Apport de la biologie moléculaire en onco-hématologie : exemple de la Leucémie Myéloïde Chronique. Claire Abbal/ARL
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- Justin Milot
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1 Apport de la biologie moléculaire en onco-hématologie : exemple de la Leucémie Myéloïde Chronique
2 Historique LMC : découverte (1) Alfred Velpeau ( ) Description 1 ère patiente avec probable LMC (1827) Symptômes Fièvre Fatigue Abdomen gonflé Autopsie Hépatosplénomégalie Aspect du Sang : «Epais comme du gruau, davantage semblable à du pus qu à du sang» Alfred Donné ( ) 1844 : Description d un cas similaire («sang semi-purulent») + observations microscopiques. La majorité des cellules sont «incolores» (globules blancs) et non rouges.
3 Rudolf Virchow ( ) Historique LMC : découverte (3) «Weisses Blut» Leucémie 1845 Virchow, R. Frorieps Notizen, 36, La leucémie est une maladie autonome et progressive (=cancer ).
4 Historique LMC : Contexte Croyances du XIX ème siècle : Les globules rouges sont issus des globules blancs. Les globules blancs sont produits par les ganglions lymphatiques ou par la rate. Ernst Neumann ( ) Les leucocytes sont produits dans la moelle osseuse Par une cellule unique capable d auto-renouvellement
5 Sang Moelle Osseuse Hematopoïèse D I F F E R E N C I A T I O N Myéloïde Monocytaire CSH Progéniteur Myéloïde Commun lymphopoïèse Mégacaryocytaire Erythroïde Granulocytes Claire Monocytes Abbal/ARL Thrombocytes Erythrocytes
6 LMC : Caractérisation cellulaire du frottis sanguin Paul Ehrlich (prix Nobel 1908) Frottis sanguin LMC Invention de la coloration cellulaire (1879) Myélémie + Granulocytose
7 LMC et Chromosomes (1) P. Nowell & D. Hungerford Découverte du chromosome de Philadelphie (Phi) (1960) Image Cytogenetics Gallery: Pathology Department University of Washington
8 LMC, chromosomes et gènes Janet D. Rowley Découverte de la t(9;22) (1973) La translocation t(9;22) génère un gène de fusion : BCR-ABL Le BCR-ABL code pour une protéine chimérique «fonctionnelle»
9 Effets de la protéine chimérique BCR-ABL BCR-ABL Stimulation Prolifération Inhibition Apoptose Inhibition suppresseurs tumeur Instabilité génomique Phénotype Malin CANCER Adapté de DEININGER W.N. et al.,blood, 2000, 96, 3343
10 Le BCR-ABL exerce ses effets via son activité Tyrosine Kinase (TK) Proliferation
11 Leucocytose Myélémie Physiopathologie LMC BCR-ABL CSH Cellule souche hématopoïétique S a n g Cellules BCR-ABL + CSL Cellule souche leucémique BCR-ABL + Prolifération, immortalité Différenciation OK Nombre élevé Passage dans le sang Nombre élevé Myélocytes Non segmentés Promyélocytes Métamyélocytes D I F F E R E N C I A T I O N
12 LMC : prise en charge du prélèvement Sang Périphérique Elimination des érythrocytes (choc hypotonique) Cell. mononucléées + Granulocytes Lyse préservant ARN Lysat cellulaire «ARN-stabilisé» Extraction ARN Transcription inverse BCR-ABL +??? Polymerase Chain Reaction (PCR) ADNc
13 Détection du BCR-ABL au diagnostic PCR : amplification enzymatique d une séquence d ADN délimitée par des amorces homologues et spécifiques mbcr-abl e1-a2 P1 (e1) 521 pb P2 (e3) MBCR-ABL e13-a2 e14-a2 342 pb P 1 (e12-e13) P2 (e3) 417 pb P 1 (e12-e13) P2 (e3) BCR-ABL e19-a2 957 pb P 1 (e12-e13) P2 (e3)
14 Marqueurs de PM 50 bp 100 bp Rare e19-a2 «BCR-ABL» (960bp) K562 (e14-a2) in HL e14-a2 (417 bp)
15 TRAITEMENTS ( ) IFN- ± Ara-C : non curatif + problèmes de tolérance Greffe allogénique : risquée, réservée aux <55 ans. Les Phases de la LMC Chronique Accélération Blastique Durée 5 ans 6 mois 3 mois
16 Et si on bloquait spécifiquement le BCR-ABL? + Inhibiteur de Tyr Kinase (TKI) Proliferation Apoptosis
17 Imatinib Mesylate (Glivec ; Novartis) Le Glivec normalise La FS des patients LMC En quelques semaines Mieux toléré que IFN Edition du 28 Mai 2001
