p90 RK. De plus, Tome-1 («trigger of mitotic entry»), associé à kp1, est responsable de la dégradation rapide de Wee1 par protéolyse en fin de ; parallèlement, les deux résidus inhibiteurs, Thr-14 et Tyr-15, sont déphosphorylés par les phosphatases CDC25. Les fonctions respectives de chacune des trois CDC25 n ont pas encore été clairement établies. Il semblerait que CDC25B amorce l activation de /cycline B. CDC25C est ensuite activée par phosphorylation par, d une part, /cycline B, générant ainsi un système d auto-amplification, et d autre part, LK1. CDC25A est stabilisée par phosphorylation par /cycline B ; la cycline B est phosphorylée par diverses kinases, ce qui est indispensable à l interaction entre CDC25 et, donc à l activation de la kinase ; le complexe /cycline B migre dans le noyau, où il trouve la plupart de ses substrats (lamines, nucléoline, condensine, par exemple). Les interactions de la cycline B1 avec la cycline F et l importine β régulent la localisation nucléaire du complexe /cycline B. La condensation des chromosomes Aurora-B La condensation des chromosomes est parmi les premiers évènements morphologiques de la division qui aient été décrits. Comment est-elle régulée (Fig. 14)? La condensine, un complexe constitué de 5 sousunités, est le principal responsable du phénomène de condensation chromosomique. es sous-unités sont, chez l homme, hca-c, hca-e, hca-d2, hca-g et hca-h. Elles sont très bien conservées chez les eucaryotes et ont une nomenclature complexe [13]. La condensine conduit une seule réaction : le super-enroulement, AT-dépendant, de la molécule d ADN dans des conditions topologiques définies. L activité /cycline B est indispensable pour le fonctionnement de la condensine et pour sa modification post-traductionnelle par sumoylation. L interaction topoisomérase II/ semble également être impliquée dans la condensation des chromosomes sans nécessiter pour autant l activité catalytique de. Enfin la phosphorylation de l histone H3 (et de CEN-A, son variant au niveau des centromères) par la kinase Aurora-B est également directement impliquée dans la condensation chromosomique. La déphosphorylation de l histone H3 commence dès la sortie de métaphase et s achève en télophase juste avant la décondensation visible de la chromatine. Le fuseau mitotique Les microtubules sont des assemblages non covalents d hétérodimères de tubuline α et β (Fig. 15). En fin de prophase on assiste à une redistribution spectaculaire de la tubuline intracellulaire (planche I, C-D) qui s organise en un fuseau de microtubules orientés perpendiculairement au futur plan de clivage (Fig. 15). Les sous-unités des microtubules sont en fait dans un état d «instabilité dynamique», c est-à-dire constamment en polymérisation («plus end») et dépolymérisation («minus end»). Ces deux états dépendent d un grand nombre de facteurs (GT/GD, magnésium, température) et de protéines régulatrices. On distingue les protéines qui stabilisent les microtubules (les «microtubuleassociated proteins» (As) A1, A2, A4) et les protéines qui déstabilisent les microtubules (stathmine (Op18), katanine, «mammalian centromere-associated kinesin» (CAK), etc.). armi les protéines motrices (soulignées dans la Fig. 15), Eg5, Klp2, klp1, CEN-E sont des «kinésines» actives du côté «plus» des microtubules, 319 ORIGINAL

