RÉGULATION DU CALCIUM INTRACELLULAIRE DANS LE KÉRATINOCYTE Influence de l eau thermale d Avène (*)

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1 7 Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2003, 142, 7-24 RÉGULATION DU CALCIUM INTRACELLULAIRE DANS LE KÉRATINOCYTE Influence de l eau thermale d Avène (*) P. BORDAT (1), E. TOULMÉ (2), F. SAVIGNAN (2), E. NEUZIL (3), B. DUFY (2) Les variations de la concentration du calcium cytosolique ont été étudiées dans différentes conditions expérimentales chez les kératinocytes de la lignée HaCaT cultivés in vitro, cellules à la fois les plus abondantes et les plus caractéristiques de l'épiderme. La dynamique du calcium dans ces cellules est l'un des facteurs qui conditionnent leur différenciation à partir des cellules souches. L'évaluation du calcium intracellulaire [Ca 2+ ] i a été réalisée en mettant en œuvre une technique fluorimétrique applicable aussi bien sur une cellule isolée que sur une population cellulaire. La valeur basale de la [Ca 2+ ] i est influencée par la concentration du calcium extracellulaire. La thapsigargine induit une forte augmentation diphasique de la [Ca 2+ ] i correspondant à la déplétion du pool calcique du réticulum endoplasmique suivie d'un influx calcique provenant du milieu extracellulaire ou "entrée (*) Manuscrit reçu le 23 janvier (1) Pierre Fabre Dermo-Cosmétique, BP 74 Vigoulet-Auzil, Castanet-Tolosan Cedex, auquel la correspondance relative à cet article doit être adressée. pascal.bordat@pierre-fabre.com (2) Laboratoire de Neurophysiologie, CNRS UMR 5543, Université Victor Segalen Bordeaux 2, 146, rue Léo-Saignat, Bordeaux Cedex. bernard.dufy@umr5543.u-bordeaux2.fr, bdneuro@umr5543.u-bordeaux.fr (3) Professeur honoraire (Biochimie médicale), Université Victor-Segalen Bordeaux 2, 146, rue Léo-Saignat, Bordeaux Cedex.

2 8 capacitive", laquelle n'est observée ni sous l'action de la CCCP, qui mobilise le calcium des réservoirs mitochondriaux, ni sous l'action de l'egf. L'action de l'eau thermale d'avène sur la dynamique du calcium intracellulaire est très différente selon la concentration en calcium du milieu de culture. Son action est nulle dans un milieu favorable à la prolifération des kératinocytes (Ca 2+ = 0,5 mm). Dans un milieu privilégiant la différenciation de ces cellules (Ca 2+ = 1,5 mm), milieu dans lequel l'action de la thapsigargine et l'entrée capacitive de calcium sont très diminuées, la présence d'eau d'avène entraîne une augmentation considérable des valeurs de la courbe diphasique des variations de la [Ca 2+ ] i, portant principalement sur l'entrée capacitive. INTRODUCTION Voici deux ans, nous avons présenté ici-même une étude sur l'influence de l'eau thermale d'avène sur la dynamique du calcium intracellulaire [ 3 ] ; nos premières expériences ont été réalisées sur deux types différents de cellules : des cellules d'ovaire de Hamster de la lignée CHO K1, sélectionnées comme modèles de cellules non excitables, incapables de générer des potentiels d'action lors d'une stimulation chimique ; ces cellules sont dépourvues de canaux ioniques voltage-dépendants et leurs canaux calciques sont activés par un second messager (second messengeroperated channels ou SMOC). des cellules hypophysaires de la lignée GH3, cellules excitables par action d'un neurotransmetteur ou d'une hormone : l'ouverture de leurs canaux calciques voltage-dépendants fait suite à la dépolarisation de la membrane plasmique, ce qui entraîne une augmentation transitoire de la concentration calcique cytosolique. Nous avons voulu étendre nos précédentes recherches à des cellules directement impliquées dans la physiologie et la pathologie de la peau, puisque la station thermale d'avène-les-bains est spécialisée dans le traitement des affections cutanées [ 8,16,18 ] : les propriétés apaisantes, anti-inflammatoires et cicatrisantes de l'eau d'avène ont été largement démontrées [ 7,17,24 ]. La présente communication porte sur le kératinocyte, cellule particulièrement caractéristique de l'épiderme. Le kératinocyte, dont

