Rapport de synthèse (études préliminaire, d extension et interlaboratoire conduites selon la norme EN ISO 16140)

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1 Laboratoire de Touraine biomérieux Rapport de synthèse (études préliminaire, d extension et interlaboratoire conduites selon la norme EN ISO 16140) Validation de la méthode «ONE DAY» pour la recherche de Listeria monocytogenes et de Listeria spp dans les produits d alimentation humaine et les échantillons d environnement Réalisation de l étude par : Pour : Laboratoire de Touraine Unité vétérinaire et Agroalimentaire BP Tours cedex 2 biomérieux SA Chemin de l Orme MARCY L ETOILE N attestation AFNOR : AES 10/3 09/00 RSynthese_AES 10/3 09/00_v6_15/05/2015

2 Tables des matières 1. Introduction Référentiels de validation Protocole et principe de la méthode alternative Domaine d application Méthode de référence Historique de la validation Étude préliminaire Exactitude relative, spécificité relative et sensibilité relative Protocole pour la recherche de Listeria monocytogenes Protocole pour la recherche de Listeria spp Conservation au froid et tests de confirmation Niveau de détection relatif Inclusivité / Exclusivité Étude (2000) menée lors de la validation initiale de la méthode «/ L. Monodisk» pour la recherche de Listeria monocytogenes Étude (2006) menée lors de l extension de la méthode «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes, en intégrant le protocole de confirmation «Confirmation» (ISHA) Étude (2010) menée lors de l extension du protocole «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes et de Listeria spp Étude d extension concernant le test «Fast Rhamnose» (confirmation) Principe et mode opératoire Protocole de l étude Résultats des essais «Fast Rhamnose» Conclusion de l étude d extension Etude interlaboratoire Praticabilité Conclusion générale ANNEXES Liste des Annexes - Annexe 1 : Protocole analytique de la méthode «One Day» - Annexe 2 : Mode opératoire de la méthode EN ISO /A1 - Annexe 3 : Inclusivité/ Exclusivité : Tableaux de résultats (étude 2000) - Annexe 4 : Inclusivité/ Exclusivité : Tableaux de résultats (étude d extension : 2005) - Annexe 5 : Inclusivité/ Exclusivité : Tableaux de résultats (ISHA : 2006) - Annexe 6 : Inclusivité/ Exclusivité : Tableaux de résultats (étude d extension : 2010) - Annexe 7 : Résultats des essais Fast Rhamnose : Souches cibles (étude d extension : 2013) - Annexe 8 : Résultats des essais Fast Rhamnose : Souches non cibles (étude d extension : 2013) 2

3 1. Introduction 1.1 Référentiels de validation Norme EN ISO (2003) «Microbiologie des aliments - Protocole pour la validation des méthodes alternatives» Document AFNOR Certification : «Exigences relatives aux études (préliminaire et interlaboratoire) menées par un laboratoire expert». 1.2 Protocole et principe de la méthode alternative Principe de la méthode : Le milieu gélosé est un milieu chromogène qui permet de détecter l ensemble des Listeria par la mise en évidence de l activité béta-glucosidase (colonies rondes, à bord régulier, de couleur bleu-turquoise) et de distinguer Listeria monocytogenes ou Listeria ivanovii par la formation d un halo franc de précipitation des phospholipides clivés par sa phospholipase spécifique. Protocole de la méthode alternative : La gélose est utilisée pour la recherche de Listeria monocytogenes (protocole «One Day») et de Listeria spp dans les échantillons d alimentation humaine et les prélèvements d environnement. Le principe de la méthode repose sur une phase préliminaire d enrichissement de la prise d essai diluée au 1/10 ème en bouillon Fraser demi (incubation 24h +-2h, 30 C +/- 1 C) suivie d un étalement ou d un isolement sur gélose. Il est laissé la possibilité à l utilisateur de conserver le bouillon Fraser ½ jusqu à 72 heures à 5 C +/- 3 C avant de réaliser les ensemencements. Après une incubation des géloses de 24h à 48h, à 37 C +/- 1 C, les Listeria monocytogenes forment des colonies bleues à bleu-vert entourées d un halo opaque (24h). Les Listeria autres que monocytogenes ou ivanovii forment, quant à elles, des colonies bleues à bleu vert, rondes, régulières, sans halo opaque. Conformément aux prescriptions d AFNOR Certification et du fabricant, les colonies typiques doivent faire l objet de tests de confirmation : Pour le cas des colonies typiques de Listeria monocytogenes (colonies bleues à bleues vertes, entourées d un halo opaque) : 1- confirmation d une colonie positive selon les tests classiques des méthodes normalisées, en incluant l étape de purification, 2- confirmation selon le protocole «Confirmation», 3- confirmation selon le protocole VIDAS LMO2, 4- confirmation avec le réactif Accuprobe L. monocytogenes, 5- confirmation en réalisant une galerie API Listeria, 6- confirmation en réalisant une galerie RAPIDEC L. mono, 7- test «FAST Rhamnose», 3

4 8- confirmation par toute autre méthode certifiée AFNOR Validation dont le principe est différent de la méthode «One Day» (les deux méthodes validées devant avoir un tronc commun). Pour le cas des colonies typiques de Listeria spp (colonies bleues à bleues vertes, entourées ou non d un halo opaque) : 1- confirmation d une colonie positive selon les tests classiques des méthodes normalisées, en incluant l étape de purification, 2- confirmation par piqûre sur gélose Palcam à partir d une colonie isolée, 3- confirmation rapide par test immunochromatographique «Listeria species Confirmation Strip», 4- confirmation par toute autre méthode certifiée AFNOR Validation dont le principe est différent de la méthode «One Day» (les deux méthodes validées devant avoir un tronc commun). Protocole d utilisation de la méthode alternative sous forme de schéma : Le synoptique du protocole d utilisation de la méthode alternative est présenté en annexe Domaine d application Tous produits d alimentation humaine et échantillons de l environnement 1.4 Méthode de référence EN ISO / A1 (2004) : «Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes, partie 1 : méthode de recherche Amendement 1» La méthode de référence à laquelle sera comparée la méthode alternative est la norme EN ISO / A1 (2004). Le mode opératoire de la méthode ISO est présenté en annexe Historique de la validation La technique /L MONODISK a été validée par le bureau technique "Microbiologie" de la marque AFNOR Validation en septembre 2000 et a été enregistrée sous le numéro 10/3-09/00. Une demande d extension de certification AFNOR Validation a été instruite en mai 2002 par le bureau technique au terme de laquelle, la méthode «One Day» a été validée (révision 7 des règles de validation AFNOR), en remplacement de la méthode /L MONODISK. Le projet de reconduction de la validation sous la marque AFNOR Validation de la méthode de recherche de Listeria monocytogenes par la technique «One Day» a été proposé à la commission le 24 septembre La reconduction et l extension (intégration d une cinquième matrice : prélèvements d environnement) de la méthode «One Day» datent du 07 avril 2005 et ont été réalisées selon les modalités de la norme EN ISO (2003), hormis l étude collaborative. L amendement A1 de la norme de référence EN ISO a alors été pris en compte. 4