10 320 O alors que HET et la dynéine cytoplasmique sont des protéines motrices situées du côté «moins». Les microtubules sont la cible d un grand nombre de produits antimitotiques qui agissent soit en stabilisant soit en déstabilisant les microtubules [13]. Les microtubules se répartissent en un fuseau mitotique sous le contrôle des centrosomes dupliqués (Fig. 15). Les chromosomes établissent une connexion avec les microtubules qui émanent des pôles du fuseau. Cette connexion se fait au cours de la rencontre entre les microtubules et une structure associée au chromosome appelée kinétochore. Tous les chromosomes doivent être attachés et correctement alignés avant de pouvoir être répartis en deux lots identiques. Les chromosomes s organi- sent au centre du fuseau en une «plaque métaphasique» caractéristique (lanche I, F). uis, tirés par chacun des pôles du fuseau, les chromatides vont se diriger vers les pôles du fuseau et se répartir en deux lots identiques. Comment se fait cette séparation des chromatides? ONCOLOGIE La séparation des chromatides et la transition métaphase/anaphase Fig =-tubulin >-tubulin As ChTOG Eg5 Klp2 klp1 CEN-E microtubule stathmin katanin CAK HET dynein icrotubule dynamics Dynamique des microtubules et fuseau mitotique phase Chromatid junction ro Telo eta Ana cohesin microtubule kinetochore centrosome (spindle pole) aster itotic spindle sister chromatids cohesin polar microtubule kinetochore cohesin chromatid centrioles separase separase securin Après la réplication, les deux copies homologues du génome, les chromatides, restent associées grâce à des complexes protéiques connus sous le nom de cohésines (Fig. 16). En métaphase la cohésine est phosphorylée par lk1, elle devient alors sensible à la dégradation protéolytique. En début d anaphase la cohésine est détruite par une caspase particulière, la séparase, elle-même phosphorylée, permettant ainsi la séparation des chromatides. Cellesci sont tirées vers les pôles du fuseau par les microtubules, au niveau des kinétochores. Comment se fait l activation de la séparase (Fig. 17)? La séparase est en fait maintenue sous forme inactive par association avec une autre protéine, la sécurine. L AC («Anaphase romoting Complex») Chromatid disjunction Fig. 16 Jonction et séparation des chromatides au cours de la phase ou cyclosome, un complexe d au moins 11 sous-unités, présente une activité ubiquitine ligase lorsqu il s associe avec cdc20 [18]. Le complexe AC/cdc20 induit l ubiquitination de la sécurine, conduisant à sa destruction protéolytique par le protéasome. C est la destruction de la sécurine par le protéasome qui conduit donc à l activation de la séparase. Une séparase active est ainsi libérée. Ceci conduit à la dissociation du complexe cohésine et à la séparation des chromatides. lusieurs phosphorylations essentielles sont impliquées dans ce processus de séparation des chromosomes (Fig. 17). Ainsi la phosphorylation de la cohésine (sousunité cc1) par la kinase lk1 la rend particulièrement sensible à la séparase. La phosphorylation de l AC par /cycline B contribue à son activation. Enfin, la séparase, quant à elle, doit également être phosphorylée par /cycline B pour devenir active.

11 Q phase ro Telo eta Ana Chromatid disjunction cohesin i AC/cdc20 conduit à la destruction de la sécurine, celle-ci n est pas son unique substrat. En effet, le complexe est également en partie responsable de la destruction de la cycline B, un événement qui a plusieurs conséquences physiologiques importantes, dépendant toutes directement de la chute de l activité : la disparition du fuseau, le déclenchement de la cytokinèse, la transition vers la phase [9]. La destruction de la cycline B en anaphase suffit aussi à restaurer la transcription d ADNr (localisé au niveau nucléolaire), inactivée par la /cycline B en phase. cohesin lk1 Fig. 17 Régulation de la séparation des chromatides au cours de l anaphase ro pindle eta Assembly Checkpoint Ana Telo cohesin improper spindle/chromatin attachment lk1 Bub1,3 Aurora ad2 cdc20? separase separase securin Le contrôle de l attachement des chromatides aux microtubules Un système