3 9 les caractéristiques électrophysiologiques ne seront pas abordées dans cette communication, entre dans le cadre des cellules non excitables. Le kératinocyte L'épiderme, comme les divers épithéliums qui tapissent les voies digestives, sont des tissus particulièrement exposés aux atteintes physiques, chimiques ou microbiennes du monde extérieur. Ces tissus assurent pour l'organisme une barrière protectrice grâce à l'élimination progressive de leurs parties les plus superficielles, perte compensée par un renouvellement cellulaire continu à partir de cellules souches. L'épiderme est un épithélium pluristratifié (Figure 1) dont les cellules principales sont les kératinocytes. Cette dénomination englobe différents stades de différenciation cellulaire à partir de cellules basales, situées dans la partie la plus profonde de l'épiderme et séparées du tissu conjonctif du derme sous-jacent par une lame basale. Ces cellules basales, par leurs mitoses asymétriques (Figure 2), assurent à la fois leur renouvellement (maintien d'un contingent de cellules souches non différenciées) et la formation d'autres cellules basales, les "transit amplifying cells" [ 11 ]. Fig. 1 : Les cellules de l épiderme (d après [ 1 ]). Ces "transit amplifying cells" restent dans la couche basale où elles subissent un nombre limité de divisions, puis s'orientent vers la surface de l'épiderme : sous l'influence de différents stimuli et de facteurs de croissance, elles se différencient en kératinocytes, représentés tout d'abord

4 10 par les cellules épineuses. Ces dernières renferment déjà des faisceaux de filaments de kératine insérés sur des desmosomes [δεσµóς = lien] qui, formant de petites épines sur la surface cellulaire, contribuent ainsi à lier les cellules entre elles [ 6 ]. Fig. 2 : Divisions asymétriques d une cellule souche (d après [ 1 ]). TED : Transit amplifying cell Engagée dans la voie de Différenciation Les cellules épineuses, dans l'étape suivante, acquièrent des granules de kératohyaline, substance qui renforce les liaisons entre les filaments de kératine. Les cellules épineuses deviennent ainsi des cellules granuleuses qui, de plus, garnissent leur surface d'une protéine de protection particulièrement dure, l'involucrine. La couche cellulaire granuleuse représente la dernière couche de cellules métaboliquement actives (Figure 3). Le dernier stade de cette différenciation, qui dure en tout quelques semaines, se caractérise par des processus d'apoptose qui entraînent la perte du noyau et des organites cytoplasmiques. Des cellules aplaties, fortement kératinisées, apparaissent et s'empilent pour former des colonnes plus ou moins hexagonales. Les plus superficielles de ces cellules, qui forment le stratum corneum, se détachent finalement par écailles : ce sont les squames. Mentionnons encore la présence entre les kératinocytes de quelques cellules beaucoup moins abondantes : cellules dendritiques de Langerhans (proches des macrophages), mélanocytes et cellules de Meckel (associées à des terminaisons nerveuses venues du derme).

5 11 Fig. 3 : Les différentes couches cellulaires de l épiderme (d après [ 1 ]). Le but de nos investigations est double : Apporter une meilleure connaissance de la régulation du calcium cytosolique chez les kératinocytes, puisque l'on sait que les ions calcium jouent un rôle déterminant dans le développement et la différenciation des cellules basales de l'épiderme [ 2,9,12-13,21-22,26 ]. Rechercher un effet éventuel de l'eau thermale d'avène (ETA) sur la concentration du calcium cytosolique [Ca 2+ ] (*) i. MATÉRIEL ET MÉTHODES Culture des kératinocytes Des kératinocytes de la lignée HaCaT (*), sont cultivés sur des lamelles de verre placées dans des boîtes de Petri dans du milieu DMEM / (*) Pour la répartition du calcium intracellulaire, voir [ 3 ]. (*) Ce sigle rappelle que les kératinocytes de cette lignée sont d'origine Humaine, proviennent d'un adulte et que leur culture est sensible à la concentration en Calcium et à la Température.