5 En 2006, extension de la méthode «One Day» pour prendre en compte la nouvelle étude interlaboratoire réalisée selon les modalités de la norme EN ISO (2003) et intégrer la possibilité de confirmation par la technique «Confirmation». En 2008, demande de reconduction sans modification de la méthode «One Day» : le bureau technique émet l avis favorable lors de la réunion du 30 juin Le 1 er avril 2010, extension de la méthode «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes et de Listeria spp dans les produits d alimentation humaine et les échantillons d environnement. Cette extension intègre également la possibilité d effectuer un isolement de 0,1 ml ou un étalement de 0,1 ml, au choix de l opérateur, ainsi que deux nouveaux modes de confirmation (par piqûre sur gélose Palcam et par utilisation du test immunochromatographique «Listeria species Conf irmation Strip»). Le 06 octobre 2011 : extensions de la méthode «One Day» concernant : - la possibilité de conserver le bouillon Fraser ½ après incubation pendant 72 heures maximum à 5 C +/- 3 C, avant de réaliser les ensemencements sur gélose - l intégration au protocole des principes de confirmation des Listeria monocytogenes : «RAPIDEC Lmono» (réalisation d essais) galerie API Listeria (données antérieures de validation dans le cadre de la marque NF VALIDATION) AccuProbe Listeria monocytogenes (données antérieures de validation dans le cadre de la marque NF VALIDATION) VIDAS LMO2 (données antérieures de validation dans le cadre de la marque NF VALIDATION) Le 06 juillet 2012, la validation de la méthode «One Day» a été reconduite par le bureau technique AFNOR (reconduction sans modification). Bureau Technique du 28 mars 2013 : extension à un nouveau mode de confirmation «FAST Rhamnose», concernant les deux méthodes «One Day» et «COUNT». En synthèse : Date de validation initiale : 27/09/ ère extension le : 17/05/2002 Date de reconduction : 07/04/ ème extension le : 15/09/2006 Date de reconduction : 30/06/ ème extension le : 01/04/ ème extension le : 06/10/2011 Date de reconduction : 06/07/ ème extension le : 28/03/2013 Fin de validité : 27/09/2016 5

6 2. Étude préliminaire 2.1 Exactitude relative, spécificité relative et sensibilité relative Protocole pour la recherche de Listeria monocytogenes Nombre et nature des échantillons Des essais ont été effectués en 2000 sur 164 échantillons de produits dont 53 naturellement contaminés et 111 non contaminés, appartenant aux grandes catégories d aliments suivantes : produits carnés, produits de la mer, produits végétaux, produits laitiers. Des essais complémentaires ont été effectués en 2004 et 2005 sur : 92 échantillons appartenant aux catégories produits carnés, produits de la mer, produits végétaux, produits laitiers, dont 23 échantillons naturellement contaminés, 52 artificiellement contaminés et 17 non contaminés, 61 échantillons d environnement dont 4 naturellement contaminés, 26 artificiellement contaminés et 31 non contaminés. Au total, les essais ont porté sur 317 échantillons de produits dont 80 naturellement contaminés, 78 artificiellement contaminés et 159 non contaminés, appartenant aux catégories suivantes : - produits carnés, - produits de la mer, - produits végétaux, - produits laitiers, - échantillons d environnement. Lecture à 24h / 48h : Catégories Types Positif* Négatif Total Brut 13 / / / 25 Viandes et Congelé 11 / 12 9 / 8 20 / 20 charcuteries Traité à chaud 12 / / / 23 Total 36 / / / 68 Fruits et légumes Brut 30 / / / 65 Total 30 / / / 65 Brut 15 / 15 8 / 8 23 / 23 Poissons et crustacés Fumé 15 / / / 38 Total 30 / / / 61 Brut 13 / 13 7 / 7 20 / 20 Produits laitiers Congelé 15 / 15 7 / 7 22 / 22 Fermenté 4 / 4 16 / / 20 Total 32 / / / 62 Chiffonnettes 11 / / / 21 Environnement Ecouvillons 8 / 8 12 / /20 Eau 11 / 11 9 / 9 20 /20 Total 30 / / / 61 Total 158 / / / 317 * il s agit des résultats s par l une ou l autre des méthodes 6

7 Pour chaque catégorie, les échantillons ont été analysés en simple par la méthode alternative et par la méthode de référence. Contamination artificielle des échantillons Le protocole de contamination artificielle utilisé correspond à l option 3 décrite dans l annexe C du référentiel EN ISO Le pourcentage d échantillons naturellement contaminés est de 50,6%. Résultats des essais Les couples de résultats des méthodes de référence et alternative pour l ensemble des produits sont présentés dans les tableaux suivants : Réponses Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative Tableau de résultats "lecture à 24 heures" Méthode de référence positive (R+) Méthode de référence négative (R-) Accord A+ / R+ Déviation positive A+ / R- PA = 156 (1) PD = 1 (1) Déviation négative A- / R+ Accord négatif A- / R- ND = 1 (2) NA = 159 (3) (A-) (1) il s agit de s confirmés (2), (3) dont aucun échantillon présumé par la méthode alternative, négatif après confirmation Légende : A+ = s confirmés A- = négatifs immédiats et négatifs après confirmation quand présomptifs s Lecture à 24h : Calcul de l exactitude relative (AC), de la sensibilité relative (SE) et de la spécificité relative (SP) L ensemble des résultats permet de calculer l exactitude relative (AC), la sensibilité relative (SE) et la spécificité relative (SP) pour chacune des catégories, selon les formules de la norme EN ISO Lecture des géloses : Catégorie PA NA ND PD Somme N Exactitude relative AC (%) [100x(PA+NA])/N N+ PA + ND Sensibilité relative SE (%) [100xPA]/N+ Spécificité relative N- SP (%) NA + PD [100xNA]/N- Carnée ,52% % 33 96,96% Mer ,36% 30 96,66% % Végétaux % % % Laitiers % % % Environne ment % % % TOTAL ,36% ,36% ,37% 7

8 Pour la méthode alternative, les valeurs en pourcentage calculées pour les trois critères suivants, selon la norme EN ISO sont : 24h d incubation exactitude relative : AC 99,36% spécificité relative : SP 99,37% sensibilité relative : SE 99,36% Le pourcentage de sensibilité (à 24 heures) a également été calculé en tenant compte de l ensemble des s confirmés (ceci inclut le supplémentaire de la méthode alternative), comme suit : 24h d incubation Méthode alternative : Méthode de référence : (PA + PD) / (PA + PD + ND) (PA + ND) / (PA + PD + ND) = 99,4 % = 99,4 % Le nombre d essais discordants étant égal à 2, l annexe F du référentiel EN ISO ne peut s appliquer. L analyse des résultats montre que les deux méthodes sont très proches l une de l autre puisqu elles ne se prennent respectivement à défaut qu une seule fois chacune. Réponses Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative Tableau de résultats "lecture à 48 heures" Méthode de référence positive (R+) Méthode de référence négative (R-) Accord A+ / R+ Déviation positive A+ / R- PA = 157 (1) PD = 2 (1) Déviation négative A- / R+ Accord négatif A- / R- ND = 0 (2) NA = 158 (3) (A-) (1) il s agit de s confirmés (2), (3) dont aucun échantillon présumé par la méthode alternative, négatif après confirmation Légende : A+ = s confirmés A- = négatifs immédiats et négatifs après confirmation quand présomptifs s Lecture à 48h : Calcul de l exactitude relative (AC), de la sensibilité relative (SE) et de la spécificité relative (SP) L ensemble des résultats permet de calculer l exactitude relative (AC), la sensibilité relative (SE) et la spécificité relative (SP) pour chacune des catégories, selon les formules de la norme EN ISO

