Méthode d'analyse. Méthode de dosage du Tocophérol dans les chaussettes hydratantes KINDY REDACTEUR VERSION EN COURS. Nom Fonction Date Signature
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- Paule Trudeau
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1 Méthode de dosage du Tocophérol dans les chaussettes hydratantes KINDY Objet: Méthode de quantification de l'alpha- Tocophérol dans les chaussettes hydratantes KINDY. Méthode applicable au dosage T0 et à la cinétique de relargage dans l'huile. Domaine d'application: Laboratoire Contrôle Qualité REDACTEUR VERSION EN COURS Nom Fonction Date Signature Aurélie Sabathier Technicienne de laboratoire 01/08/11 APPROBATION VERSION EN COURS Nom Fonction Date Signature Alain Caparros Resp Contrôle Q. 01/08/11 Jean-Pierre Lautier Resp. Qualité 01/08/11 Cyril Calestroupat Ingénieur analyste 01/08/11 EVOLUTION Indice Date d'application Pages modifiées 1 01/08/11 néant Création Motifs & modifications MOPE LABO /11 Indice : 1 "La version électronique ou figurant dans un point documentaire officiel de ce document sont les seules faisant foi. Toute version imprimée du présent document n est produite que pour des raisons pratiques et est considérée comme non maîtrisée." MOPE LABO /11 1/6 Indice : 1
2 - Le dosage du tocophérol est applicable à toutes les productions - La cinétique de relargage ne sera effectuée que sur les trois premières productions et en cas de litiges avec un client. 1. REACTIFS ET EQUIPEMENT - Alpha-Tocophérol : Ref. T G, SIGMA - Ethanol anhydre : Ref. PCET P, ICS ou équivalent - Huile d'olive raffinée conforme à la Ph. Eur. en vigueur, OLVEA - Seringue de 6ml : Ref. MA-S05CE, ICS ou équivalent - Filtre PTFE 0,45µm : Ref. FI-FISE-PT2545X, ICS ou équivalent - Flacon à col large en verre brun de 125ml : Ref , VWR ou équivalent - Chaîne HPLC de marque ICS ou équivalent comprenant : - Pompe modèle 2250 ICS - Passeur automatique - Détecteur spectophotomètre UV LAMBDA 1010 ICS - Logiciel HPLC Normasoft - Balance de marque Sartorius ou équivalent Modèle : LE244S N de série : N de métrologie : BLCE CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES : Colonne : Prontosil C8 (150 x 4,6mm) Phase mobile : Méthanol / Eau (98/2) Volume injecté : 5µl Longueur d'onde : 280nm Débit : 1,2ml/min Durée de l'analyse : 12min Température colonne : Température ambiante MOPE LABO /11 2/6 Indice : 1
3 1 METHODE DE QUANTIFICATION DU TOCOPHEROL 1.1 Préparations des solutions : Préparation des solutions témoins : Préparer une solution mère à 500mg/l. Par exemple, peser exactement environ 50mg de Alpha- Tocophérol (de Pureté connue T(%)) dans une fiole de 100ml. Compléter la fiole au trait de jauge avec de l'éthanol. Disperser aux ultrasons 10min. Solution témoin à 100mg/l : Introduire 10,0ml de solution mère dans une fiole de 50ml. Compléter au trait de jauge avec de l'éthanol. Un blanc d'éthanol sera injecté en début et fin d'analyse. La solution témoin sera injectée 3 fois en début, 1 fois en fin d'analyse et toutes les 6 injections. Préparation des solutions essais : Réaliser la pesée de 20 nappes de pions non enduites sur textile et en faire la moyenne. Cette masse moyenne sera utilisée dans les calculs. - Dans le cas de nappes de pions de 13cm de long : Découper un rectangle de 13,5 x 6cm de tissu comprenant une nappe de pions entière. Découper la totalité du textile + nappe de pions et les introduire dans une fiole de 200ml. Remplir la moitié de la fiole avec de l'éthanol et disperser aux ultrasons pendant 15min. Ajuster au trait de jauge avec l'éthanol et mettre sous agitation pendant 4h à température ambiante. Filtrer la solution sur filtre PTFE 0,45µm avant la mis en vial. - Dans le cas de nappes de pions de 7,6cm de long : Découper un rectangle de 8,5 x 6cm de tissu comprenant une nappe de pions entière. Découper la totalité du textile + nappe de pions et les introduire dans une fiole de 100ml. Remplir la moitié de la fiole avec de l'éthanol et disperser aux ultrasons pendant 15min. Ajuster au trait de jauge avec l'éthanol et mettre sous agitation pendant 4h à température ambiante. Filtrer la solution sur filtre PTFE 0,45µm avant la mis en vial. Préparer 2 solutions essais par échantillon et les injecter 2 fois chacune. 1.2 Calculs La détermination de la teneur en alpha-tocophérol dans la nappe de pions enduite est effectuée avec la formule suivante : V ech S ech x C std Teneur en alpha-tocophérol (%) = x x 100 S std M x 1000 Avec : S ech : Surface du pic d'alpha-tocophérol présent dans le chromatogramme essai S std : Surface du pic d'alpha-tocophérol présent dans le chromatogramme témoin C std : Concentration en alpha-tocophérol de la solution témoin (mg/l) MOPE LABO /11 3/6 Indice : 1