6 12 Ham F12 (Seromed, France) de concentration en Ca 2+ 0,5 mm ; ce milieu est additionné de 10 % de sérum de veau fœtal, de L-glutamine (146 mg/l) et de pyruvate de sodium (110 mg/l). Les cellules sont maintenues en étuve à 37 C, dans une atmosphère humide (air/co 2, 95:5, vol./vol.). Pour certaines expériences, la concentration en Ca 2+ a été modifiée. Les recherches ont été réalisées sur des cellules isolées ou sur des populations cellulaires ( cellules environ par puits). Composition des milieux Dans tous les milieux HBSS décrits ci-dessous utilisés pour détermination de la [Ca 2+ et pour la mesure des pools calciques libérables, ]i le ph est ajusté à 7,3-7,4 et l'osmolarité à 300 mosm. Milieu standard HBSS (en mm) NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 MgSO 4 NaHC O 3 NaH 2 P O 4 KH 2 PO 4 HEPE S Glucos e (mm) 136,9 5,4 2,0 2,0 0,9 4,2 0,169 0,22 10,0 5,6 L'eau distillée utilisée pour la confection de ce milieu est de qualité milliq. Eau thermale d'avène (en mg/l) HCO 3- SO 4 2- Cl - Ca 2+ Mg 2+ K + Na + Résidu sec mg/l ,4 3, ,1 1,1 4,1 266 mm 4,3 0,26 1,35 1,34 1,11 0,028 0,17 Milieu HBSS-A C est le milieu HBSS standard réalisé avec l'eau thermale d'avène, qui remplace l'eau distillée ; toutefois, la concentration en calcium et en magnésium du milieu de base HBSS a été modifiée par ajout de 0,66 mm de CaCl 2 et 0,89 mm de MgCl 2 de façon à ce que la concentration finale de ces deux ions reste la même que celle indiquée pour le milieu HBSS, malgré la présence d'eau d'avène.

7 13 Agents pharmacologiques Thapsigargine (TG) À la concentration de 1 µm, elle inhibe les pompes calciques ATP-ases du réticulum endoplasmique, d'où la libération du calcium de ce réservoir intracellulaire [ 25 ]. Carbonyl-Cyanide-m-ChloroPhénylhydrazone ou CCCP (1 mm) Ce découplant mitochondrial induit la mobilisation du calcium des réservoirs mitochondriaux [ 10 ]. Epidermal Growth Factor (EGF) Ce produit (Sigma-Aldrich Chimie, France) a été utilisé à la concentration de 15 nm. Détermination de la concentration du calcium cytosolique La spectrofluorimétrie permet de mesurer, sur une population de cellules, la [Ca 2+ ] i grâce à une sonde fluorescente sensible au calcium, (sonde Indo-1). Cette sonde est utilisée sous la forme de son ester acétoxyméthylique (Indo-1 AM), qui pénètre facilement dans la cellule où il subit une hydrolyse ; la forme acide ainsi libérée se lie aux ions calcium. La sonde Indo-1, excitée à 350 nm, présente deux émissions à 405 et à 480 nm, qui correspondent respectivement à la forme liée et à la forme libre [ 15 ]. L'augmentation de l'émission à 405 nm, associée à la diminution de l'émission à 480 nm, indique donc une augmentation de la concentration intracellulaire en calcium libre [ 3 ]. Cette dernière peut être estimée en valeurs arbitraires à partir du rapport entre les mesures de fluorescence à 405 et 480 nm. Le protocole expérimental est le suivant : les cellules, incubées pendant 60 min dans un des milieux HBSS en présence de 5 mm d'indo-1 AM (Calbiochem, La Jolla, CA), sont rincées puis introduites dans la cuve du spectrofluorimètre. Après stabilisation de la fluorescence, le niveau de base de la [Ca 2+ ] i est alors mesuré puis les cellules sont stimulées par les trois agents pharmacologiques. Mesure de la prolifération cellulaire Les cellules sont mises en culture (plaque de 24 puits, 5 x 10 6 cellules par puits) dans un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % d'un mélange pénicilline-streptomycine. On ajoute les substances à tester, calcium (1 et 2 mm) ou ETA (4 et 8 mm) puis, après 36 heures, la thymidine tritiée (1 mci / puits). Après 4 heures, les cellules sont rincées deux fois avec du RPMI sans sérum. Une

