Le microbiote intestinal humain
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- Charlotte Gaudet
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1 Bifidobacterium Bacteroides Le microbiote intestinal humain Enterococcus faecalis Thomas Hindré Laboratoire Adaptation et Pathogénie des micro organismes
2 Plan du cours I- Le tube digestif humain II- Le microbiote intestinal humain a- Définition b- Méthode de caractérisation : 1- Culture 2- Analyse moléculaire c- Composition et exemples de genre bactérien résidant dans l'intestin d- Dynamique au cours de la vie e- Variabilité f- Fonction III- Microbiote intestinal et dysfonctionnement du système digestif a- Microbiote et obésité b- Microbiote et maladie de Crohn IV- Conclusion
3 Plan du cours I- Le tube digestif humain II- Le microbiote intestinal humain a- Définition b- Méthode de caractérisation : 1- Culture 2- Analyse moléculaire c- Composition et exemples de genre bactérien résidant dans l'intestin d- Dynamique au cours de la vie e- Variabilité f- Fonction III- Microbiote intestinal et dysfonctionnement du système digestif a- Microbiote et obésité b- Microbiote et maladie de Crohn IV- Conclusion
4 L'appareil digestif humain Bouche : - Mastication - Sécrétion amylase = hydrolyse polysacharides Estomac : - Brassage et mélange des aliments avec le suc gastrique - Sécrétion pepsine (protéase) et HCl - Présence d'o 2, ph = 1-2 Petit intestin : - Digestion (pepsine, protéases pancréatiques) - Absorption des nutriments (monoosides, acides aminés,...) - faible O 2, ph = 6-7 Le tube digestif n'est pas un environnement homogène Gros intestin : - absorption de l'eau, ions, ac. gras à courtes chaines - absence d'o 2, ph = 5-7
5 L'appareil digestif humain bouche Le tube digestif est un système ouvert ET DONC colonisé par les bactéries
6 Plan du cours I- Le tube digestif humain II- Le microbiote intestinal humain a- Définition b- Méthode de caractérisation : 1- Culture 2- Analyse moléculaire c- Composition et exemples de genre bactérien résidant dans l'intestin d- Dynamique au cours de la vie e- Variabilité f- Fonction III- Microbiote intestinal et dysfonctionnement du système digestif a- Microbiote et obésité b- Microbiote et maladie de Crohn IV- Conclusion
7 Le microbiote intestinal humain Le microbiote est l'ensemble de la microflore résidant dans l'intestin bactéries : 10 fois le nombre de cellules de l'organisme environ 100 plus de gènes que dans le génome humain >500 espèces : réparties le long du système digestif UFC/g de contenu
8 Plan du cours I- Le tube digestif humain II- Le microbiote intestinal humain a- Définition b- Méthode de caractérisation : 1- Culture 2- Analyse moléculaire c- Composition et exemples de genre bactérien résidant dans l'intestin d- Dynamique au cours de la vie e- Variabilité f- Fonction III- Microbiote intestinal et dysfonctionnement du système digestif a- Microbiote et obésité b- Microbiote et maladie de Crohn IV- Conclusion
9 Caractérisation du microbiote intestinal Par culture sur milieu riche Échantillon à analyser Etalement Milieu riche MAIS La morphologie des colonies ne permet pas nécessairement l'identification de l'espèce bactérienne
10 Caractérisation du microbiote intestinal Par culture sur milieu sélectif Échantillon à analyser Milieu 1 Milieu 3 Milieu 2 MAIS A chaque espèce ne correspond pas nécessairement une condition de culture
11 Caractérisation du microbiote intestinal Par culture sur milieu riche et sélectif Échantillon à analyser 13 bactéries Milieu 1 Milieu 2 Milieu riche? 10 colonies MAIS Seul 60-70% des bactéries du microbiote intestinal sont cultivable
12 Caractérisation moléculaire du microbiote intestinal G C G C A Identification des bactéries à l aide d une séquence d ADN : Carte d identité de la bactérie T A T ADN
13 ARN16s et ribosome procaryote
14 Structure secondaire et variabilité de la molécule d ARNr 16S Codé par ADNr 16s 1500 pb Groupe 1 Variabilité croissante Groupe 2 Groupe 3 Groupe 4 Groupe 5 Groupe 6
15 Electrophorèse à gradient de T G C A température ADNr 16s A C G T Échantillon à analyser PCR Extraction d ADN Dépots Temperature Gradient Gel Electrophoresis
16 Inventaire moléculaire Échantillon à analyser ADNr 16s PCR Extraction d ADN Clonage dans un plasmide Transformation chez E. coli Extraction de plasmide Séquençage Chaque transformant renferme un plasmide portant un seul type d'adnr 16s