de contrôle («spindle assembly checkpoint» ou «mitotic checkpoint») permet la vérification de l attachement des chromosomes au fuseau et empêche la cellule d entrer en anaphase tant que tous les chromosomes ne sont pas correctement orientés en une plaque métaphasique (Fig. 18) [15]. Le mécanisme fonctionne même lorsqu un seul chromosome n est pas à sa place (lanche 1, E). Ce système de contrôle couple les kinétochores non-attachés à l AC, le complexe separase cdc20 AC roteasome securin cdh1 AC cdc20 AC roteasome Fig. 18 Le contrôle de l attachement des chromatides aux microtubules («spindle assembly checkpoint») responsable de l achèvement de la mitose. En résumé, ad2, un élément sensible à l attachement des microtubules au kinétochore, a pour propriété principale de séquestrer cdc20, la sous-unité adaptatrice de l AC. L interaction ad2/cdc20 semble être régulée par les kinases des familles Bub, lk1 et Aurora, sans que les détails de ces régulations soient bien connus. Dès que tous les kinétochores sont attachés aux microtubules, cdc20 est libéré de ad2, et peut donc activer AC. L entrée en anaphase peut alors avoir lieu. Le contrôle de l orientation du fuseau et la transition anaphase/télophase La poursuite du cycle cellulaire en télophase dépend du «mitotic exit network», un groupe de protéines qui permet le relargage de la phosphatase Cdc14 (une protéine localisée en interphase dans le nucléole) et son activation. Cette phosphatase déphosphoryle et active cdh1, contre-balançant la phosphorylation et l inactivation par / cycline B. Cdh1 interagit alors avec AC. Le complexe AC/cdh1 actif permet la destruction sélective de certains substrats, permettant ainsi le passage en télophase et l achèvement de la mitose (Fig. 19). Un système de contrôle («spindle orientation checkpoint»), principalement connu chez la levure, permet la vérification de l orientation correcte du fuseau [9]. Lorsque le fuseau n est pas correctement orienté, le «mitotic exit network» est inhibé, la phosphatase cdc14 reste inactive, et, en conséquence, cdh1 reste phosphorylée et incapable d activer AC. La cellule reste bloquée en anaphase (Fig. 19). La cytokinèse La cytokinèse est l étape finale de la division qui conduit à l individualisation des deux cellules-filles [8]. Elle est caractérisée par la mise en place d un anneau contractile contenant de l actine, de la myosine et d autres protéines (Fig. 20). L anneau se contracte au niveau équa- 321 ORIGINAL

12 322 ONCOLOGIE torial du fuseau mitotique en une zone dense («mid-body»), où se chevauchent les microtubules émanant des deux pôles du fuseau. Il se referme ensuite entre les deux cellules-filles. L anneau d actomyosine se met en place au niveau du cortex équatorial de la cellule. La myosine constitue le moteur de cet anneau. armi les protéines associées à l anneau contractile on trouve les septines, des protéines à domaine FCH de type cdc15, les protéines de la famille IQGA et des GTases des familles Rho, Rac et cdc42, la kinase citron. Leurs fonctions, leur régulation, l ordre de succession de leur intervention et leur interdépendance restent encore très mal connus. De toute évidence la cytokinèse doit être parfaitement synchronisée avec le cycle nucléaire. Elle n est possible que lorsque les deux lots de chromosomes sont répartis de façon symétrique entre les deux futures cellules-filles. Trois familles de kinases participent à ce contrôle, les CDKs, la kinase lk1 et la kinase citron. L inactivation de est indispensable au déclenchement de la cytokinèse, car inhibe la myosine en phosphorylant la chaîne légère de la myosine («RLC, yosin Regulatory Light Chain»), mais probablement aussi d autres substrats. lk1 pourrait contribuer au déclenchement