8 14 nouvelle incubation de 90 minutes à 37 C en présence d'une forte concentration de thymidine non marquée (50 mm) permet d'éliminer la thymidine tritiée fixée de manière non spécifique. Les cellules sont lysées avec de la soude 0,2 M : la radioactivité est comptée au compteur LS 6000 Packard. RÉSULTATS Après l'exposé des résultats obtenus relatifs à la concentration cytosolique en calcium basale des kératinocytes et ses variations induites par le calcium extracellulaire ou par la libération du pool calcique du réticulum endoplasmique induite par la thapsigargine, nous examinerons comment ces données sont modifiées par la présence d'eau thermale d'avène. La concentration en calcium du milieu extracellulaire influence la concentration calcique basale du cytosol Des populations de kératinocytes ont été cultivés pendant 3 à 4 jours dans le milieu de culture DMEM / Ham F12, de concentration en calcium 0,5 mm. Les mesures de la [Ca 2+ ] i ont été réalisées dans le milieu standard HBSS, dont la concentration calcique est de 2 mm et également dans des milieux HBSS de concentration calcique réduite (0,2 mm) ou nulle. Les valeurs de la [Ca 2+ ] i basale (Tableau I) montrent clairement la relation entre la concentration calcique du milieu extracellulaire et celle du cytosol. Tableau I : Valeurs de la concentration du calcium cytosolique du kératinocyte dans différentes conditions expérimentales Les valeurs mesurées sur des populations cellulaires sont exprimées par le rapport des mesures de fluorescence à 405 et 480 nm. [Ca 2+ ] i du milieu de mesure HBBS (mm) [Ca 2+ ] i basale [Ca 2+ ] i max après 1 µm thapsigargine 30 sec 2 83,5 ± 10,1 (n = 13) 181,1 ± 62,1 (n = 19) 0,2 74,4 ± 19,8 (n = 13) 127,4 ± 26,1 (n = 7) 0 52,0 ± 10,6 (n = 22) 107,6 ± 39,4 (n = 11)

9 15 Le pool calcique libérable par la thapsigargine est affecté par la concentration calcique du milieu extracellulaire Les cinétiques et l'amplitude des variations de la [Ca 2+ ] i induites par la TG sont assez variables d'une cellule à l'autre (Tableau I, colonne de droite) ; elles dépendent aussi des conditions de culture, comme nous le verrons plus loin. Au total, la régulation du calcium libre intracellulaire des kératinocytes HaCaT est très comparable à celle des autres types de cellules inexcitables étudiées à ce jour. Ceci renforce l'intérêt d'utiliser ces cellules épidermiques pour approfondir l'étude d'une eau thermale de spécificité dermatologique reconnue. La libération d'un pool calcique par la thapsigargine est suivie d'un influx calcique provenant du milieu extracellulaire La thapsigargine, à la concentration de 10-6 M, provoque une augmentation de la [Ca 2+ ] i qui comprend deux phases : la libération d'un pool du réticulum endoplasmique, suivie d'une "entrée capacitive" de calcium à partir du milieu extracellulaire (Figure 4). Fig. 4 : Concentration du calcium cytosolique du kératinocyte isolé après application de thapsigargine (10-6 M, 30 sec). A : Caractère biphasique de la courbe B : Interprétation des deux phases : la première présente un maximum entre la 2 e et la 3 e minute, la seconde entre la 6 e et la 8 e. Le kératinocyte a été cultivé en présence de 0,5 mm de Ca 2+ et la mesure a eu lieu dans le milieu HBBS à 2 mm de Ca 2+.

10 16 L'entrée capacitive est supprimée par le contact à la surface de la cellule avec 2 ml d un milieu dépourvu de calcium ou lorsque les mesures de fluorescence sont effectuées dans un milieu sans calcium (Figure 5). Dans les conditions de culture standard (0,5 mm en calcium), la concentration calcique cytosolique reste très élevée après la libération du pool par la thapsigargine : ces cellules ont donc une entrée capacitive importante. Fig. 5 : Influence du calcium extracellulaire sur l action de la thapsigargine (20 µl dans 2 ml de milieu HBBS) sur un kératinocyte isolé. Le kératinocyte a été cultivé en présence de 0,5 mm de Ca 2+ et la mesure a eu lieu dans le milieu HBBS dénué ou non de 2 mm de CaCl 2. Le CCCP, en application aiguë (1 µm, 30 sec), entraîne également une augmentation de la [Ca 2+ ] i mais, contrairement à la TG, cette augmentation ne s'accompagne pas d'une entrée capacitive (Figure 6). L'augmentation de la concentration cytosolique en calcium en présence d'egf (15 nm) n'est pas due à une entrée de calcium car elle se produit même si le milieu extracellulaire est dépourvu de ce cation (Figure 6). L'origine du pool intracellulaire ainsi mobilisé n'a pas été recherchée.