9 Lecture des géloses : Catégorie PA NA ND PD Somme N Exactitude relative AC (%) [100x(PA+NA])/N N+ PA + ND Sensibilité relative SE (%) [100xPA]/N+ Spécificité relative N- SP (%) NA + PD [100xNA]/N- Carnée ,06% % 33 93,94% Mer % % % Végétaux % % % Laitiers % % % Environne ment % % % TOTAL ,36% % ,75% Pour la méthode alternative, les valeurs en pourcentage calculées pour les trois critères suivants, selon la norme EN ISO sont : 48h d incubation exactitude relative : AC 99,36% spécificité relative : SP 98,75% sensibilité relative : SE 100% Le pourcentage de sensibilité (à 48 heures) a également été calculé en tenant compte de l ensemble des s confirmés (ceci inclut les s supplémentaires de la méthode alternative), comme suit : 48h d incubation Méthode alternative : Méthode de référence : (PA + PD) / (PA + PD + ND) (PA + ND) / (PA + PD + ND) = 100 % = 98,74 % Les performances de la méthode «One Day» apparaissent équivalentes à celles de la méthode de référence. Les résultats obtenus par la méthode «One Day» avec lecture à 24 heures et lecture à 48 heures sont équivalents Protocole pour la recherche de Listeria spp Nombre et nature des échantillons Quatre catégories d aliments ont été testées ainsi que la catégorie des prélèvements d'environnement agro-alimentaires, avec pour chacune d entre elles, 3 types d'échantillons différents répartis de la façon suivante. 9

10 Catégories Types Positif* Négatif Total Viandes et charcuteries Fruits et légumes Poissons et crustacés Produits laitiers Environnement Brut Congelé Traité à chaud Total Brut Congelé Produits transformés Total Brut Congelé Fumé Total Brut Congelé Fermenté Total Chiffonnettes Ecouvillons Eau Total Total * il s agit des résultats s par l une ou l autre des méthodes Pour chaque catégorie, les échantillons ont été analysés en simple par la méthode alternative et par la méthode de référence. Contamination artificielle des échantillons La recherche de la contamination naturelle des échantillons testés a été privilégiée. Toutefois, il a été nécessaire de recourir à la contamination artificielle, qui s est opérée par utilisation de souches isolées et stressées. Le mode opératoire utilisé est conforme à celui demandé dans le document «Exigences relatives aux études (préliminaire et interlaboratoire) menées par un laboratoire expert». 74 résultats s ont été obtenus suite à une contamination artificielle sur un total de 197 résultats s (123 échantillons naturellement contaminés). Le pourcentage de contamination artificielle est de 37,6%. Il est également à noter que le pourcentage d échantillons s par Listeria monocytogenes seule est de 30% (seuil fixé entre 17% et 33% par le bureau technique). 10

11 Résultats des essais Les lectures ont été effectuées à 24h. Tableau de résultats des méthodes de référence et alternative Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative (A-) Méthode de référence positive (R+) Accord (A+/R+) PA = 191 Déviation négative (A- /R+) ND = 5* Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R- /A+) PD = 1 Accord négatif (A-/R-) NA = 182** Total Total Légende : A+ = s confirmés A- = négatifs immédiats et négatifs après confirmation quand présomptifs s * dont 0 échantillon présumé par la méthode alternative, négatif après confirmation ** dont 3 échantillons douteux non confirmés, mais en concordance avec la méthode de référence (également présumé et confirmé négatif). Calcul de l exactitude relative (AC), de la sensibilité relative (SE) et de la spécificité relative (SP) L ensemble des résultats permet de calculer l exactitude relative (AC), la sensibilité relative (SE) et la spécificité relative (SP) pour chacune des catégories, selon les formules de la norme EN ISO Lecture des géloses : Catégorie PA NA ND PD Somme N Exactitude relative AC (%) [100x(PA+NA)]/N Sensibilité relative N+ SE (%) PA + ND [100xPA]/N+ Spécificité relative N- SP (%) NA + PD [100xNA]/N- Viandes/ charcuteries , , ,00 Fruits/ Légumes , , ,00 Poissons/ Crustacés , , ,44 Produits laitiers , , ,00 Environneme nt , , ,00 TOTAL , , ,45 Pour la méthode alternative, les valeurs en pourcentage calculées pour les trois critères suivants, selon la norme EN ISO sont : 11

12 24h d incubation exactitude relative : AC 98,42 % spécificité relative : SP 99,45 % sensibilité relative : SE 97,45 % Le bureau technique dans le cadre la marque AFNOR Validation demande que la sensibilité des deux méthodes soit recalculée en tenant compte de l ensemble des s confirmés (ceci inclut les s supplémentaires de la méthode alternative) : 24h d incubation Méthode alternative : Méthode de référence : (PA + PD) / (PA + PD + ND) (PA + ND) / (PA + PD + ND) = 97,46 % = 99,49 % Analyse des discordants Selon l annexe F de la norme EN ISO 16140, le nombre de discordants pour lequel un test statistique doit être réalisé afin de comparer les deux méthodes est de 6. Or, après 24h d incubation, le nombre de discordants Y = ND + PD, soit 6. Il s agit de déterminer M en fonction du nombre total de discordants et en fonction de l annexe F de la norme EN ISO Cette valeur M sera comparée à la valeur m, plus petite valeur de PD et de ND. Si 6 Y 22 : m = PD = 1 (parce que PD < ND) La valeur de M est, quant à elle, de 0 (tableau F.1 de la norme). Les deux valeurs sont considérées comme équivalentes si m > M. Nombre de résultats discordants M m Conclusion EQUIVALENCE Les échantillons pour lesquels les résultats sont discordants sont les suivants : pour la déviation négative : 71 (steak haché cru), 100 (tartare de saumon), 367 (saucisse crue), 419 (camembert), 473 (terrine de campagne) pour la déviation positive : 409 (filets de saumon surgelés) Cinq échantillons sont négatifs après 24h d incubation, mais tous s après 48h d incubation. Pour la méthode de référence, la positivité s est manifestée soit sur géloses incubées 48h après Fraser ½, soit sur géloses ensemencées après Fraser. Les souches de Listeria concernées sont Listeria welshimeri et Listeria grayi. Les contaminations sont naturelles et doivent certainement être de très faible niveau. Un échantillon est un supplémentaire. Le résultat a été obtenu dès 24h d incubation par la méthode alternative, alors que la méthode de référence rend un résultat négatif. La souche concernée est Listeria monocytogenes. La contamination est naturelle. 12

13 Confirmation des échantillons s ou douteux Résultats chiffrés des confirmations par «Listeria species Confirmation Strip» et par spots Palcam : Méthode alternative Géloses incubées 24h Total s confirmés 192 Bandelettes positives 191* Spots Palcam s 191* Méthode alternative Géloses incubées 24h Total négatifs 187 Ech. présentant des résultats suspects non confirmés : présence de colonies typiques douteuses, non confirmées Bandelettes positives (à partir des échantillons présentant des résultats suspects non confirmés) Spots Palcam s (à partir des échantillons présentant des résultats suspects non confirmés) * Cas particulier : il s agit de l échantillon n 399 (Ecouvillon/ Listeria monocytogenes) pour lequel la colonie à 24h est trop petite pour effectuer à la fois les tests de confirmation Palcam et immunochromatographique. Ces tests ont été réalisés à 48h et sont ressortis s. Seule la galerie biochimique a pu être faite à 24h. Tous les résultats obtenus sont conformes à ceux attendus. Ensemencement par isolement Cette analyse de l étude comparative démontre que le mode d ensemencement par isolement donne des résultats équivalents à ceux obtenus par la méthode de référence. Le mode d ensemencement par étalement, quant à lui, a déjà été validé lors des études précédentes (notamment en 2005) Conservation au froid et tests de confirmation Conservation des géloses 48h à 2-8 C et test de confirmation «Listeria species Confirmation Strip» La norme EN ISO 7218 précise la possibilité de conserver les géloses au réfrigérateur pendant 48 heures. 13

