Méthodes d évaluation de l activité des antibiotiques in vitro
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- Véronique Gravel
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1 Méthodes d évaluation de l activité des antibiotiques in vitro 17 Mars-2009 M. Archambaud Laboratoire Bactériologie-Hygiène CHU Rangueil Toulouse
2 Définition d'un antibiotique "Toute substance chimique, élaborée par un microorganisme ou produit par synthèse, à coefficient chimothérapeutique élevé dont l'activité se manifeste à très faible dose d'une manière spécifique, par l'inhibition de certains processus vitaux, à l'égard des microorganismes."
3 Plus de 60 ans d histoire 1897 : E. Duchesne «Concurrence vitale» Antagonisme entre les moisissures et les microbes 1928 : Flemming découverte de la pénicilline G 1935 : découverte des sulfamides 1942 : utilisation de la pénicilline G en clinique après purification de la Pénicilline G par Florey et Chain
4 Méthodes d évaluation de l activité des antibiotiques in vitro : CMI et CMB CMI : concentration minimale inhibitrice : plus petite concentration d antibiotique qui inhibe toute culture visible d une souche bactérienne après 18 heures de culture à 37 C. Cette valeur caractérise l effet bactériostatique d un antibiotique.. CMB : plus petite concentration d antibiotique ne laissant subsister 0,01% ou moins de survivants de l inoculum initial après 18 heures de culture à 37 C. Cette valeur caractérise l effet bactéricide d un antibiotique
5 CMI : détermination Concentration d antibiotiques mg/l Même inoculum bactérien 10 6 bactéries/ml CMI = 2 mg/l
6 Courbe de croissance en présence d antibiotiques Nombre de bactéries/ml témoin 10 6 bact/ml Inoculum initial 10 2 bact/ml < ou = 0,01% de survivants 2mg/l 4mg/l bactériostase 8 mg/l CMI 16 mg/l 32 mg/l bactéricidie 64 mg/l CMB Temps en heures
7 Antibiotiques bactériostatiques - Antibiotiques bactéricides Selon leur activité, les antibiotiques sont classés : Antibiotiques bactériostatiques CMB éloignée des CMI : CMB > 32 x CMI les macrolides, tétracyclines, rifamycines, sulfamides Antibiotiques bactéricides CMB proches des CMI : CMB < 32 x CMI aminosides - β-lactamines - quinolones - glycopeptides Tolérance : Certaines souches pourront être tolérantes vis à vis d'antibiotiques normalement bactéricides, si les CMB de ces antibiotiques s'éloignent des CMI (>32 fois)
8 Antibiotique concentration ou temps dépendant
9 Antibiotiques concentration dépendants l'activité bactéricide augmente avec la concentration d'antibiotique: et ont généralement une vitesse de bactéricidie rapide (les aminosides, les fluoroquinolones) L'obtention in vivo de concentration élevée semble déterminante Cette observation est à la base du mode d'administration proposé dose journalière pour les ATB concentration dépendants
10 Antibiotiques temps dépendants l'intensité de la bactéricidie est corrélée avec la durée pendant laquelle la concentration dépasse la CMI : ces antibiotiques sont les β-lactamines, les glycopeptides Cette observation est à la base du mode d'administration proposé doses fractionnées, en continu pour les ATB temps dépendants
11 Mise en route d une antibiothérapie Infection documentée Détermination du profil de sensibilité à différents antibiotiques de la ou des bactéries responsables de l infection Antibiogramme
12 Antibiogramme : Test prédictif * détermine le profil de sensibilité d une bactérie à un panel d antibiotiques * étudie l activité bactériostatique des antibiotiques * établit un lien avec les concentrations critiques qui déterminent les classes S, I, R, prédictives du succès ou de l échec thérapeutique. Test prédictif et non descriptif : valeur relative Son résultat est confronté aux résultats thérapeutiques
13 Antibiogramme en milieu solide par diffusion en milieu gélosé Antibiotique : disque papier imprégné charge d antibiotique formation d un gradient de concentration autour du disque Bactérie : inoculum bactérien calibré déposé à la surface d une gélose (milieu standardisé Muller Hinton) Incubation 37 C pendant 18 heures Lecture : Images d inhibition de la culture autour du disque
14 Antibiogramme par diffusion en milieu gélosé Gradient de concentration CMI Diamètre d inhibition
15 Lecture d un antibiogramme par diffusion en milieu gélosé Mesure du diamètre d inhibition Relation entre diamètre et CMI : courbe de concordance établie sur un grand nombre de souches 2 1,75 1,50 1,25 1 0,75 0,5 0,2 0,01 0,02 0,04 0,1 0,2 0,
16 Lecture d un antibiogramme par diffusion en milieu gélosé Pour être efficace la concentration sérique d un antibiotique doit être supérieure à la CMI Détermination des concentrations critiques (et les diamètres critiques) : qui découlent de données pharmacologiques (concentrations sériques obtenues avec des posologies habituelles) et définissent les classes S, I, R, raisonnablement prédictives du succès ou de l échec thérapeutique Valeurs données par des groupes experts nationaux, européens