11 17 Fig. 6 : Influence du CCCP et de l EGF (Epidermial Growth Factor) sur la concentration du calcium cytosolique du kératinocyte isolé. Le kératinocyte a été cultivé en présence de 0,5 mm de Ca 2+ et les mesures ont eu lieu dans le milieu HBBS avec 0 ou 2 mm de CaCl 2. Influence de la concentration calcique du milieu de culture des kératinocytes sur leur [Ca 2+ ] i basale et sur leur pool de calcium libérable Il a été montré [ 9,13,22,26 ] que l'augmentation de la concentration en calcium dans le milieu de culture des kératinocytes freine leur prolifération et favorise leur différenciation. Nous avons voulu vérifier ce point en portant de 0,5 à 1,5 mm la concentration en calcium du milieu de culture DMEM.

12 18 Cette modification amène effectivement une diminution de la prolifération, que nous avons contrôlée par l'étude de l'incorporation de thymidine tritiée. L'adjonction au milieu de culture de 1 mm de calcium supplémentaire présente un effet inhibiteur (20 % d'inhibition après 36 heures d'incubation), effet cependant plus faible que celui du tétraéthylammonium (TEA) à 8 mm (50 % d'inhibition, avec blocage du cycle cellulaire en phase G1). L influence du changement de concentration calcique sur la différenciation des kératinocytes est en cours d étude. Les kératinocytes cultivés dans ces conditions ont un calcium cytosolique basal légèrement augmenté, mais de manière non significative, un pool libérable par la TG fortement diminué et une très faible entrée capacitive (Tableau II). Tableau II : Influence des conditions de culture et de l'incubation ultérieure dans l'eau thermale d Avène sur la concentration du calcium cytosolique en présence de thapsigargine Les [Ca 2+ ] i, exprimées par le rapport des mesures de fluorescence à 405 et 480 nm, sont les valeurs basales, maximales et celles mesurées 5 ou 8 minutes après avoir mis les kératinocytes au contact de la thapsigargine (10-6 M, 30 sec). Culture [Ca 2+ ] i (mm) Milieu Mesure (2 mm Ca 2+ ) Valeurs basale maximale à 5 min à 8 min 0,5 HBSS (n = 26) 81,7 ± 8,5 157,9 ± 68,2 148,6 ± 67,7 150,0 ± 64,9 0,52 HBSS-A (n = 28) 85,9 ± 13,6 161,7 ± 62,2 149,9 ± 47,8 143,6 ± 59,4 1,5 HBSS (n = 18) 90,6 ± 13,6 104,4 a ± 59,2 77,2 a ± 49,2 57,1 a ± 49,2 1,5 HBSS-A (n = 18) 87,5 ± 7,7 235,3 b ± 134,7 180,4 b ± 122,5 132,1 b ± 72,8 a : différence significative à 1 % par rapport à la mesure effectuée dans le milieu HBSS avec une culture avec 0,5 mm Ca 2+ b : différence significative à 1 % par rapport à la mesure effectuée dans le milieu HBSS avec une culture avec 1,5 mm Ca 2+.

13 19 Influence de l'eau thermale d'avène sur la régulation du calcium intracellulaire des kératinocytes Deux types d'expériences ont été réalisées : les premières avec des kératinocytes en phase de prolifération, obtenus avec le milieu de culture DMEM habituel, pauvre en calcium [0,5 mm] ; les secondes avec sur des kératinocytes en phase de différenciation provenant d'un milieu DMEM enrichi en calcium [1,5 mm]. Les résultats sont groupés dans le Tableau II. Lorsque la concentration en calcium du milieu de culture est faible (0,5 mm), la présence d'eau d'avène ne modifie ni la valeur basale du calcium cytosolique, ni la valeur du pool calcique libérable par la thapsigargine. La culture des kératinocytes en milieu plus riche en calcium (1,5 mm) donne des résultats très différents : l'eau d'avène, qui ne modifie pas la [Ca 2+ ] i basale, augmente le pool calcique libérable par la TG (maximale à 5 min) et l'entrée capacitive (à 8 min). Les enregistrements de la [Ca 2+ ] i, reproduits sur la Figure 7, effectués sur des kératinocytes isolés, mettent bien en valeur l'augmentation considérable de l'entrée capacitive. Fig. 7 : Influence de l eau thermale d Avène (ETA) sur la concentration du calcium cytosolique du kératinocyte isolé après une brève application de thapsigargine (1 µm). Les deux kératinocytes ont été cultivés en présence de 1,5 mm de Ca 2+ et les mesures ont eu lieu dans le milieu HBSS ou HBSS-A à 2 mm de Ca 2+. Les études sur des populations cellulaires confirment ces résultats (Figure 8).