14 La gélose est formulée selon les indications de la norme EN ISO , et est même explicitement citée. La durée de conservation 48h au froid doit donc s appliquer et aucun essai complémentaire n aurait dû être nécessaire. Malgré tout, ce critère a été vérifié lors de l étude d exactitude menée pour l extension accordée en avril L ensemble des résultats obtenus est conforme aux attentes, également en termes de confirmation par «Listeria species Confirmation Strip». Conservation des bouillons Fraser ½ à 5 C ± 3 C pendant 72 heures Dans le cadre de l étude d extension de 2011, des essais ont été réalisés par la méthode alternative afin de comparer les résultats des ensemencements réalisés dès la fin de l incubation du Fraser ½ à ceux obtenus après passage du Fraser ½ au froid 5 C ± 3 C pendant 72h. Les géloses ont été lues après 24 heures d incubation et après 48 heures d incubation. Sur 117 échantillons s (dont 38 contaminés avec Listeria monocytogenes et 79 contaminés avec Listeria spp), incluant 57 contaminés artificiellement et 60 naturellement contaminés, et répartis sur 5 catégories de produits alimentaires (produits carnés, produits de la mer, produits végétaux, produits laitiers et échantillons d environnement), les résultats étaient les suivants : Pour 115 échantillons, les ensemencements réalisés à partir du Fraser ½ incubé 72 heures au froid ont donné des résultats concordants, après lecture à 24 heures et à 48 heures, à ceux obtenus à partir des ensemencements réalisés directement après incubation. Pour 2 échantillons, les ensemencements réalisés à partir du bouillon Fraser ½ conservé au froid pendant 72 heures se sont révélés s à 24 heures, alors que ceux réalisés directement après incubation étaient s après lecture à 48 heures. Cela s explique par une multiplication bactérienne durant les 72 heures de stockage du bouillon. En conclusion, la conservation du bouillon Fraser ½ pendant 72h à 5 ± 3 C ne modifie pas le rendu des résultats. Tests de confirmation Dans le cadre de l étude d extension de 2011, toutes les confirmations des Listeria monocytogenes (n=38) ont été réalisées avec Confirmation et avec RAPIDEC Lmono. 14

15 Géloses incubées / Géloses incubées / ensemencement à T0 ensemencement à T72H Total L. spp s Bandelettes positives Total L. mono s Aloa Conf. Positifs Rapidec L. mono s Toutes les confirmations effectuées à partir de RAPIDEC Lmono sont concordantes à celles effectuées à partir d Confirmation. Suite à l acquisition de la société «AES Chemunex» par la société «biomérieux» et compte tenu du fait que les formulations des géloses et OAA sont conformes à la définition de la norme EN ISO , le Bureau technique, lors de la séance du 6 octobre 2011, a accepté que les 3 tests de confirmation de la méthode OAA suivants soient appliqués à la méthode sans essais complémentaires : - galerie API Listeria, - par le test AccuProbe Listeria monocytogenes à partir de colonies isolées ou non sur gélose - par le test VIDAS LMO2 à partir de colonies isolées ou non sur gélose Ces modes de confirmation ont été validés dans le cadre de l «étude de reconduction de validation de la méthode OAA protocole court pour la recherche de L. monocytogenes & Résultats d extension à un nouveau protocole de confirmation» (Référence : OAA recherche reconduction ext v01, présenté au bureau technique de Mars 2009). Le protocole court (OAA) est validé sous le numéro d attestation BIO 12/14 04/ Niveau de détection relatif Des essais ont été effectués en 2004 et 2005, sur des combinaisons produits alimentaires/ souches de Listeria monocytogenes, pour les matrices suivantes : Rillettes, Saumon, Salade, Lait cru, Chiffonnette. Quatre niveaux cibles de contamination ont été testés pour chaque couple matrice/ souche (0,25 0,5 0,75 et 1 UFC/25 g). Six réplications ont été réalisées pour chaque niveau, par les deux méthodes. Le laboratoire expert a complété ces données avec des souches de Listeria autres que monocytogenes, pour deux couples «matrice-souche» : Rillettes / Listeria welshimeri (origine : viande de bœuf) Eau de process / Listeria innocua (origine : chiffonnette siphon sol) Quatre niveaux de contamination croissants ont été testés pour chaque couple «matrice souche» (les niveaux cibles sont : 0,25 0,50 0,75 et 1 UFC/ 25 g). Six réplications ont été réalisées pour chaque niveau. 15

16 Les niveaux de détection obtenus pour chaque combinaison "Matrice-Souche" sont les suivants, selon le test Spearman-Karber : Couples (souche, matrice) Flore totale (UFC/g ou UFC/ml) Niveau de détection relatif LOD 50 avec intervalle de confiance (UFC / 25 g ou 25 ml) Méthode de référence Méthode alternative L. monocytogenes (1/2a)- Rillettes <100 0,5 [0,4-0,7] 0,5[0,4-0,7] L. welshimeri - Rillettes < 200 0,5 [0,3-0,7] 0,5 [0,3-0,7] L. monocytogenes (4b) - Saumon ,5 [0,4-0,7] 0,5 [0,4-0,7] L. monocytogenes (1/2b) - Salade ,4 [0,3-0,5] 0,4 [0,3-0,5] L. monocytogenes (1/2a) Lait cru ,5 [0,4-0,8] 0,5 [0,4-0,8] L. monocytogenes (1/2a) ,5 [0,4-0,7] 0,5 [0,4-0,7] Chiffonnettes L. innocua - Eau de process < 20 0,4 [0,3-0,6] 0,4 [0,3-0,6] LOD 50 : estimation du niveau de contamination qui permet d obtenir une détection positive par la méthode alternative dans 50% des cas Remarque : toutes les souches utilisées pour les contaminations ont été préalablement isolées d échantillons des mêmes catégories que les échantillons artificiellement contaminés. Le niveau de détection relatif de la méthode alternative pour la recherche de Listeria monocytogenes est compris entre 0,3 et 0,8 UFC/ 25 g ou ml. Il est identique à celui de la méthode de référence. Le niveau de détection relatif de la méthode alternative pour la recherche de Listeria spp est compris entre 0,3 et 0,7 UFC/ 25 g ou ml. Il est identique à celui de la méthode de référence. 2.3 Inclusivité / Exclusivité Plusieurs études d inclusivité / exclusivité ont été menées depuis la validation initiale de la méthode en 2000, lors des différentes phases de reconduction et/ ou d extension Étude (2000) menée lors de la validation initiale de la méthode «/ L. Monodisk» pour la recherche de Listeria monocytogenes 50 souches de Listeria monocytogenes ont été testées et donné une réponse positive. 51 souches non Listeria monocytogenes ont été testées. Toutes ont répondu négativement sauf quelques souches de Listeria ivanovii qui ont présenté un fin halo à 24 H. La mise en œuvre des tests de confirmation a permis de différencier les deux espèces. Les résultats figurent en annexe 3. 16