de la cytokinèse en participant à la destruction de la cycline B et donc à l inactivation de. Le mécanisme d action précis de la kinase citron n est pas encore connu. Certaines protéines migrent des centromères au centre du fuseau («midzone») en début d anaphase. Collectivement appelées «chromosomal passenger proteins», elles comportent la protéine INCEN («inner centromere protein»), les kinases Aurora-B et lk1, la survivine et les kinésines, protéines motrices des microtubules. Ces protéines sont indispensables au déroulement de la cytokinèse. Cependant le couplage entre ces protéines et celles de l anneau contractile reste globalement inconnu. La cytokinèse implique également le trafic intracellulaire, la ro pindle eta Orientation Checkpoint Ana Telo improper spindle orientation sécrétion, et/ou le recyclage membranaire. on achèvement est associé à une fusion de vésicules membranaires. Le cycle des centrosomes mitotic exit network Cdc14 roteasome Fig. 19 Le contrôle de l orientation du fuseau («spindle orientation checkpoint») Cytokinesis Fig. 20 Régulation de la cytokinèse INCEN aurora-b survivin lk1 kinesins contractile ring spindle midzone cdh1 cdh1 cdh1 AC Le centrosome est un organite organisateur des microtubules qui assure la formation du fuseau mitotique mais qui joue également un rôle dans la transition /. Le centrosome est une structure complexe constituée de deux centrioles disposés perpendiculairement l un à l autre et entourés de «matériel péri-centriolaire». arallèlement à la réplication de son génome la cellule doit, avant chaque division, assurer la duplication de son centrosome (Fig. 21). Celle-ci a lieu en phase, au moment de la réplication de l ADN. Comme le génome, les centrosomes sont répartis dans chaque cellule-fille à l issue de la mitose. Ce cycle des centrosomes est bien décrit sur le plan morphologique, mais nous n avons qu une connaissance très parcellaire des mécanismes moléculaires de sa régulation. La réplication du centrosome passe par plusieurs phases (duplication, élongation, maturation, séparation, ségrégation), hautement régulées par des protéines spécifiques. Ce mécanisme est couplé au cycle de réplication des chromosomes. armi les régulateurs essen- myosin / RLC actin septins Cdc15 IQGA GTases Rho, Rac, CDC42 citron kinase cdc20 Aurora-A Tome-1

13 U Cyclin E ps1 centrosome duplication nucleophosmin C110 interconnecting fibers???? nucleophosmin C110 tiels de la duplication on trouve /cycline E - A. Les CDKs phosphorylent la nucléophosmine, ce qui déclenche sa dissociation des centrosomes, et la protéine C110. /cycline E phosphoryle et active, en la stabilisant, une autre kinase essentielle à la duplication du centrosome, la kinase ps1 (TTK chez l homme). Les substrats de ps1 n ont pas été identifiés. La dépendance du cycle de réplication des centrosomes vis-à-vis de l activité des CDKs contribue ainsi à coupler celui-ci au cycle de division nucléaire. La kinase lk1 est localisée au niveau du centrosome en interphase, puis elle s associe aux pôles du fuseau en mitose. on rôle dans le cycle du centrosome reste cependant inconnu, mais elle semble plutôt impliquée dans la maturation. Elle pourrait agir indirectement en participant à l activation de / cycline B, qui phosphoryle et active la kinésine Eg5, impliquée dans la séparation des centrosomes. La séparation des centrosomes dupliqués, en fin de, paraît dépendre de la phosphorylation de la protéine C-Nap1 par la kinase NEK-2 (NimA). La protéine centrine est fortement phosphorylée en fin de. La kinase Aurora-A jouerait Fig. 21 Le cycle de réplication du centrosome centriole elongation centrosome cycle centriole centrosome maturation C-Nap1 centrosome separation centrin Asp