STÉRILISATION. Réduction des populations. nonus 1

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1 Réduction des populations nonus 1

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3 Taux de survie N/No Taux de mortalité No-N /No No : nombre initial de cellules vivantes N : nombre de cellules vivantes après le cycle de stérilisation nonus 3

4 Chaleur Sèche, incinération Humide : autoclavage, tyndallisation Chimiques Oxydants : eau de javel, H2O2, acide per-acétique Ethylène oxyde,ozone, formaldéhyde, glutaraldéhyde, orthophtaldéhyde. Rayonnement UV, gamma très pénétrants, X Filtration 0,2µm bactéries, levures moisissure, < UF, nano filtration phages et virus nonus 4

5 Réduction des populations Élimination totale théorique : limite des techniques de détection Nombre initial,type de micro-organisme,environnement, efficacité de la technique utilisée Acceptation d un risque résiduel Notions de probabilité EN ( 1 élément contaminé pour 10 6 ) label stérile. Appertisation (1810) nonus 5

6 Vapeur saturée La température et le temps doivent être mesurés et archivés(médical,alimentaire,pharmaceutique, BPL, BPF La vapeur doit atteindre toutes les surfaces et liquides à traiter ( purge de l air résiduel) Établir des barèmes. nonus 6

7 Théorie de destruction par la chaleur: Aspects Cinétiques. dn/dt= - kn (1) N : nombre de cellules viables soit au total ou en concentration ( Nbr bact./unité de volume) k : vitesse de destruction (mortalité) min -1 t : temps en min nonus 7

8 Intégration de (1) Ln No / N = o t k.dt N= No e-kt (2) No : nombre de cellules viables à t =0 nonus 8

9 Mortalité des organismes est exponentielle Vitesse de réaction k dépend de l environnement ph Formation d agrégats ( clusters ) Température Nature du micro-organisme Composantes du milieu Effet protecteur de sucres, protéines Plus k est grand plus la destruction est rapide nonus 9

10 Si on transforme N= No e -Kt en base 10 la forme la plus fréquemment rencontrée est N = No 10 t/d (3) D en min et si D = t N = 0,1 No à température constante D = valeur de D = temps nécessaire pour réduire la population de 90% ou d un ordre de grandeur = temps de réduction décimale nonus 10

11 Exp : à 121 C k min-1 D minutes B. subtilis 2,6-3,8 0,6-0,9 B. stearothermophilus 0,77 3 C. sporogenes 1,8 1,3 nonus 11

12 Si on compare N= No e -Kt et N = No 10 t/d D = 2,303 / k (4) D est inversement proportionnel à k une petite valeur de D aboutit à un taux de mortalité élevé log 10 N/No = -t/d = log 10 N - log 10 No (5) Graphe log 10 N = f (t ) temps droite de pente -1/D et l intersection log 10 No Voir Figure 1, tableau 2 : le nombre de microorganismes résiduels n atteint jamais 0 nonus 12

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15 Exp : Si on prend un milieu où : N = 10-7 /ml comme on ne peut avoir une fraction de micro-organisme (µ.org) viable cela veut dire q il y aura au moins un µ.org /10 7 ml soit l Si on a 10-7 µ.org / échantillon ceci veut dire qu il y aura un échantillon de contaminé pour 10 7 échantillons nonus 15

16 Exp: Si No = 10 3 µ.org après un traitement à 121 C 5 min la probabilité de stérilité est équivalent à celle d un échantillon de No= 10 6 initial traité 8 min dans les mêmes conditions Voir table 3 nonus 16

17 Probabilité Aiba et Toda (J.Ferment. Tecnol. (1965) Probabilité d être stérile pour No dans un échantillon et non en concentration P= (1 e kt ) No P =1(1-10 t/d ) No Probabilité d être non stérile 1- P = 1- (1- e kt ) No 1- P = 1- (1-10 t/d ) No nonus 17

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19 Réduction décimale à une température constante Nombre de puissance de 10 de microorganismes que l on souhaite détruire 12 D No/N = log No/N = 12 Temps de stérilisation : F = D x réduction décimale F est déterminé à 121 C Fo valeur stérilisatrice usage IAA nonus 19

