Transgenèse Rat. Responsable scientifique de la plate-forme Ignacio Anegon, Directeur de Recherche INSERM. Plateau technique labellisé RIO

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1 Inserm U643-Itert Transgenèse Rat ITERT-INSERM INSERM U643 Responsable scientifique de la plate-forme Ignacio Anegon, Directeur de Recherche INSERM Plateau technique labellisé RIO

2 Intérêt des Rats Transgéniques le rat est plus robuste que la souris pour les études physiologiques le rat est de plus grande taille que la souris, ce qui facilite : - la microchirurgie ex: transplantation d organes vascularisés - les prélèvements d organes/d échantillons ex: structures cérébrales - les analyses fonctionnelles in vivo et ex vivo ex: PA, perfusion cardiaque certains modèles de pathologies humaines sont plus reproductibles chez le rat que chez la souris ex: hypertension (renin-2); spondylarthrite autoimmune (HLA-B27) de nombreuses souches consanguines, congéniques et transgéniques disponibles Liste des Publications de disponible sur le web

3 Transgenèse conventionnelle membrane pellucide Technique: Injection plus difficile chez le rat que chez la souris Taux de survie après microinjection 30-65% membrane cellulaire ADN Efficacité dépend de: la qualité des embryons la pureté du fragment d ADN à microinjecter la concentration de l ADN microinjecté conditions de microinjection 0,5 à 3 %

4 Transgenèse lentivirale espace périvitellin vecteur lentiviral Technique: moins traumatique pour l embryon taux de survie de 80-90% Efficacité: dépend du titre (~10 9 PI/ml) et de la pureté ~ 60% Lois C. et al. Science, 2002, 295: 868. Insertion du transgène: sites d insertions multiples ségrégation au hasard dans la descendance Expression du transgène: expression de chaque copie

5 Fonctionnement de la plate-forme Equipements Pièce de microinjection Animalerie conventionnelle Laboratoire de Biologie Moléculaire Personnel I. Anegon, DR INSERM Responsable scientifique 10% L. Tesson, Ingénieur hospitalier Construction et purification d ADN 25% S. Remy, Ingénieur Ouest-Genopole Responsable technique 100% Microinjection et analyse des rats Tg S. Ménoret, Ingénieur CNRS Microinjection et analyse des rats Tg 50% C. Usal, Technicien INSERM Microinjection 25%

6 Capacité de production Superovulation Microinjection d ADN zygotes de vecteurs lentiviraux zygotes Réimplantation des embryons Construction d ADN Purification d ADN à microinjecter 1-22 mois 5-66 projets/an Nouveau-nés 2-33 mois Criblage des animaux F0 à la charge du demandeur Dérivation des lignées

7 Activités R&D de la plate-forme Détermination du statut hétéro/homozygote par PCR quantitative Congélation d embryons de rat Tesson L. et al. Transgenic Res. 2002, 11:43 Stockage et préservation des lignées transgéniques Ménoret S. et al. Transplant. Proc. 1999, 31:1531 Utilisation des vecteurs lentiviraux en Transgenèse Microinjection dans l espace périvitellin ex: Rats GFP Infection des embryons et culture in vitro (en cours) Genome Walking Caractérisation du site d intégration

8 Rats Transgéniques GFP SIN-LTR RRE cppt PGK promoter egfp WPRE SIN-LTR Rev Responsive Element nuclear translocation element posttranscriptional regulatory element self-inactivating 3 LTR HIV-pGK-GFP PI/ml Nb. embryons injectés Nb. embryons transférés(%) Nb. petits (%) Nb. transgéniques (%) ( 87 %) 10 (11 %) 6 (60 %)

9 Nombre de cellules Rats Transgéniques exprimant fortement la GFP Leucocytes Non Tg Tg GFP 80 % Cellules mésenchymateuses CD90 90 % Cellules souches neurales Neurones Intensité de fluorescence Intéressants comme donneur pour : GFP DARP32 GFP Analyse de lignage cellulaire, ontogenèse, différenciation ex: progéniteurs GFP+ de la moelle osseuse Transplantation d organes et de cellules ex: précurseurs neuronaux GFP+ Médecine régénérative ex: cellules souches mésenchymateuses GFP+ Immunologie ex: suivi de leucocytes GFP+ après transfert adoptif Rats Transgéniques exprimant faiblement la GFP Tolérants à la GFP Utiles comme receveur pour le suivi à moyen et à long terme des cellules GFP+

10 Caractérisation du site d intégration du transgène par «Genome Walking» ADN génomique Digestion par des enzymes de restriction à extrémités franches Banque d ADN génomique séquence flanquante transgene Ligation des adaptateur séquence flanquante transgene AP 1 ère PCR transgene specific primer séquence flanquante nested AP 2 ème PCR nested transgene specific primer séquence flanquante Clonage, Séquençage des produits majoritaires de PCR détermination de la séquence flanquante au transgène Banque de données détermination de la position chromosomale

11 Collaborations et Partenaires IFR 26 (P. Moullier) Réseau des Recherches sur le Rat (France) Rat Resource and Research Center (USA) National Bio Resource Project Rat (Japon) Société genoway (Lyon)