Applications de la Spectrométrie de Masse au Laboratoire de Microbiologie

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1 Applications de la Spectrométrie de Masse au Laboratoire de Microbiologie Pharm Biol Delphine Martiny Departement de Microbiologie CHU Saint-Pierre & Institut Jules Bordet Bruxelles, Belgique

2 Seng CID 2009

3 Performances Bizzini CMI 2010 n BD Phoenix Bruker Genre Espèce Genre Espèce Espèces courantes % 93% 96% 93% Espèces moins fréquentes % 34% 85% 56% Saffert JCM 2011

4 Accuracy of API Campy System, Vitek 2 Neisseria-Haemophilus (NH) Card and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for Identification of Campylobacter and related organisms. Identification correcte à l espèce N=234 API Campy Vitek NH Maldi-TOF MS C. jejuni ssp jejuni 94.4% 89.6% 100% C. coli 73.8% 87.7% 100% Other species 47.7% 0% 90.9% All strains 79.9% 72.2% 98.3% Mauvaise identification API Campy Vitek NH Maldi-TOF MS C. jejuni ssp jejuni 0% 10.4% 0% C. coli 4.6% 7.7% 0% Other species 22.7% 69.5% 0% All strains 5.6% 20.1% 0% Martiny CMI 2010

5 Systèmes disponibles Réflectron? IVD versus RUO? Etude en cours

6 Préparation de l échantillon Matériel biologique Fraction d une colonie isolée Différents milieux Dépôt direct ou extraction Matrice HCCA Réservées à la recherche: DHB Acide sinapinique Point déterminant: quantité de matériel biologique déposé Contrôles

7 Principe a b Acceleration Drift Electrodes Detector Laser Desorption/Ionization Intensity Time-of-Flight m/z

8 Base de données Bruker Nom Comparaison Biotyper Spectres de référence Origine des spectres Souches de référence et clinique Entrées ~ 4000 Base de données complémentaire «bioterrorisme» ~ 100

9 Resultats Cut-off adaptés? Result Overview Analyte Organism Score Organism Score Name (best match) Value (second best match) Value 1 ( +++ ) ( +++ ) ( +++ ) ( +++ ) 1366 ( +++ ) Campylobacter coli 11167_03 NVU Arcobacter butzleri DSM 7301 DSM Arcobacter butzleri 460_98 NVU Arcobacter butzleri 460_98 NVU Campylobacter coli 11167_03 NVU 2,484 2,414 2,341 2,527 2,407 Campylobacter coli CCUG NVU Arcobacter butzleri 347_98 NVU Arcobacter butzleri 347_98 NVU Arcobacter butzleri 347_98 NVU Campylobacter coli CCUG NVU 2,446 2,383 2,337 2,488 2,281 Meaning of Score Values Range Description Symbols Color highly probable species identification ( +++ ) green secure genus identification, probable species identification ( ++ ) green probable genus identification ( + ) yellow no reliable identification ( - ) red

10 Validation RUO versus IVD Reproductibilité Influence de l âge de la culture Comparaison avec les techniques classiques et adaptation des algorithmes

11 Reproductibilité ATCC S. aureus 30 analyses -> ID ok -> Scores entre 2.18 et 2.36 Mellmann JCM 2009

12 Age Culture J3 J4 S. pneumoniae Manuel 2.02 Manuel 2.1 S. agalactiae S. anginosus NPF / E. faecalis K. pneumoniae P. aeruginosa E. coli S. sonnei E. coli 2.04 E. coli C. jejuni NPF /

13 Comparaison avec les techniques classiques: origine des isolats (n=992) Double dépôt

14 300 Bacilles Gram négatif Nombre d isolats Rouge = erreur au genre Jaune = erreur à l espèce Bleu = ID correcte au genre et à l espèce CIT ENT ESC MOR PRO PSE SAL SHI SER ACH ACI EIK HAE STE KLE Coques Gram positif Genre Nombre d isolats Seulement Biotyper = 4% ENC STA AUR SCN STR HEM STR Genre

15 1er algorithme: Décembre 2010 Colonie isolée Score <2 -> contamination? Score >2 E. coli, K. pneumoniae and K. oxytoca, E. cloacae et E. aerogenes, P. aeruginosa, C. freundii et C. koseri, S. aureus, SCN -> ok Autres: identification classique