20 Effets de la température L effet de la température sur le taux de mortalité k suit la loi d Arrhenius k = A e E/RT (8) E : énergie d activation kcal/g.mole R: constante des gaz parfaits kcal/g.mole.k A: constante empirique Figure 2 log 10 k = f (1/T) pente = - E /2,303 Log 10 A peut être calculé T en K voir Figure 2 nonus 20

21 nonus 21

22 K = A 10 E/2,0303 RT (9 a) log 10 k log 10 A = - E /2,303 RT (9b) Par expérience on a pu établir une relation entre le D et la température en tenant compte du D à 121 C : D 121 log D log D 121 = - ( T-121) / z (10a) D = D (T-121) /z (10 b) z = nombre de degrés nécessaires pour que D change d un facteur 10 z : c est l augmentation de température qui permet de réduire le temps de réduction décimale au 1/10 de sa valeur nonus 22

23 nonus 23

24 Figure 3 : log D log D 121 = - ( T-121) / z log D 100 Pente = - 1/ 2,303 z ,1 z 0,01 T T+z température nonus 24

25 Résistance relative à la stérilisation Bactéries végétatives 1 Spores bactériennes Spores fongiques 2-10 Bactériophages 1-5 Esp : milieu de culture labo 121 C 15min ou 134 C 5 min Prions : 134 C 18 min nettoyage préalable réduction de 10 4 puis stérilisation réduction 10 5 nonus 25

26 nonus 26

27 Exp: T C D min C. jejuni 55 1min L.monocytogenes 71,7 3,3 s E.coli 71,7 1s S.aureus 71,7 4,1 s C.perfringens min C. botulinum 121,1 12s B.stearothermophilus 121,1 5 min nonus 27

28 nonus 28

29 = Ln No/N = Kt = A t (e E/RT ) Interdépendance des critères Si on connaît z on peut estimer E Si on connaît D 121 et z on peut estimer k 121 et après A et E Si on connaît A et E on peut estimer D 121 et z et la valeur théorique de F 121 nonus 29

30 Stérilisation batch biotech Humphrey et Deindorfer ont défini Del facteur : représentation de Ln N0/N ( succès de la stérilisation) L évaluation de est l intégrale d une courbe de k = f (t) dans une plage de température. Les températures <100 C contribuent peu à la stérilisation est sont négligées. nonus 30

31 nonus 31

32 Trois phases Montée en température Phase stationnaire à temp. constante Phase de refroidissement Approximations (Richards,Humphrey, Deindorfer) Températures > 100 C Profil de montée et descente en température sont linéaires Et en conditions standard : augmentation de T de 1 C /min et k peuvent alors être calculés pour chaque µ.org Pour = 40 No/N= 2, En conserverie = 27,63 No/N = nonus 32

33 Chaque phase au dessus de 100 C contribue à la stérilisation effet cumulatif T = m + r + d T: total;m:montée; r:rétention(chambrage). d:descente. Tables établies pour le micro-organismes les plus résistants B. stearothermophilus 1518 A = 4, min -1 E =67400 cal/mole nonus 33

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37 Pratique STÉRILISATION obtenir la probabilité de stérilité souhaitée exp : 0,01 1/100 éviter la destruction des nutriments thermosensibles (vitamines, facteurs de croissance ) Del facteur : mesure du traitement thermique nécessaire pour conduire à un réduction prévue du nombre de cellules vivantes = Ln No/N or Ln N/No = - kt k = A e E/RT = kt = A t e E/RT nonus 37

38 Changement d échelle t = Ln No/N STÉRILISATION Pour un fermenteur de volume V 1 t 1 = Ln No 1 /N Pour un fermenteur de volume V 2 t 2 = Ln No 2 /N No 2 = No 1 x V 2 / V 1 t 2 = Ln No 1 x V 2 / V 1 = Ln No 1 /N + Ln V 2 / V 1 N t 2 = t 1 + Ln V 2 / V 1 nonus 38

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