17 Étude (2005) menée lors de la validation de reconduction et d extension du protocole «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes Protocole «inclusivité» : 50 souches de Listeria monocytogenes de collection ou issues de produits alimentaires ont été testées. Chaque souche est d abord repiquée en bouillon nutritif (incubation 24 heures, 37 C). Les cultures obtenues sont diluées pour obtenir environ des suspensions de 10 à 100 UFC / ml. Un millilitre de chaque suspension diluée est ensuite ensemencé dans 225 ml de bouillon FRASER demi. Le bouillon est ensuite incubé à 30 C pendant 24 heures +/- 2 heures. Après enrichissement, un étalement de 0,1 ml est effectué sur gélose. Les boîtes sont incubées à 37 C, puis lues après 24 heures. Protocole «exclusivité» : 30 souches non cibles, autres que Listeria monocytogenes, ont été testées en double sur gélose. Ces souches sont connues soit pour interférer avec Listeria monocytogenes, soit pour être naturellement présentes dans les produits alimentaires d essai. Chaque souche est d abord repiquée en bouillon nutritif (incubation 24 heures, 37 C). Les cultures obtenues sont diluées pour obtenir des suspensions d environ 10 6 UFC / ml. Un étalement de 0,1 ml est alors effectué sur gélose. Les boîtes sont incubées à 37 C, puis lues après 24 heures. Résultats : Les 50 souches de Listeria monocytogenes ont répondu positivement. Les 30 souches non-cibles ont donné des résultats négatifs. Il convient de signaler le fait que certaines colonies de Listeria ivanovii présentent un aspect typique avec un fin halo au terme des 24 premières heures d incubation. Après 48 heures d incubation, Listeria ivanovii peut présenter le même aspect que Listeria monocytogenes. Les résultats figurent en annexe Étude (2006) menée lors de l extension de la méthode «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes, en intégrant le protocole de confirmation «Confirmation» (ISHA) Souches cibles : 152 souches cibles ont été testées. Les résultats obtenus sont parfaitement conformes à ceux attendus. Toutes les souches de Listeria monocytogenes ont formé des colonies caractéristiques sur après 24 heures d incubation (y compris la souche non hémolytique testée). Aucun résultat discordant entre / Confirmation n a été observé. Souches non cibles : 100 souches non cibles ont été testées, dont 27 Listeria ivanovii. Les résultats obtenus sont parfaitement conformes à ceux attendus. Toutes les souches de Listeria ivanovii testées ont présenté des colonies caractéristiques sur après 48 heures d incubation. Cependant, les profils obtenus sur Confirmation ont montré qu il ne s agit pas de L. monocytogenes. Les résultats des tests d identification de ces souches par la méthode de référence confirment qu il s agit de Listeria ivanovii. Les résultats figurent en annexe 5. 17

18 Étude (2010) menée lors de l extension du protocole «One Day» pour la recherche de Listeria monocytogenes et de Listeria spp Protocole «inclusivité» : 63 souches pures de Listeria spp (20 Listeria monocytogenes et 43 Listeria autres que monocytogenes) de collection ou issues de produits alimentaires ont été testées. Chaque souche est d abord repiquée en bouillon nutritif (incubation 24 heures à 37 C). Le bouillon est ensuite calibré à 1 Mac Farland et les dilutions sont effectuées pour obtenir des suspensions de 10 à 100 cellules / ml. Un millilitre de chaque suspension est ensuite ensemencé dans 225 ml de bouillon FRASER ½. Le bouillon est ensuite incubé à 30 C pendant 24 heures. Après enrichissement, un ensemencement de 0,1 ml est effectué sur gélose. Les boîtes sont incubées à 37 C puis lues à 24 heures. Protocole «exclusivité» : 32 souches non cibles, autres que Listeria spp, ont été testées. Ces souches sont connues soit pour interférer avec Listeria spp, soit pour être naturellement présentes dans les produits alimentaires d essai. Chaque souche est d abord repiquée en bouillon nutritif (incubation 24 heures à 37 C). Les cultures obtenues sont diluées pour obtenir des suspensions supérieures à 10 5 cellules / ml. Un millilitre de chaque suspension est ensuite ensemencé dans 225 ml de bouillon nutritif non sélectif. Après incubation, un ensemencement de 0,1 ml est alors effectué sur gélose. Les boîtes sont incubées à 37 C puis lues à 24 heures. Résultats : Les 63 souches de Listeria spp ont répondu positivement. Toutes les souches ont été confirmées par test immunochromatographique («Listeria species Confirmation Strip») et par spot Palcam. Les 32 souches non-cibles ont toutes donné des résultats négatifs (soit une absence de colonie, soit des colonies non typiques). Aucune de ces souches n a été confirmée par test immunochromatographique («Listeria species Confirmation Strip»). Il est à noter que certaines souches, principalement de Bacillus, ont pu se développer sur gélose Palcam, mais aucun spot n avait un aspect caractéristique de Listeria. Les résultats de confirmation obtenus par «Listeria species Confirmation Strip» et spot Palcam sont conformes à ceux attendus. Les résultats figurent en annexe 6. 18

19 3. Étude d extension concernant le test «Fast Rhamnose» (confirmation) 3.1 Principe et mode opératoire Cette méthode de confirmation rapide, repose sur la mise en évidence de la fermentation du Rhamnose. L acidification est révélée par la présence d un indicateur coloré, avec un virage du bouillon du violet au jaune. Ce test permet de discriminer les Listeria monocytogenes des autres souches telles que Listeria ivanovii ou certains Bacillus cereus, qui peuvent présenter un profil caractéristique sur après 24h à 48h d incubation. Mode opératoire : Le test est réalisé à partir d une colonie caractéristique et isolée sur ou à partir d un repiquage de cette même colonie ré-isolée sur TSYE. Un tube de bouillon «Fast Rhamnose» est ensemencé, puis incubé à 37 C +/- 1 C pendant 6 à 24 heures. La formation d une coloration jaune indique un résultat. Dès l observation d un virage au jaune, le résultat est considéré comme, même avant 6 heures d incubation. Un résultat est rendu négatif, après une incubation de 24h à 37 C, si aucun virage n a été observé. Après inoculation, la couleur du milieu pour un résultat négatif, peut évoluer vers le violet pâle ou grisé. Le test non inoculé a une couleur violette. Profil Aspect de la colonie sur FAST Couleur de la colonie Halo d opacification Rhamnose Conclusion 1 bleu + + L. monocytogenes 2 bleu + - L. ivanovii Les tests peuvent également être conservés après une incubation à température ambiante ou à 37 C, pendant 72 heures au total après inoculation des tubes. 3.2 Protocole de l étude Dans le cadre de l étude d extension, le laboratoire expert a réalisé : * la confirmation de 203 souches cibles de Listeria monocytogenes, d origine variée et préalablement sérogroupées, * la confirmation de 103 souches non cibles : 53 de ces souches sont des Listeria autre que monocytogenes (dont 20 Listeria ivanovii) et 50 sont des souches d autres genres, tels que Bacillus, Staphylococcus, Lactobacillus, enterococcus, Les souches ont toutes été isolées sur géloses et TSYE. L ensemble des souches isolées sur et TSYE a fait l objet d une confirmation par la mise en œuvre du test «FAST Rhamnose». 19

20 Chaque souche donnant un résultat discordant entre l aspect sur gélose et le test de confirmation réalisé a été identifiée selon les tests normalisés. Plusieurs lectures ont systématiquement été réalisées. Les tests sont donc interprétés : - après 4h, 6h, 24h, 72h d incubation à 37 C +/-1 C, - après 24h d incubation à 37 C +/-1 C suivies de 48h de conservation à température ambiante. 3.3 Résultats des essais «Fast Rhamnose» Souches cibles Les tableaux de résultats obtenus figurent en annexe souches de Listeria monocytogenes sérogroupées et d origine variée ont été testées avec la répartition suivante : Catégories Nb souches Viandes et charcuteries 82 Fruits et légumes 26 Poissons et crustacés 18 Produits laitiers 18 Environnement 21 Plats cuisinés / mélanges divers 24 Pâtisseries 14 Total 203 Sérotype ou groupe PCR Nb Souches 1/2a, IIa 128 1/2b, IIb 15 1/2c, IIc 8 4b, IVb 46 4a, L 6 Total 203 À partir des colonies issues des géloses incubées, les résultats obtenus sont conformes à ceux attendus après 24 heures d incubation pour les 203 souches de Listeria monocytogenes testées, soit dans 100% des cas. Ces résultats sont identiques dès 6 heures d incubation à 37 C pour 199 souches, soit dans 98% des cas. Ces résultats sont identiques dès 4 heures d incubation à 37 C pour 198 souches, soit dans 97,5% des cas. Toutes les souches de Listeria monocytogenes ensemencées ont présentées des colonies caractéristiques sur gélose après incubation. 20