4 V ech : Volume de solution échantillon (L) M : Masse moyenne de 20 nappes de pions non enduites (g) 2 CINETIQUE DE RELARGAGE DU TOCOPHEROL DANS L'HUILE D'OLIVE 2.1 Protocole : Découper un rectangle de 13,5 x 6cm de tissu comprenant une nappe de pions entière. Dans un flacon en verre brun fermé de 125ml contenant 120ml d'huile d'olive, introduire une nappe de pions enduites sur textile puis mettre sous agitation magnétique à 250tr/min. Prévoir 2 nappes de pions enduites par point de prélèvement soit 6 nappes de pions enduites. Prélèvements : Les prélèvements seront effectués après 7h, 24h et 72h dans l'huile. A chaque point de prélèvement, l'huile est vidée et la nappe de pions enduite est essuyée, rincée à l'éthanol puis essuyée à nouveau. 2.2 Dosage du tocophérol libéré : Conditions chromatographiques : Voir paragraphe 2 Préparation des solutions témoins : Préparer une solution mère à 500mg/l. Par exemple, peser exactement environ 50mg de Alpha- Tocophérol (de Pureté connue T(%)) dans une fiole de 100ml. Compléter la fiole au trait de jauge avec de l'éthanol. Disperser aux ultrasons 10min. Préparer les témoins selon le tableau suivant : Volume à prélever Volume d'éthanol Concentration (mg/l) T100 10ml SM Qsp 50ml 100 T50 10ml SM Qsp 100ml 50 T25 5ml SM Qsp 100ml 25 T10 2ml SM Qsp 100ml 10 Un blanc d'éthanol sera injecté en début et fin d'analyse. Les 4 points de gamme seront injectés 2 fois et le témoin T100 sera injecté 1 fois en fin d'analyse et toutes les 6 injections. MOPE LABO /11 4/6 Indice : 1
5 Préparation des solutions essais : Découper la totalité du textile + nappe de pions et les introduire dans une fiole de 200ml. Remplir la moitié de la fiole avec de l'éthanol et disperser aux ultrasons pendant 15min. Ajuster au trait de jauge avec l'éthanol et mettre sous agitation pendant 4h à température ambiante. Filtrer la solution sur filtre PTFE 0,45µm avant la mise en vial. Préparer 2 solutions essais par échantillon et les injecter 2 fois chacune. 2.3 Calculs A partir de la gamme d'étalonnage, établir une courbe de calibration avec en abscisses les concentrations en mg/l et en ordonnées les surfaces obtenues pour chaque témoin. En déduire la droite de régression de type y=ax+b et déterminer la concentration (mg/l) en alpha-tocophérol restant dans la nappe de pions. A chaque prélèvement, la détermination de la teneur en alpha-tocophérol restant dans la nappe de pions est effectuée avec la formule suivante : V ech Teneur en tocophérol restant (%) = C ech x x 100 M x 1000 Avec : C ech : Concentration en alpha-tocophérol de la solution échantillon (mg/l) V ech : Volume de solution échantillon (L) M : Masse moyenne de 20 nappes de pions non enduite (g) Détermination du pourcentage d'alpha-tocophérol libéré à chaque temps t : Teneur en tocophérol restant % tocophérol libéré = x 100 Teneur en tocophérol obtenu par le dosage T0 Un graphique est représenté avec pour abscisses les temps de dissolution et ordonnées le pourcentage (m/m) de alpha-tocophérol libéré. MOPE LABO /11 5/6 Indice : 1
6 Le graphe ci-dessous représente la cinétique de relargage de la formule CKH Lot2 : Cinétique de relargage du tocophérol des nappes de pions enduites % alpha-tocophérol libéré % relargué Temps (h) 3 REFERENCE La validation de cette méthode est enregistrée sur le réseau et son chemin d'accès est le suivant : \\express5800\donnees\laboratoire de controle\validations\validations METHODES\Validations\Tocophérol-HPLC-Chaussettes Kindy Cette validation comprend une linéarité témoin, une exactitude et une répétabilité. MOPE LABO /11 6/6 Indice : 1
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