16 Pratiquement 65% identifiées par MT 32% non validées 3% NRI / NPF / <2 Algorithme évolutif

17 Dernier algorithme: Mai espèces de 16 genres bactériens Acinetobacter Enterobacter Streptococcus baumanii genomospecies cloacae asburiae kobei ludwigii hormaechei cloacae complexe anginosus constellatus répondre A. baumanii complexe répondre E. cloacae complexe répondre S. anginosus groupe Validation au genre: Acinetobacter, Enterococcus, Staphylococcus, Salmonella, Corynebacterium, Micrococcus

18 Follow-up: 16 au 29 mai 2011 URI: 144 / 145 ID 99.3% par MT 1 Achromobacter xylosoxydans VRS: 86 / 97 ID 88.6% par MT 9 Haemophilus / Pneumo 1 Hafnia alvei, 1 Klebsiella ozaenae PUS: 216 / 228 ID 94,7% par MT 7 Haemophilus / Pneumo 4 Streptos hémolytiques 1 Providencia rettgeri et 1 Enterococcus casseiflavus HC et dépistages: 76 / 82 ID 92,7% par MT 5 Pneumo / Strepto 1 Salmonella

19 Follow-up: approximation Biais: flores salivaires, Anaérobies et levures 3% NPF / NRI Total: (552-29)/552= 94.6% Toujours en évolution

20 Avantages

21 Rapidité du diagnostic Préparation de la matrice ~ 5 min Extraction, si nécessaire ~ 30 min Préparation de la cible ~ 15 min Liste de travail ~ 5 min Acquisition des spectres ~ 1 min Comparaison à la base de données ~ 1 min Résultats (1 cible complète) ~ 2h

22 Coût Seng CID 2009

23 Pratiquement Facile à utiliser Peu de matériel biologique nécessaire Large panel d espèces incluses dans la BD Coprocultures Outil diagnostique

24 Désavantages

25 Identification Shigella versus E. coli C. africana versus C. albicans S. pneumoniae versus S. mitis/oralis B. pertussis versus bronchiseptica K. oxytoca versus R. ornitholytica S. maltophilia versus Pseudomonas species Achromobacter species Pseudomonas fluorescens group Burkholderia cepacia complex Bacteroides species Listeria species Enterobacter cloacae complex Aeromonas species Pseudomonas putida group Acinetobacter species

26 Pratiquement Pas d information sur la résistance aux AB Contaminations (Connexion au LIS) (Nettoyage des plaques) (Préparation de la matrice)

27 Conclusions Rapide, économique, peu de matériel (bio ou tech) > 90% des souches identifiées sans test compl. Pas de temps épargné au début Workflow à revoir Plus d ID réalisées Découverte de pathogènes potentiels

28 Perspectives dans notre laboratoire Identification directe sur échantillons (HC) Centrifugations Tampon de lyse Sepsityper kit Yan, JCM 2011 Prod hom JCM 2010 Stevenson, JCM 2010 Ferroni, JCM 2010 Ferreira, CMI 2010 Moussaoui, CMI 2010

29 Travail de David Fage

30 Levures Travail de Ann Packeu (ISSP) Extraction courte + cut-offs adaptés Milieux chromogènes Aspergillus, dermatophytes Erhard, Exp Derm 2007 Alliano, CMI 2010 Santos, J Appl Microbiol 2010 Putignani, Mol Biosyst 2011

31 Bader CMI 2010 Dhiman, JCM 2011

32 Anaerobies Aurélien Simon validation en cours Expansion de la base de données nécessaire Bacteroides fragilis group CGP anas Total n Sans pré-traitement Avec pré-traitement Après upgrade espèce genre espèce genre espèce genre Bruker 87 [100] NA NA 15 Shimadzu NA NA NA NA Bruker NA NA 24 Shimadzu NA NA NA NA Bruker Shimadzu NA NA NA NA Veloo CMI 2011 Veloo Syst Appl Microbiol 2011

33 Mycobacteries Procédure d inactivation Consortium NTBC Expansion de la base de données nécessaire

34 Milieu solide Inactivation à la chaleur Upgrade db Procédure d extraction Saleeb, JCM 2011

35 Demain? Typage? Resistance? Toxicité? Virologie? Génomique?

36 MERCI DE VOTRE ATTENTION Contact : Pharm Biol Delphine Martiny, Dpt of Microbiology Saint-Pierre Univ Hospital & Jules Bordet Institute Brussels, Belgium E. mail: delphine_martiny@stpierre-bru.be