kinesin (Eg5) centrosome lk1 Nek-2 Aurora-A mitotic spindle centrosome segregation également un rôle important dans les fonctions des centrosomes en phase, mais ses substrats ne sont pas connus. En plus des diverses kinases mentionnées ci-dessus, la protéolyse ubiquitine-dépendante est indispensable au cycle de duplication des centrosomes. Deux revues bien documentées sur le cycle des centrosomes peuvent être consultées [3, 17]. Le cycle cellulaire, un cycle de destructions protéolytiques? À plusieurs reprises, nous avons vu l importance des destructions spécifiques de certains régulateurs du cycle dans la succession des phases de la division cellulaire. On peut en effet voir le cycle cellulaire comme un cycle coordonné de synthèses, d activations transitoires et de destructions protéolytiques [16]. La dégradation spécifique se fait par le protéasome, un complexe macromoléculaire d au moins 44 sous-unités protéiques [13]. our être pris en charge par les protéases du protéasome, la cible protéique à dégrader doit être ubiquitinée. Cette modification posttraductionnelle consiste en une fixation covalente, sur la chaîne latérale de certaines lysines de la protéine cible, de plusieurs molécules d ubiquitine, un peptide signal de 8 kda. Le processus d ubiquitination fait intervenir une succession d enzymes (E1, «ubiquitin-activating enzyme», E2, «ubiquitin-conjugating enzyme», E3, «ubiquitin ligase») (Fig. 22). Deux types d ubiquitine ligase E3 interviennent dans le cycle cellulaire, le complexe CF («kp1-cullin-f-box»), (activé par la «F-box protein» kp2) [16], et le complexe AC/cyclosome (activé par cdc20 ou par cdh1) [18]. Ces deux complexes sont constitués de multiples sous-unités (Fig. 22). L AC/ cyclosome est actif de la fin de la phase au milieu de la phase. Le complexe CF est actif du milieu de la phase jusqu au début de la phase. Les principaux substrats qu ils ubiquitinent, et donc conduisent à la destruction, sont indiqués dans la figure 22. La destruction de ces substrats est indispensable pour la progression du cycle. Ainsi par exemple la p27 KI1 est détruite en fin de, permettant l activation de (Fig. 10). lus tard dans le cycle, la destruction de la kinase Wee1, par l intermédiaire de Tome-1, contribue à l activation de / cyclin B (Fig. 13). lus tard encore, la destruction de Tome-1, en fin de phase, permet la réapparition de Wee1, et donc l accumulation en de inactive. Nous avons vu l importance, dans la transition métaphase/anaphase, de la destruction de la sécurine, qui permet la libération de la séparase et la destruction du complexe cohésine (Fig. 17). Nous avons vu également l importance de la destruction de la cycline B, qui permet l inactivation de et la poursuite du cycle cellulaire au-delà de la métaphase. La cytokinèse semble également régulée par la destruction protéolytique, AC-dépendante, mais aussi sans doute CF-dépendante, de substrats encore non identifiés. Le contrôle de l état de l ADN Lorsque l ADN est endommagé, des mécanismes complexes sont 323 ORIGINAL

14 324 ONCOLOGIE activés. Ils conduisent à un arrêt du cycle cellulaire et permettent à la cellule soit de réparer cet ADN endommagé, soit, si les dommages sont trop importants, d enclencher un programme de mort cellulaire [7]. lusieurs niveaux d arrêts sont possibles. On parle ainsi des «/ checkpoint» lorsque l entrée en phase est bloquée jusqu à réparation de l ADN endommagé (blocage de ) et de «DNA damage checkpoint», lorsque l arrêt a lieu avant l entrée en phase (blocage de ). Ces mécanismes régulateurs sont schématisés dans les Fig. 23 et 24. Ils impliquent deux kinases appartenant à la famille des «phosphatidylinositol 3-kinase-like kinases» (IKKs) : AT («Ataxia Telangiectasia