21 À partir des colonies issues des géloses TSYE incubées, les résultats obtenus sont conformes à ceux attendus après 24 heures d incubation pour les 203 souches de Listeria monocytogenes testées, soit dans 100% des cas. Ces résultats sont identiques dès 6 heures d incubation à 37 C pour 200 souches, soit dans 98,5% des cas. Ces résultats sont identiques dès 4 heures d incubation à 37 C pour 198 souches, soit dans 97,5% des cas. Après conservation des tests pendant 72 heures à 37 C +/1 C, l ensemble des résultats est pour les 203 souches de Listeria monocytogenes, aussi bien à partir des géloses que des géloses TSYE : 100% de résultats conformes. Après conservation des tests à température ambiante, pour une durée allant jusqu à 72 heures après ensemencement, l ensemble des résultats est pour les 203 souches de Listeria monocytogenes, aussi bien à partir des géloses que des géloses TSYE : 100% de résultats conformes. Souches non cibles Les tableaux de résultats obtenus figurent en annexe 8. Les 103 souches non cibles ont été testées à partir de colonies obtenues sur gélose TSYE et sur gélose lorsque des colonies étaient présentes, même si elles étaient non caractéristiques. Elles sont représentées par 53 souches de Listeria autres que monocytogenes, dont 20 souches de Listeria ivanovii et par 50 souches d autres genres, dont 18 souches de Bacillus. Seules les souches de Listeria ivanovii étaient bleues-vertes avec halo après 48 heures d incubation. Toutes les souches des autres genres testés n étaient pas caractéristiques. Parmi les souches testées, toutes les Listeria ivanovii présentent des tests «Fast Rhamnose» négatifs. Certaines souches de Listeria innocua et de Listeria welshimeri présentent des résultats s aux tests «Fast Rhamnose», mais aucune n ont un aspect caractéristique sur gélose. Aucune des 7 souches de Bacillus cereus testées n a présenté de test «Fast Rhamnose» à partir des géloses. Certaines souches sont rhamnose positive (Enterococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Brochotrix, Bacillus), mais soit ne présentent aucune croissance sur gélose, soit ne présentent aucune colonie caractéristique. Pour les souches Listeria testées, les résultats après conservation des tests à température ambiante, pour une durée allant jusqu à 72 heures après ensemencement, et les résultats des tests incubés jusqu à 72 heures à 37 C +/- 1 C, restent identiques à ceux obtenus après 24 heures d incubation. 21

22 Dans le cadre des souches d autres genres que Listeria, le laboratoire a constaté quelques cas de tests ayant initialement virés à une couleur jaune qui ont ensuite changé de nouveau de couleur (couleur «gris»). Ces cas s expliquent par une ré-alcalinisation du milieu. 3.4 Conclusion de l étude d extension L ensemble des résultats obtenus est conforme à ceux attendus : Les essais réalisés à partir de souches pures n ont pas mis en évidence de discordance. La réalisation d un test à partir d une colonie caractéristique isolée obtenue sur gélose permet de conclure à Listeria monocytogenes après 24h d incubation (100% de concordance) ou après 6h d incubation (98% des cas), ou encore dès 4h d incubation si le test «Fast Rhamnose» présente un virage au jaune. Les tests peuvent être conservés pour lecture après une incubation à température ambiante ou à 37 C, pendant 72 heures au total après inoculation des tubes. 4. Etude interlaboratoire L étude interlaboratoire selon la norme EN ISO a été réalisée en 2006 avec 14 laboratoires collaborateurs. Les analyses ont été effectuées sur des échantillons de lait de chèvre pasteurisé, contaminés artificiellement avec une souche de Listeria monocytogenes 4b (isolée d un fromage de chèvre au lait cru) aux 3 niveaux suivants : - niveau 0 (niveau cible : 0 UFC/25 ml), - niveau légèrement supérieur au niveau de détection relatif (niveau cible : 3 UFC/25 ml), - niveau 10 fois supérieur au niveau précédent (niveau cible : 30 UFC/25 ml). Les laboratoires ont testé, par les deux méthodes, 8 réplicats pour chaque niveau de contamination. Chaque laboratoire a reçu un total de 26 échantillons : - 24 échantillons répartis en 3 niveaux de contamination (L0, L1 et L2), - 1 échantillon pour le dénombrement de la flore endogène de la matrice, - 1 échantillon pour la prise de température à réception (cet échantillon contenait également un thermobouton TOMPROBE TM destiné au suivi de la température pendant le transport). Les résultats obtenus sont les suivants : Niveaux de contamination Nombre total d'échantillons Nombre d'échantillons analysés Nombre de résultats exploités* Nombre de résultats négatifs Nombre de résultats s REF ALT REF ALT

23 * Un laboratoire a déclaré avoir mal manipulé. Ses résultats n ont pas été pris en compte (contamination de deux échantillons entre eux au moment de la mise en enrichissement. Après vérification des numéros des échantillons concernés par cette erreur de manipulation, il s est avéré qu un échantillon négatif a été mélangé avec un échantillon artificiellement contaminé). a- Pourcentage de spécificité, Pourcentage de sensibilité, Exactitude relative Pourcentage de spécificité : Il est calculé pour les deux méthodes pour le niveau L0. Avec : SP = [ 1 (FP/N-)] X 100 et FP : nombre de faux s - N- = nombre total de tous les essais L0 Pourcentages de sensibilité : Ils sont calculés pour les deux méthodes pour chaque niveau de contamination (L1 et L2) et pour les deux méthodes. Avec : SE = (TP/N+)] X 100 et TP = nombre vrais s N+ = nombre total des essais L1 ou L2 respectivement. Exactitude relative : Elle est calculée pour tous les niveaux. Avec : AC = [(PA+NA) / N] X 100 et PA = nombre d accords s NA = nombre d accords négatifs N = nombre d échantillons soumis à essai. Tableau récapitulatif : Exactitude relative Sensibilité relative Spécificité relative Niveaux N AC(%) LCL(%) N+ SE(%) LCL(%) N- SP(%) LCL(%) L L L TOTAL LCL : low critical value L exactitude relative est de 100 %. La spécificité est de 100 %. La sensibilité est de 100 %. Calcul de la sensibilité des deux méthodes en tenant compte de l ensemble des s confirmés (incluant les éventuels s supplémentaires obtenus par la méthode alternative, dans cette étude : aucun) : METHODE ALTERNATIVE METHODE DE REFERENCE SENSIBILITE (PA+PD) / (PA+PD+ND) = 100 % (PA+PD) / (PA+PD+ND) = 100 % 23