17 Principe de construction d un arbre phylogénétique Bactérie 1 A A C T G C G T A Bactérie 2 A A C A G C G T A Bactérie 3 A A C C G C A T A Arbre phylogénétique Alignement de séquences
18 Classification bactérienne basée sur l ARNr 16s Deux souches bactériennes appartiennent à deux espèces différentes si le % d'homologie de leurs séquences d'arn 16s est inférieur à 98%
19 Plan du cours I- Le tube digestif humain II- Le microbiote intestinal humain a- Définition b- Méthode de caractérisation : 1- Culture 2- Analyse moléculaire c- Composition et exemples de genre bactérien résidant dans l'intestin d- Dynamique au cours de la vie e- Variabilité f- Fonction III- Microbiote intestinal et dysfonctionnement du système digestif a- Microbiote et obésité b- Microbiote et maladie de Crohn IV- Conclusion
20 Inventaire moléculaire du microbiote intestinal humain Microbiote intestinal humain analysé par la biologie moléculaire 2 % clone adhufec94 Prevotella oulora Bacteroides vulgatus Bacteroides uniformis Bacteroides ovatus Bacteroides thetaiotaomicron Escherichia coli Klebsiella oxytoca Enterobacter cloacae Veillonella parvula Eubacterium plautii Eubacterium siraeum Clostridium leptum Faecalibacterium prausnitzii Ruminococcus flavefaciens Eubacterium cylindroides Eubacterium biforme Staphylococcus epidermidis Streptococcus salivarius Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Clostridium difficile Clostridium perfringens Clostridium butyricum Clostridium neonatale Clostridium populeti Coprococcus eutactus Butyrivibrio fibrisolvens Ruminococcus obeum Clostridium coccoides Eubacterium rectale Roseburia cecicola Atopobium parvulum Collinsella aerofaciens Eggerthella lenta Genre Enterococcus Bifidobacterium longum Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium pseudocatenulatum Famille Enterobacteriaceae Famille Veillonellaceae Sous-groupe Clostridium leptum Clostridium cluster IV Classe Erysipelotrichi Genre Staphylococcus Genre Streptococcus Genre Clostridium Clostridium clusters I et XI Groupe Bacteroides Groupe Clostridium coccoides Clostridium cluster XIVa Famille Coriobacteriaceae Classe Bacilli Genre Bifidobacterium Phylum Bacteroidetes Phylum Proteobacteria Phylum Firmicutes Phylum Actinobacteria 30-40% <1% 60-75% 1-5% 3 phyla majoritaires
21 Le microbiote intestinal humain Estomac : présence d'o 2, ph = 1-2 Streptococcus Lactobacilus Petit intestin : faible O 2, ph = 6-7 Gros intestin : Absence d'o 2, ph = 5-7 La flore bactérienne varie le long du tube digestif La diversité bactérienne est maximale dans le gros intestin Streptococcus Lactobacillus Bacteroides Enterobacteries Bacteroides Eubacterium Bifidobacterium Peptostreptococcus Fusobacterium Ruminococcus Clostridium Streptococcus Lactobacillus Entérobactéries 21
22 Lactobacillus Glycolyse Phylum Firmicute, 125 espèces Fermentation homolactique Gram-positif Morphologie bâtonnet Anaérobie facultative Fermentation homolactique Utilisé comme probiotique
23 Bacteroides Phylum Bacteroidetes, 20 espèces Gram-négatif, membrane contenant des sphingolipides Morphologie bâtonnet Anaérobie Dégradation des polysaccharides d'origine végétale Fermentation et production d'acide gras à courte chaine utilisable par l'homme (Acétate, succinate)
24 Bifidobacterium Bifidobacterium adolescentis Fructose 6-P phosphocétolase Phylum Actinobacteria, 30 espèces Gram-positif Morphologie ramifiée Anaérobie stricte Premier colonisateur chez le nourrisson allaité Dégradation des oligosaccharides par une voie spécifique = "Bifid shunt" Glucose Erythrose-4-P + Acétyl-P 3 3 acétate x3 x3 2 lactate
25 Plan du cours I- Le tube digestif humain II- Le microbiote intestinal humain a- Définition b- Méthode de caractérisation : 1- Culture 2- Analyse moléculaire c- Composition et exemples de genre bactérien résidant dans l'intestin d- Dynamique au cours de la vie e- Variabilité f- Fonction III- Microbiote intestinal et dysfonctionnement du système digestif a- Microbiote et obésité b- Microbiote et maladie de Crohn IV- Conclusion
26 Dynamique du microbiote intestinal - A la naissance, le tube digestif est stérile - La colonisation commence à l'accouchement et dépend de: Mode d'accouchement L'environnement L'alimentation - Cinétique d'implantation : 1- Bactéries aérobies (Entérobactéries et entérocoques, staphylocoques) 2- Bactéries anaérobies strictes et microaérobies (Bifidobacterium, Clostridium, Bacteroides) - Le microbiote est mature à l'âge de 2-4 ans - Chaque individu possède un microbiote qui lui est propre : Les phyla sont conservés Les espèces sont spécifiques à chaque individu Koenig J E et al. PNAS 2011;108:
27 Dynamique du microbiote intestinal Dominguez-Bello M G et al. PNAS 2010;107: Le mode d'accouchement influence le microbiote du nouveau né
28 Dynamique du microbiote intestinal Koenig J E et al. PNAS 2011;108: Fièvre Lait maternel Céréales Lait de vache Arrêt du lait maternel L'implantation du microbiote est très dépendant de facteurs environnementaux (Alimentation, Antibiotique, )
29 Dynamique du microbiote intestinal Woodmansey et al. Appl. Environ. Microbiol La composition du microbiote est modifiée en fin de vie
30 Plan du cours I- Le tube digestif humain II- Le microbiote intestinal humain a- Définition b- Méthode de caractérisation : 1- Culture 2- Analyse moléculaire c- Composition et exemples de genre bactérien résidant dans l'intestin d- Dynamique au cours de la vie e- Variabilité f- Fonction III- Microbiote intestinal et dysfonctionnement du système digestif a- Microbiote et obésité b- Microbiote et maladie de Crohn IV- Conclusion
31 Variabilité du microbiote intestinal Nam et al, PLoS One, 2011 La proportion des différents phyla est relativement conservée entre les individus
32 Variabilité du microbiote intestinal Nam et al, PLoS One, 2011 Les familles bactériennes varient fortement entre les individus
33 Variabilité du microbiote intestinal De Filippo C et al. PNAS 2010;107: Boulpon, Burkina Faso Florence, Italie La composition du microbiote est très dépendant de facteurs environnementaux (Alimentation, Hygiène, )
34 Plan du cours I- Le tube digestif humain II- Le microbiote intestinal humain a- Définition b- Méthode de caractérisation : 1- Culture 2- Analyse moléculaire c- Composition et exemples de genre bactérien résidant dans l'intestin d- Dynamique au cours de la vie e- Variabilité f- Fonction III- Microbiote intestinal et dysfonctionnement du système digestif a- Microbiote et obésité b- Microbiote et maladie de Crohn IV- Conclusion
35 Fonction du microbiote intestinal Fonction de protection Fonction de structure Fonction métabolique Contre la colonisation par d'autres bactéries - compétition pour les nutriments - production de molécules antibactériennes Aide à la maturation du système immunitaire Induction de la réponse immunitaire Maturation de l'épithélium intestinal Vascularisation des villosités Renforcement des jonctions cellulaires Production de vitamine Synthèse d'acides aminés Absorption des ions Fermentation des substrats non digérés par l'homme Production d'acide gras à courte chaîne (SCFA) Bactéries pathogènes Villosités intestinales Substrats non digérés
36 Fonction métabolique - Le corps humain absorbe les oses simples au niveau du petit intestin proximal. - Les polyosides complexes (ingérés ou relargués par l'hôte) transitent jusqu'au côlon. - Dans le côlon, les bactéries dégradent et fermentent les polyosides complexes. - Les acides gras à courtes chaînes sont ensuite absorbés par l'hôte.
37 Fonction métabolique Bäckhed et al., 2004, PNAS a b Germ Free Normal 12 wks GF CONV-R La présence d'un microbiote intestinal induit : a - augmentation de la masse de graisse corporelle b - diminution de la quantité de nourriture absorbée
38 Fonction métabolique Bäckhed et al, PNAS, 2006 a CONV Western b CONV La présence d'un microbiote intestinal induit : a - Augmentation de la prise de poids suite à un changement de régime alimentaire b - Diminution de l'activité locomotrice quel que soit le régime alimentaire
39 Fonction métabolique Burkina Burkina Italie Italie De Filippo C et al. PNAS 2010;107: La composition du microbiote influe le contenu digestif en acides gras à courtes chaines (SCFA)
40 Fonction de protection Burkina Burkina Italie Italie De Filippo C et al. PNAS 2010;107: La composition du microbiote influe la colonisation par des espèces bactériennes potentiellement pathogènes
41 Aide à la maturation du système immunitaire CD4+ IgA CD4+ = marqueur de lymphocyte T Helper IgA ou Immunoglobuline A = Anticorps Souris axéniques (sans flore intestinale) Souris à flore intestinale normale Macpherson et al, Nat Rev Immunol, 2004 L'absence de flore intestinale diminue fortement le nombre de cellules du système immunitaire au niveau de la muqueuse intestinale.