utated») et ATR («AT- and Rad3-related»). La kinase AT [22] est activée en réponse aux radiations ionisantes et aux coupures double-brin, alors que les UV et les erreurs de réplications activent plutôt la kinase ATR. chématiquement, les kinases AT et ATR ont au moins deux types d effets. Tout d abord (Fig. 23) elles phosphorylent et activent les kinases Chk2 et Chk1 qui, elles, phosphorylent et inactivent les phosphatases CDC25A et CDC25C. En conséquence, et restent inactives, et le cycle cellulaire est arrêté, respectivement, en / et en /. ar ailleurs, AT agit également par la voie p53-dépendante (Fig. 24). Le suppresseur de tumeur p53 est un facteur de transcription activé sous l effet de multiples facteurs (endommagement de l ADN, hypoxie, choc thermique, par exemple). Il est responsable de l induction d un grand nombre de gènes conduisant à des réponses multiples et en particulier à un arrêt du cycle cellulaire ou au déclenchement de l apoptose. Dans les conditions normales, p53 se fixe au facteur D2 («murine double minute 2», Hdm2 chez l homme), ce qui conduit à sa dégradation et explique la faible abondance de p53 dans les cellules en bon état. En revanche, lorsque l ADN est endommagé, trois mécanismes V E2 Rbx1 Cul1 kp1 kp2 (F-box) CF complex Fig. 22 Ub Ubiquitin-dependent proteolysis Target Ub Ub Ub Cyclin E p27 KI1 CF Tome-1 cdc6 Cyclin D Wee1 contribuent à une stabilisation très marquée de p53 et, en conséquence, à une forte augmentation de son activité transcriptionnelle. Tout d abord, la kinase AT est activée et phosphoryle D2, inhibant l interaction D2/p53, ce qui libère et stabilise ainsi p53. ar ailleurs, AT phosphoryle p53 (directement ou indirectement, par Chk2), renforçant sa stabilité. Enfin, p53 induit la transcription du locus roteasome AC Ub Ub Ub cdc20 Aurora-A Ub Target Activités protéolytiques ubiquitine-dépendantes au cours du cycle cellulaire W (UV, HU, replication errors) Cyclin E/A ATR Chk1 CDC25A DNA damage DNA damage checkpoints Fig. 23 Le contrôle de l état de l ADN et blocage en ou en cdc20 or cdh1 AC/cyclosome Wee1 securin Tome-1 (Ionizing radiations, ds DNA breaks) AT Chk2 CDC25C E2 Apc11 Apc2 ARF du locus INK4A. La protéine p14 ARF se fixe sur D2 et induit sa dégradation rapide, renforçant encore davantage la stabilisation et l accumulation de p53. On comprend tout l intérêt de rechercher des inhibiteurs de l interaction D2/p53, qui devraient conduire à une stabilisation de p53, avec pour conséquence l arrêt de la prolifération cellulaire ou l apoptose des cellules soumises à un stress [5].?

15 X Fig. 24 D2 p14 ARF p53 D2 D2 Cyclin E p14 ARF L arrêt de prolifération cellulaire en ou en provient essentiellement d une induction de p21 CI1, et donc de l inhibition de ou de, respectivement. ignalons l existence de deux autres protéines, p63 et p73, qui partagent une grande similarité de structure et de fonction avec p53. p21 CI1 p53 AT Chk2 DNA damage, hypoxia, heat shock, etc. Fonctions de p53 dans la réponse à l endommagement de l ADN Y nitrogen mustards nitrosoureas mitomycin C hydroxyurea cytarabine antifolates 5-fluorouracil 6-mercaptopurine FK317 camptothecin podophyllotoxin,doxorubicin etoposide, mitoxantrone (R)-roscovitine (CYC202) paullones, indirubins ecteinascidin 743 wortmannin caffeine p53/d2 AT/ATR nucleotide excision Chk1 repair Chk2 lk1 DNA synthesis CDC25 HGA topoisomerase I topoisomerase II Cdc7 CDK4 fumagillin,tn-470 RIA-1, pifithrin = ODC/ADC actin flavopiridol GK-3 in1 AhR polyamine analogues EK1/Erk-1/2 G0 paullones, indirubins Raf ROCK DF203 farnesyl transferase tyrosine kinases D98059, U proteasome BAY CT-2584 choline kinase Y rapamycin mtor/fra R gleevec bryostatin, KC412 KC CH66336 iressa geldanamycin, 17-AAG H90 