24 Les résultats obtenus dans cette étude interlaboratoire ont corroboré ceux obtenus antérieurement dans la précédente étude collaborative menée selon le référentiel en application en Aucun faux n avait été obtenu avec la méthode de référence et la méthode «One Day». Les résultats de l étude collaborative sont comparables à ceux obtenus lors de l étude préliminaire pour la reconduction de la certification AFNOR Validation de la méthode «One day» et de son extension aux prélèvements d environnement menée en b- Degré d accord, concordance et odds ratio : Degré d accord : % de chance de trouver le même résultat pour deux échantillons identiques analysés par le même laboratoire dans des conditions de répétabilité. C est la moyenne des probabilités que deux réplicats donnent le même résultat pour chaque laboratoire. Concordance : % de chance de trouver le résultat pour deux échantillons identiques analysés dans deux laboratoires différents (conditions de reproductibilité). C est le % de toutes les paires de réplicats donnant le même résultat. Odds ratio (COR) : il est défini par la formule suivante : COR= degré d accord x (100 concordance) / concordance x (100 degré d accord). Le tableau suivant indique les valeurs pour la méthode alternative et pour la méthode de référence : Niveau de contamination Degré d accord Concordance COR L L L La variabilité de la méthode alternative (degré d accord, concordance, odds ratio) est identique à celle de la méthode de référence 5. Praticabilité La praticabilité est étudiée en fonction des 13 critères définis par le bureau technique : 1 - Mode de conditionnement des éléments de la méthode : Les boîtes de gélose sont conditionnées par paquet de 10 en sachet plastique et expédiées par carton de 10 unités (boîtes 140 mm), 20 unités (boîtes 90 mm) ou de 120 unités (boîtes 90 mm). Le kit pour 1 litre «base + suppléments» est constitué de 5 flacons de 200 ml + suppléments (expédié par carton). 2 - Volume des réactifs : Chaque boîte de gélose précoulée contient 16 ml de milieu sélectif (diamètre 90 mm) ou 60 ml de milieu sélectif (diamètre 140 mm). Chaque flacon de gélose a un volume de 200 ml. 24

25 3 - Conditions de stockage et péremption des produits non ouverts : La température de stockage des géloses est celle mentionnée sur la notice technique du fabricant : 2 à 8 C. La date limite d utilisation est indiquée sur le fond des boîtes de gélose (impression jet d encre). Elle correspond à un délai de 10 semaines après fabrication. Pour les flacons, la date limite d utilisation est également mentionnée sur chaque flacon. Elle correspond à un délai de 1 an après fabrication. Les boîtes coulées par le laboratoire utilisateur à partir de flacons prêts à l emploi peuvent être conservées pendant une semaine entre 2 et 8 C. 4 - Modalités d utilisation après première utilisation : Sans objet pour la gélose en boîte précoulée. Les modalités d utilisation après première utilisation sont spécifiées dans la fiche technique du fabricant. En l occurrence : Les boîtes coulées par le laboratoire utilisateur à partir de flacons prêt à l emploi peuvent être conservées pendant une semaine entre 2 et 8 C. Par ailleurs, les flacons d Base non complémentés peuvent subir deux cycles de régénération et de maintien en surfusion sans que la qualité analytique des résultats obtenus par la méthode alternative ne soit réduite. 5 - Équipements ou locaux spécifiques nécessaires : La nature des équipements et les locaux nécessaires à la réalisation des analyses selon le mode d emploi du fabricant de la méthode alternative sont du même niveau que ceux prescrits dans la méthode de référence. 6 - Réactifs prêts à l emploi ou à reconstituer : Les boîtes de gélose sont disponibles en prêt à l emploi. Les kits sont prévus pour la fabrication de 5 fois 200 ml, soit 1 litre de milieu prêt à l emploi. Le milieu est également disponible sous forme déshydratée plus suppléments. 7 - Durée de formation de l opérateur non initié à la méthode : ½ journée 8 - Temps réel de manipulations et flexibilité de la technique par rapport au nombre d échantillons à analyser : La méthode alternative présente l avantage de ne nécessiter que l ensemencement par étalement ou isolement d une seule boîte par rapport aux 4 boîtes (2 et 2 d un autre milieu) prévues dans la méthode de référence. Par ailleurs, cette méthode s affranchit du repiquage sur bouillon FRASER (absence d enrichissement secondaire). Synthétiquement, pour le cas d échantillons négatifs, pour lesquels aucune confirmation n est nécessaire, les temps estimés sont les suivants : 25

26 Étapes Temps moyen pour 1 échantillon (min) EN ISO One Day Préparation, pesée, dilution, broyage 5 5 Transfert du Fraser ½ en Fraser 1 - Isolement sur géloses sélectives du Fraser ½ et du Fraser 2 - Isolement de 100 µl sur gélose - 1 Lecture des géloses 2 1 Temps total moyen 10 7 Dans le cadre des confirmations des colonies caractéristiques de Listeria monocytogenes, la méthode alternative permet de ne repiquer qu une seule colonie au lieu des cinq mentionnées dans la méthode de référence. Différents modes de confirmation peuvent être utilisés à la place des tests normatifs, permettant de gagner plusieurs jours par rapport à la méthode de référence. Dans le cadre des confirmations des colonies caractéristiques de Listeria spp, l opérateur peut effectuer le test «Listeria species Confirmation Strip» par bandelette permettant un gain de temps très important puisque la lecture s effectue en 10 minutes, après 5h à 24h d incubation préalable du bouillon cœur-cerveau. Il convient également de noter que la souplesse d utilisation autorise l induction de l analyse le vendredi, avec étalement / isolement le samedi, pour une lecture finale le lundi, sans obligation pour le manipulateur, d intervenir le dimanche. En effet, la notice prévoit un temps d incubation de 24h à 48h. Cet avantage majeur peut, bien entendu, se transposer sur la gestion des calendriers composés de jours fériés. 26

27 9 - Délai d obtention des résultats : Étapes Délai obtenu Méthode de référence EN ISO Délai obtenu Méthode alternative «One Day»* Réalisation du bouillon Fraser ½ J0 J0 Ensemencement du bouillon Fraser J1 - Isolement sur géloses sélectives Étalement / Isolement sur J1 et J3 - - J1 Obtention des résultats négatifs (absence J5 J2 de colonies caractéristiques) Obtention des résultats s (colonies caractéristiques) ou négatifs après confirmation Confirmation du genre : - Tests normatifs - Listeria species Confirmation Strip Spot Palcam Confirmation de l espèce Listeria monocytogenes : - Tests normatifs - Confirmation - protocole «RAPIDEC Lmono», - protocole VIDAS LMO2, - protocole Accuprobe L. monocytogenes, - galerie API Listeria, - test FAST Rhamnose * Lecture après 24h d incubation J6 à J7 - - J8 à J J4 - J3 à J4 J2 J3 J4 à J9 J3 J2 à J3 J2 J2 J3 à J4 J2 à J Type de qualification de l opérateur Il est identique au niveau requis pour la méthode de référence Étape commune avec la méthode de référence : Indépendamment des étapes éventuelles de confirmation, la méthode alternative partage une seule étape en commun avec la méthode de référence. Il s agit de l étape d enrichissement primaire. Il existe, par ailleurs, une similitude dans l étalement / isolement de 0,1 ml de cet enrichissement primaire sur la gélose et le transfert de 0,1 ml de cet enrichissement primaire dans 10 ml de FRASER d enrichissement secondaire Traçabilité éventuelle des résultats d analyses : La traçabilité des résultats d analyses repose sur le relevé des numéros de lots de gélose ainsi que sur le suivi des fiches de contrôle qualité fournies par la société AES Chemunex et les épreuves de stérilité et de fertilité que le laboratoire peut gérer en interne dans le cadre de ses exigences qualité Maintenance par le laboratoire : Aucune. 27