17 Lecture interprétative de l antibiogramme en milieu gélosé 1disque d antibiotique, une bactérie, un diamètre d inhibition = S, I, R La lecture doit être interprétative : mécanisme de résistance faiblement exprimé Basée sur la reconnaissance des phénotypes de résistance naturelle ou acquise : - lecture comparative pour plusieurs antibiotiques de la même famille - règles d interprétation CASFM - systèmes expert : lecture couplée à la lecture des diamètres par caméra
18 Antibiogramme en milieu liquide Automatisation possible Lecture informatisée Mesure de l activité bactériostatique en milieu liquide, -2 concentrations correspondantes aux concentrations critiques - plusieurs concentrations Lecture automatique de la croissance bactérienne Couplée à une informatique pour déterminer les classes S, I, R Systèmes experts pour la reconnaissance des mécanismes de résistance: -intégration des règles d interprétation dans la base de données -intégration de zones de CMI pour chaque phénotype de résistance connu
19 Antibiogramme : réponse au clinicien Liste des antibiotiques : DCI et noms commerciaux Réponse interprétée en S, I ou R Méthodologie CMI si possible Commentaires : phénotypes de résistance aux antibiotiques (Posologie moyenne Coût du traitement par molécule) Signalement d une BMR (bactérie multirésistante) Signalement CLIN résistance inhabituelle (décret )
20 Détermination des CMI en milieu gélosé : -méthode de référence, différentes dilutions incorporées dans boîte de gélose, plusieurs souches -à l unité : E Test, de réalisation facile, en milieu liquide : systèmes automatisés Intérêts : repérer les sensibilités diminuées : ex Pneumocoque et β-lactamines Staphylocoques et teicoplanine adapter les posologies comparaison CMI - dosage sérique situations où les données pharmacologiques (volume de distribution) sont perturbées
21 CMI E Test
22 Mise en route d une antibiothérapie Infection non documentée - Antibiothérapie probabiliste Elle se base sur : - le site infectieux et les principales espèces bactériennes pouvant être responsables - les antécédents infectieux du patient - l'écologie du service si le patient est hospitalisé - le spectre des antibiotiques ( AMM, Vidal) * Espèces habituellement sensibles : * Espèces modérément sensibles : * Espèces résistantes - mise à jour régulière du spectre : évolution de la résistance -Des règles de consensus sont établies pour certaines infections : * site SPILF
23 Site SPILF : Conférences de consensus téléchargeable
24 Spectre des antibiotiques Déterminé sur un grand nombre de souches, Histogramme des valeurs de CMI, Détermination des CMI50 et CMI90, CMI 50 : la plus petite concentration d'atb permettant d'inhiber la croissance de 50% des souches d'une espèce bactérienne marqueur de la sensibilité naturelle d'une espèce à un ATB CMI90 : La plus petite concentration d'atb permettant d'inhiber la croissance de 90% des souches d'une espèce bactérienne marqueur de la résistance r acquise à un ATB par une espèce bactérienne
25 Spectre des antibiotiques Listing de bactéries /3 classes 3 Classes : dans le Vidal pharmacodynamie * Espèces habituellement sensibles : plus de 90% des souches sont sensibles * Espèces modérément sensibles : plus de 90% des souches se situent dans la zone intermédiaire * Espèces résistantes au moins 50% des souches sont résistantes * Espèces inconstamment sensibles : la fréquence de résistance s échelonne entre 10 et 50% et est mentionnée dans le vidal
26 Espèces habituellement sensibles Espèces modéremment sensibles Espèces résistantes
27 Appréciation de l activité bactéricide des antibiotiques seuls ou associés Techniques sont basées sur des dénombrements des bactéries sur inoculum de départ et après mise en contact avec une solution d antibiotique ou une association d antibiotiques au bout de 18 heures, en temps fixe CMB en cinétique, en temps variable Courbes de bactéricidie pour les associations : Courbes de bactéricidie Techniques réservées à des laboratoires de recherche
28 Appréciation de l activité bactéricide des antibiotiques seuls ou associés Etablir des courbes de bactéricidie
29 Dosage des antibiotiques Adaptation des posologies contrôle de la toxicité : aminosides, glycopeptides contrôle de l efficacité en comparaison aux CMI Prélèvement : sur tube sec moment du prélèvement au pic : 15 minutes si voie IV 1 heure si voie IM 3 heures si per os à la vallée Prescription fréquente pour glycopeptides et aminosides
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