OI774 ATK, AF cytosolic phospholipase A2 trichostatin, FK228 histone deacetylase hexadecylphosphocholine phospholipase D okadaic acid, fostreicin, calyculin A phosphatases Wee1 Aurora in1 tubulin polymerisation/ depolymerisation Les inhibiteurs pharmacologiques du cycle cellulaire apoptosis UCN-01, B debromohymenialdisine isogranulatimide kinesin Eg5 monastrol cytochalasins latrunculin A scytophycins dolastatin 11 jasplakinolide p63 p73 menadione (K3) D (R)-roscovitine (CYC202) paullones, indirubins Vinca alkaloids* taxol/taxotere halichondrin* spongistatin* rhizoxin* cryptophycin sarcodictyin eleutherobin epothilones discodermolide D-24851? dolastatin* combretastatin* Fig. 25 Les régulateurs du cycle cellulaire, cibles de nouvelles molécules thérapeutiques? Les cibles qui interviennent à plusieurs phases du cycle cellulaire ou à des moments encore mal définis sont indiquées en bas à gauche La découverte des mécanismes régulant la division cellulaire a été suivie par la recherche de molécules aux propriétés anti-prolifératives. De nombreux composés anti-mitotiques se sont révélés utiles en chimiothérapie du cancer. Ainsi, on peut classer les produits anti-cancéreux classiques en quatre grandes catégories : les agents alkylants, qui altèrent l ADN et bloquent ainsi la réplication (tels les nitrosourées, les moutardes à l azote) ; les anti-métabolites, qui se substituent aux précurseurs de la synthèse d acides nucléiques et bloquent la réplication de l ADN (hydroxyurée, 5-fluoro-uracile) ; les agents qui bloquent les topoisomérases I (camptothecine) et II (doxorubicine, mitoxanthrone) ; les «poisons» du fuseau mitotique, qui agissent en inhibant la dépolymérisation (ex : taxol, taxotère, et autres molécules soulignées dans la Fig. 25) ou la polymérisation de la tubuline (ex : vinblastine, et autres molécules marquées d un astérisque) [19]. L efficacité thérapeutique des premiers produits anti-mitotiques a fortement suscité la recherche de composés capables d inhiber la prolifération de cellules en culture [13]. La plupart des produits utilisés en chimiothérapie du cancer proviennent de cette approche. lus récemment, la recherche de produits anti-mitotiques à des fins thérapeutiques s est appuyée davantage sur l utilisation directe de régulateurs du cycle comme cibles de criblage moléculaire [13, 21, 23]. Quelques exemples de cibles (dont certaines sont encore potentielles) et d inhibiteurs identifiés sont présentés dans la Fig. 25. Les inhibiteurs sont à des stades très divers de développement, depuis le stade préclinique jusqu à la commercialisation. Certains produits agissent à un stade très spécifique du cycle, d autres à plusieurs étapes. Conclusion Ces dernières décennies ont vu des progrès spectaculaires dans notre compréhension des mécanismes moléculaires qui régulent le cycle de division cellulaire. Ces méca- 325 ORIGINAL

16 326 ONCOLOGIE nismes ont été extrêmement bien conservés au cours de l évolution, signe d une importance primordiale dans la vie cellulaire. Les recherches fondamentales sur la régulation du cycle cellulaire ont certes permis d identifier les grands régulateurs de ce processus vital, mais ont aussi fourni des outils pour aborder de grandes maladies sous un aspect moléculaire. Nous nous rendons compte à l heure actuelle que la plupart des cancers proviennent d anomalies de régulation de la division cellulaire et/ou de l apoptose. Nombreux sont les exemples, dans les tumeurs humaines, de surexpressions de cyclines, de mutations de CDKs, de mutations ou même de délétions des inhibiteurs naturels [13]. Ces observations conduisent maintenant à considérer les régulateurs du cycle cellulaire comme des cibles privilégiées d inhibiteurs sélectifs et