14 20 Fig. 8 : Influence de l eau thermale d Avène sur la concentration du calcium cytosolique de kératinocytes après application de thapsigargine (1 µm) pendant 200 ou 400 sec. Les mesures ont été réalisées sur des populations cellulaires dans le milieu HBSS ou HBSS-A. Nous avons enfin montré que l'eau thermale d'avène n'a pas d'effet sur l'augmentation de la [Ca 2+ ] i induite par le CCCP (n = 55) ou par l'egf (n = 20). DISCUSSION Les travaux présentés dans cet article apportent la confirmation de nos recherches antérieures : l'eau thermale d'avène est capable d'agir sur la dynamique du calcium intracellulaire. Plus important encore sur le plan de la dermatologie, l'action de cette eau thermale, dont l'effet favorable sur la peau est reconnue, peut être démontrée sur les kératinocytes, cellules particulièrement représentatives du revêtement cutané et dont le comportement physiologique peut subir des altérations conduisant à des maladies de la peau. Nous avons montré que le kératinocyte en culture présente une dynamique du calcium libre cytosolique très comparable à celle d'autres

15 21 cellules inexcitables. La concentration cytosolique du calcium libre dépend de deux processus : de la libération des pools calciques, en particulier celui du réticulum endoplasmique, et d'une entrée de calcium extracellulaire de type capacitif. Lorsque les kératinocytes se développent dans un milieu de culture riche en calcium et se trouvent donc en contact avec ce cation pendant de longues périodes (heures ou jours), la libération de calcium à partir du réticulum endoplasmique et surtout l'entrée capacitive du calcium extracellulaire présent dans le milieu de mesure est fortement diminuée. L'action de l'eau thermale d'avène est manifeste dans ces conditions particulières qui freinent la prolifération cellulaire tout en permettant la différenciation des kératinocytes : l'eau d'avène conduit à une forte augmentation de la rentrée capacitive de calcium. On peut émettre l'hypothèse que l'eau d'avène, grâce à cette entrée capacitive, favorise les réactions de maturation des kératinocytes. Ceux-ci, au niveau de la couche granuleuse, synthétisent diverses protéines (filaggrine [ 5,23 ], loricrine [ 4,14 ]) qui, en s'unissant avec les filaments de kératine déja formés dans l'étape précédente des cellules épineuses, vont donner les agglomérats protéiques condensés du stratum corneum. Ces agrégats résistent aux dégradations de diverses origines (enzymes cutanés ou agents corrosifs extérieurs). Les liaisons entre ces protéines seraient sous la dépendance de transglutaminases épidermiques, calcium dépendantes, qui forment des liaisons γ-glutamyl-ε-lysine [ ]. Des recherches seront entreprises dans notre laboratoire en vue d'étayer cette hypothèse : action de l'eau thermale d'avène sur la synthèse des différents types de kératine et des autres protéines épidermiques. Par ailleurs, il est indispensable de mieux connaître le mécanisme d'action de l'eau d'avène et en particulier de préciser l'importance éventuelle du rapport magnésium / calcium, rapport qui singularise cette eau parmi les autres eaux thermales utilisées pour les soins dermatologiques [ 3 ]. BIBLIOGRAPHIE 1 - Alberts (B.), Johnson (A.), Lewis (J.), Raff (M.), Roberts (K.), Walter (P.) Eds - Molecular biology of the cell. - 4 e édit., New York, N.Y. : Garland Science, 2002, 1463 p + 36 p (glossaire) + 49 p (index). 2 - Bikle (D.D.), Ng (D.), Tu (C.L.), Oda (Y.), Xie (Z.) - Calcium- and vitamin D-regulated keratinocyte differentiation. - Mol. Cell. Endocrinol., 2001, 177(1-2),

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