18 Les inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI) : une thérapie ciblée.
19 Charge en cellules leucémiques (log10) Suivi de la réponse au traitement Cytogenetics FISH 1-2-log reduction RQ-PCR RT-PCR ~5 log reduction Dx Mois de Traitement Temps 2009 by American Society of Hematology (ASH). Reproduced with permission of ASH via Copyright Clearance Center. Dx, diagnosis; FISH, fluorescence in situ hybridization; RT-PCR, real-time polymerase chain reaction. Radich JP. Blood. 2009;114:
20 Suivi de la réponse au traitement La RQ-PCR mesure la quantité de BCR-ABL en nombre de copies. PROBLEME BCR-ABL mes. BCR-ABL réel CAR Dégradation d ARN (proportionnelle au temps) Efficacité des étapes d extraction d ARN, de RT Imprécision de mesure (dosage ARN, RQ-PCR) Imprécision du pipetage
21 Suivi de la réponse au traitement SOLUTION Mesure simultanée de l expression d un gène «housekeeping» : ABL Normalisation du BCR-ABL par l ABL. BCR-ABL mes = BCR-ABL réel x F (err) ABL mes = ABL réel x F (err) Comme ABL est constant (temps, individus), le s valeurs BCR-ABL peuvent être comparées: d un point de suivi à un autre chez un même patient d un patient à l autre (études cliniques) à condition que les analyses comparées aient été faites dans le même laboratoire. Standardisation Internationale (BCR-ABL/ABL) local x FC local = BCR-ABL % IS
22 BCR-ABL %, IS Molecular Response (IS) Decreasing residual leukaemia Diagnostic Major Molecular Response RQ-PCR non detected Complete Molecular Response Total Number of Leukaemia Cells
23 Without Event, % IRIS: Achievement of MMR by 18 Months Associated With Improved EFS % 86% P = % 58% BCR-ABL % (IS) 0.1% (n = 164) >0.1-1% (n = 47) >1-10% (n = 25) >10% (n = 13) Months Since Start of Treatment * MMR defined as BCR-ABL% (IS) 0.1. EFS, event-free survival; MMR, major molecular response. Hughes TP, et al. Blood. 2008;112: [abstract 334] (oral).
24 Cf commentaire BCR/ABL % Mme B, LMC, M 100 Nilotinib Stop Imatinib (effets 2ndaires) sang moelle seuil de détection
25 Diag MRD2 MRD4 MRD6 MRD8 MRD10 MRD12 MRD14 MRD16 MRD18 BCR/ABL /ABL% M A, LMC 100 Imatinib (mg/j) Dasatinib (mg/j) m 9 m 10 m 6 m 2 m 15 m 10 sang moelle 1 seuil de détection valeur corrigée
26 BCR/ABL % Mme S, LMC MBCR-ABL, sang moelle seuil de détection Réfractaire au glivec, greffée en 2005
27
28 Mutations in KD domain of BCR-ABL confer resistance to TKIs Mise en évidence et identification d une mutation PCR de la portion génique codant pour le domaine KD du BCR-ABL et séquençage Intérêt : une mutation résistante à un TKI peut être sensible à un autre TKI adaptation thérapeutique selon l identité de la mutation
29 Différents types de mutation
30 Orientation clinique selon le type de mutation T315I greffe cell. souche allogénéique ou nouvelle molécule en test Q252H, V299L, F317 Nilotinib plutôt que Dasatinib Y253H, E255K/V, F359V/C Dasatinib plutôt que Nilotinib
31 Carole GERBEX Frédéric Bauer Marzia Terzaroli-Wirz Stéphane Mathieu
32 Laboratoire d Hématologie Moléculaire BH Dr C. Abbal Mme M. Terzaroli-Wirz Mme C. Gerbex M. Frédéric Bauer M. Stéphane Mathieu
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