42 Plan du cours I- Le tube digestif humain II- Le microbiote intestinal humain a- Définition b- Méthode de caractérisation : 1- Culture 2- Analyse moléculaire c- Composition et exemples de genre bactérien résidant dans l'intestin d- Dynamique au cours de la vie e- Variabilité f- Fonction III- Microbiote intestinal et dysfonctionnement du système digestif a- Microbiote et obésité b- Microbiote et maladie inflammatoire IV- Conclusion
43 Microbiote intestinal et obésité Humain Souris transgénique Ley et al, 2006, Nature Ley et al, 2005, PNAS L'obésité est associée à une modification du microbiote Augmentation du % de Firmicutes Baisse du % de Bacteroidetes
44 Microbiote intestinal et obésité Turnbaugh et al., Cell host microbe, 2008 Régime Proteine Glucide Lipide kcal/g CHO 23,2 60,7 16,1 3,74 Western 18,7 40,7 40,7 4,49 L'obésité induite par l'alimentation est associée à la même modification du microbiote
45 Microbiote intestinal et obésité Turnbaugh et al., Nature 2006 Le déséquilibre firmicutes/bacteroidetes modifie la fonction métabolique du microbiote a - Libération d'acides gras à courtes chaines b - Extraction de l'énergie à partir des aliments
46 Microbiote intestinal et obésité Turnbaugh et al., Nature 2006 a b Turnbaugh et al., Cell host microbe, 2008 La transplantation d'un microbiote "obèse" induit une prise de poids supérieure a - Obésité induite génétiquement b - Obésité d'origine alimentaire
47 Plan du cours I- Le tube digestif humain II- Le microbiote intestinal humain a- Définition b- Méthode de caractérisation : 1- Culture 2- Analyse moléculaire c- Composition et exemples de genre bactérien résidant dans l'intestin d- Dynamique au cours de la vie e- Variabilité f- Fonction III- Microbiote intestinal et dysfonctionnement du système digestif a- Microbiote et obésité b- Microbiote et maladies inflammatoires chroniques intestinales IV- Conclusion
48 Les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) Inflammation chronique du système digestif Deux formes majeures : Maladie de Crohn (de la bouche à l'anus) Rectocolite hémorragique (colon et rectum) Symptômes : Douleurs abdominales Diarrhées Vomissement Rectoragie Facteurs déclenchants : Prédisposition génétique de l'hôte Déséquilibre de la flore intestinale
49 Les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) Chassaing, B. and Darfeuille-Michaud, A., Gastroenterology, 2011 L'inflammation résulte d'un déséquilibre de l'interaction flore commensale/hôte
50 Microbiote intestinal et maladie de Crohn Manichanh et al., Gut, 2006 La diversité du microbiote est réduite chez les patients atteints de la maladie de Crohn
51 Microbiote intestinal et maladie de Crohn Baumgart, M et al, ISME, 2007 Boudeau, J et al, infection and immunity, 1999 Augmentation de la quantité de bactérie associée à la muqueuse Présence de souches d'e. coli adhérentes et invasives
52 Plan du cours I- Le tube digestif humain II- Le microbiote intestinal humain a- Définition b- Méthode de caractérisation : 1- Culture 2- Analyse moléculaire c- Composition et exemples de genre bactérien résidant dans l'intestin d- Dynamique au cours de la vie e- Variabilité f- Fonction III- Microbiote intestinal et dysfonctionnement du système digestif a- Microbiote et obésité b- Microbiote et maladies inflammatoires chroniques intestinales IV- Conclusion
53 Conclusion - Résumé - Le système digestif humain est un système ouvert colonisé par les bactéries. - L'organisme humain peut être vu comme un "méta-organisme" résultant de l'association entre l'organisme humain et les bactéries (microbiote intestinal et autres). - Le microbiote intestinal est complexe (>500 espèces) et riche (10 14 bactéries). - La composition du microbiote d'un individu à l'autre est homogène au niveau des phyla mais très diverse au niveau des espèces. - La composition du microbiote est fortement affectée par des facteurs environnementaux (mode d'accouchement, nutrition, antibiothérapie, ) et est dynamique au cours de la vie. - Trois fonctions sont attribuées au microbiote intestinal: protection, structure, métabolisme. - Plusieurs pathologies digestives sont associées à un déséquilibre du microbiote intestinal : obésité, maladies inflammatoires chroniques intestinales.
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