28 6. Conclusion générale L étude de validation a été menée selon le référentiel EN ISO * Les résultats de l étude comparative permettent de conclure que la méthode «One Day» : - est exacte, sensible et spécifique, Recherche de Listeria monocytogenes : Exactitude relative (à 24 heures) : AC =99,36% Spécificité relative (à 24 heures) : SP =99,37% Sensibilité relative (à 24 heures) : SE =99,36% Les échantillons s par la méthode alternative étant des échantillons s confirmés, les sensibilités et spécificités ont été recalculées par rapport à l ensemble des résultats s et sont de : 99,4% de sensibilité pour la méthode alternative, 99,4% de sensibilité pour la méthode de référence. Exactitude relative (à 48 heures) : AC = 99,36% Spécificité relative (à 48 heures) : SP = 98,75% (une spécificité relative inférieure à 100% résulte d un nombre de s supplémentaires confirmés et non pas de faux s). Sensibilité relative (à 48 heures) : SE = 100% Les échantillons s par la méthode alternative étant des échantillons s confirmés, les sensibilités et spécificités ont été recalculées par rapport à l ensemble des résultats s et sont de : 100% de sensibilité pour la méthode alternative, 98,7% de sensibilité pour la méthode de référence. Recherche de Listeria monocytogenes et autre Listeria spp : Exactitude relative (à 24 heures) : AC =98,42% Spécificité relative (à 24 heures) : SP =99,45% Sensibilité relative (à 24 heures) : SE =97,45% Les échantillons s par la méthode alternative étant des échantillons s confirmés, les sensibilités et spécificités ont été recalculées par rapport à l ensemble des résultats s et sont de : 97,46% de sensibilité pour la méthode alternative, 99,49% de sensibilité pour la méthode de référence. - présente un niveau de détection identique à celui de la méthode de référence, Le niveau de détection relatif de la méthode alternative pour la recherche de Listeria monocytogenes est compris entre 0,3 et 0,8 UFC/ 25 g ou ml. Le niveau de détection relatif de la méthode alternative pour la recherche de Listeria spp est compris entre 0,3 et 0,7 UFC/ 25 g ou ml. 28

29 - est inclusive et exclusive, - est aisée à mettre en œuvre dans les laboratoires. Enfin : tous les tests effectués avec «Listeria species Confirmation Strip» (étude d exactitude, études d inclusivité et d exclusivité) se sont avérés conformes aux attentes, au même titre que les confirmations sur Palcam. toutes les confirmations effectuées à partir de RAPIDEC Lmono sont concordantes à celles effectuées à partir d Confirmation. Suite à l acquisition de la société «AES Chemunex» par la société «biomérieux» et compte tenu du fait que les formulations des géloses et OAA sont conformes à la définition de la norme EN ISO , les tests suivants pour la confirmation des Listeria monocytogenes ont également été validé : - galerie API Listeria, - par le test AccuProbe Listeria monocytogenes à partir de colonies isolées ou non sur gélose - par le test VIDAS LMO2 à partir de colonies isolées ou non sur gélose le fait de conserver les boîtes 48h à 2/8 C n a pas influé sur les résultats obtenus après 24h d incubation. la conservation du bouillon Fraser ½ pendant 72h à 5 ± 3 C ne modifie pas le rendu des résultats. * Les résultats de l étude interlaboratoire permettent de conclure que la méthode «One Day» : - est exacte, sensible et spécifique, L exactitude relative, la spécificité et la sensibilité sont de 100%. Les résultats de l étude interlaboratoire sont comparables à ceux obtenus lors de l étude préliminaire. - a une variabilité (degré d accord, concordance et odds ratio) identique à celle de la méthode de référence, aux trois niveaux de contamination testés : Degré d accord : 100% Concordance : 100% COR : 1 Fait à TOURS, le 15/05/2015 Nicolas GAILLARD Directeur adjoint hygiène 29

30 ANNEXES 30

31 ANNEXE 1 Protocole analytique Méthode «One Day»

32 RECHERCHE DE LISTERIA MONOCYTOGENES ET LISTERIA SPP DANS LES ALIMENTS METHODE «One Day» PROTOCOLE ANALYTIQUE (Attestation AFNOR N 10/3-09/00) Annexe 1 Page 1/1 X g ou X ml de prise d'essai + 9 X ml Fraser-demi 24 heures +/- 2 heures, à 30 C +/- 1 C Possibilité de conserver le bouillon 72 heures à 5 C +/-3 C, après incubation 0,1 ml étalement ou isolement sur Dans le cadre de l ensemencement par étalement, maintenir une zone non ensemencée en périphérie de la boîte. Cette zone facilite l observation des halos pour les boîtes chargées (contraste centre/périphérie de la boîte). 24 heures à 48 heures, à 37 C +/- 1 C Présomption L. spp OUI avec / sans halo colonies typiques? OUI avec halo Présomption L. monocytogenes NON Confirmation Listeria spp (au choix) : - tests classiques des méthodes normalisées, - piqûre sur gélose Palcam, - protocole «Listeria species Confirmation Strip», - autre méthode validée Afnor, dont le principe est différent. Absence Listeria spp. Confirmation (au choix) : - tests classiques des méthodes normalisées, - protocole «Confirmation», - protocole «RAPIDEC Lmono», - protocole VIDAS LMO2 - protocole Accuprobe L. monocytogenes, - galerie API Listeria - test «FAST Rhamnose», - autre méthode validée Afnor, dont le principe est différent.

33 ANNEXE 2 Mode opératoire de la méthode EN ISO /A1

34 Annexe 2 Page 1/1 MODE OPERATOIRE DE LA METHODE EN ISO /A1 X g ou X ml de prise d'essai + 9 X ml Fraser-demi 24 heures +/- 3 heures, à 30 C +/- 1 C 0,1 ml de culture dans 10 ml Fraser 48 heures +/- 3 heures, à 37 C +/- 1 C Isolement de 10 µl sur gélose et isolement sur 2 ème milieu sélectif (gélose Palcam) Isolement de 10 µl sur gélose et isolement sur 2 ème milieu sélectif (gélose Palcam) 24 heures +/- 3 heures, à 37 C +/- 1 C, si nécessaire : 24 heures +/- 3 heures supplémentaires, à 37 C +/- 1 C 24 heures +/- 3 heures, à 37 C +/- 1 C, si nécessaire : 24 heures +/- 3 heures supplémentaires, à 37 C +/- 1 C Confirmation (tests normatifs) Confirmation (tests normatifs)

35 ANNEXE 3 Inclusivité / Exclusivité : Tableaux de résultats (Étude : 2000)

36 ÉTUDE D INCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 1/ = boîtes envahies de colonies isolées

37 ÉTUDE D INCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 2/ = boîtes envahies de colonies isolées 37

38 ÉTUDE D INCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 3/ = boîtes envahies de colonies isolées 38

39 ÉTUDE D INCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 4/ = boîtes envahies de colonies isolées 39

40 ÉTUDE D INCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 5/ = boîtes envahies de colonies isolées 40

41 ÉTUDE D EXCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 6/ = boîtes envahies de colonies isolées 41

42 ÉTUDE D EXCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 7/ = boîtes envahies de colonies isolées 42

43 ÉTUDE D EXCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 8/ = boîtes envahies de colonies isolées 43

44 ÉTUDE D EXCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 9/ = boîtes envahies de colonies isolées 44

45 ÉTUDE D EXCLUSIVITE DE LA GELOSE Annexe 3 Page 10/ = boîtes envahies de colonies isolées 45