puissants. Ces inhibiteurs pourraient compenser pharmacologiquement les anomalies associées aux cancers, et apporter ainsi de nouveaux traitements anti-cancéreux. Remerciements Je remercie tous les membres passés et présents de l équipe «Cycle Cellulaire» de la tation Biologique de Roscoff pour des années de complicité et de recherche passionnée. erci aux relecteurs critiques et vigilants de cette revue (téphane Bach, arc Blondel, Véronique Catros-Quemener, arie Knockaert, arcel Koken, artine Ffrench, Jan ester, ylvie Rumin)! erci aussi à Conly Rieder pour la planche photographique et à ichel Bornens pour la photographie de la Fig. 1. Nos travaux sur la division cellulaire ont été essentiellement soutenus par le CNR, l Association pour la Recherche sur le Cancer et le Conseil Régional de Bretagne. Ce chapitre a été rédigé au cours d un séjour sabbatique à l Université Rockefeller de New York dans le Laboratoire du D r aul Greengard que je remercie vivement pour son accueil. Ce séjour a été financé par le CNR, l Université Rockefeller et l OTAN. Bibliographie 1. Alberts B (2003) DNA replication and recombination. Nature 421: Bell, Dutta A (2002) DNA replication in eukaryotic cells. Ann Rev Biochem 71: Blagden, Glover D (2003) olar expeditions provisioning the centrosome for mitosis. Nature Cell Biol 5: Bloom J, agano (2003) Deregulated degradation of the cdk p27 and malignant transformation. eminars Cancer Biol 13: Chène (2003) Inhibiting the p53-d2 interaction: an important target for cancer therapy. Nature Rev Cancer 3: Coqueret O (2003) New roles for p21 and p27 cell-cycle inhibitors: a function for each cell compartment? Trends Cell Biol 13: Friedberg EC (2003) DNA damage and repair. Nature 421: Guertin DA, Trautmann, ccollum D (2002) Cytokinesis in eukaryotes. icrobiol. ol Biol Rev 66: Irniger (2002) Cyclin destruction in mitosis: a crucial task of cdc20. FEB Lett 532: Jones, Kazlauskas A (2001) Growth factor-dependent signaling and cell cycle progression. Chem Rev 101: alumbres, Barbacid (2001) To cycle or not to cycle: a critical decision in cancer. Nature Rev Cancer 1: asai H, Arai KI (2002) Cdc7 kinase complex: a key regulator in the initiation of DNA replication. J Cellul hysiol 190: eijer L, Jezequel A, Roberge (éditeurs) (2003) Cell Cycle Regulators as Therapeutic Targets. rogress in Cell Cycle Research, vol. 5, Editions Life in rogress, Roscoff, (54 chapitres), 549 pp. 14. eijer L, Jezequel A, Ducommun B (éditeurs) (2000) rogress in Cell Cycle Research, vol. 4, lenum ress, New York, (21 chapitres), p usacchio A, Hardwick KG (2002) The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nature Rev ol Cell Biol 3: Nakayama KI, Hatakeyama, Nakayama K (2001) Regulation of the cell cycle at the - transition by proteolysis of cyclin E and p27kip1. Biochem Biophys Res Commun 282: Nigg EA (2002) Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature Rev Cancer 2: eters J (2002) The anaphase-promoting complex: proteolysis in mitosis and beyond. olecul Cell 9: eterson JR, itchison TJ (2002) mall molecules, big impact: a history of chemical inhibitors and the cytoskeleton. Chem Biol 9: ines J, Rieder CL (2001) Re-staging mitosis: a contemporary view of mitotic progression. Nat Cell Biol 3: E ommier Y, Kohn KW (2003) Cycle cellulaire et points de contrôle en oncologie: nouvelles cibles thérapeutiques. édecine/ciences 19: hiloh Y (2003) AT and related protein kinases: safeguarding genome integrity. Nature Rev Cancer 3: tewart ZA, Westfall D, ietenpol JA (2003) Cell-cycle dysregulation and anticancer therapy. Trends harmacol Biol 24: Wanzel, Herold, Eilers (2003) Transcriptional repression by yc. Trends Cell Biol 13:

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