Etude des interactions du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) et de biomimétiques des héparanes sulfates, les RGTA (ReGeneraTing Agents).

Transcription

1 UNIVERSITE PARIS XII-VAL DE MARNE U.F.R. DE SCIENCES THESE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L UNIVERSITE PARIS XII-VAL DE MARNE Discipline : Biochimie, Biologie cellulaire et moléculaire Présentée et soutenue publiquement par Vincent ROUET le 09 juillet 2004 Etude des interactions du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) et de biomimétiques des héparanes sulfates, les RGTA (ReGeneraTing Agents). Directeur de thèse : Jean-Pierre CARUELLE JURY Rapporteurs : Examinateurs : Michel CREPIN Jean PLOUET Jean-Pierre CARUELLE José COURTY Pascal DESGRANGES

2 REMERCIEMENTS En premier lieu, je tiens à remercier Monsieur le professeur Michel CREPIN et Monsieur le Docteur Jean PLOUET d avoir accepté d être rapporteurs de cette thèse. Je tiens également à remercier Monsieur le docteur Pascal DESGRANGES d avoir accepté d examiner ce travail. J exprime ma sincère gratitude à Monsieur le professeur Denis BARRITAULT pour m avoir accueilli dans son laboratoire. Mes plus sincères remerciements et ma plus grande reconnaissance à Monsieur le professeur Jean-Pierre CARUELLE et à Monsieur le docteur José COURTY pour m avoir aidé tout au long de ces années et dirigé ce travail. Je tiens à les remercier pour leur disponibilité, leur aide et leur gentillesse. Je tiens à remercier tous les membres du laboratoire CRRET pour leur collaboration scientifique, et notamment Dulce PAPY pour son aide et son soutien à travers de nombreuses discussions. Je souhaiterais tout particulièrement remercier Alban VIGNAUD, mon alter ego physiologiste. Qu il trouve dans ces remerciements l expression de ma sincère amitié. Je tiens également à remercier Christophe HOURDE, Isabelle BERNARD-PIERROT et Marie-Emmanuelle KERROS pour les nombreuses discussions, scientifiques ou non, que nous avons pu avoir. Mes remerciements à Yamina HAMMA-KOURBALI, Danièle CARUELLE, Jean DELBE, Dominique LEDOUX, Emmanuel PETIT, Véronique CHASSEFIERE, Arnaud FERRY, Stéphanie GARCIA, Juliette PELTZER, Cécile RIFFET, Christophe MORIN et tous les autres pour leur contribution scientifique à ce travail. Je tiens enfin à remercier mes parents qui m ont toujours encouragé et soutenu pendant toutes mes études. Un grand merci à Catherine, Damien et Thaïs, mes grands-parents. Je souhaiterais également remercier Mélodie et Cyril, Edith et Hervé, Natacha et Alex, Vanessa et Nasredine, Manu pour les encouragements et le soutien qu ils m ont apporté. Enfin, je souhaite remercier tous mes amis instit et les membres de l US Créteil Volley pour avoir été présents durant ces dernières années.

3 A Fanny, Tu seras toujours présente parmi nous. A mes parents,

4 TABLE DES MATIERES INTRODUCTION...6 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE...11 L ANGIOGENESE La vasculogenèse I. La vasculogenèse embryonnaire II. La vasculogenèse chez l adulte Angiogenèse I. Angiogenèse physiologique II. Angiogenèse pathologique III. Les types d angiogenèse IV. Remodelage et maturation du réseau vasculaire V. Le recrutement des cellules murales Les facteurs impliqués dans l angiogenèse I. L HARP et la MK II. Les FGF III. Le VEGF IV. Les autres facteurs à activité angiogène Régulation de l angiogenèse I. L hypoxie II. Les facteurs de croissance III. La mobilisation des facteurs de croissance de la MEC IV. Le recrutement des cellules murales L angiogenèse musculaire I. L angiogenèse induite dans un muscle squelettique intact II. L angiogenèse au cours de la régénération musculaire III. Expression du VEGF dans le muscle Angiogenèse et thérapie I. Thérapie pro-angiogène II. Thérapie anti-angiogène LES GLYCOSAMINOGLYCANNES DES PROTEOGLYCANNES Les héparanes sulfates (HS) I. Aspects structuraux des GAG II. Aspects fonctionnels de l héparine et des héparanes sulfates Implication de la matrice extracellulaire dans l angiogenèse I. Implication des protéines matricielles au cours de l angiogenèse II. Les héparanes sulfates endothéliaux III. Implications pathologiques des héparanes sulfates endothéliaux Les RGTA : mimétiques de l héparine et/ou des héparanes sulfates I. Origine des RGTA

5 II. Propriétés des RGTA et hypothèses sur leurs mécanismes d action III. La chimie des RGTA IV. RGTA, régénération musculaire et angiogenèse OBJECTIFS DU TRAVAIL...92 MATERIEL ET METHODES...94 MATERIEL...95 METHODES...96 RESULTATS DISCUSSION ET PERSPECTIVES CONCLUSION TABLE DES ILLUSTRATIONS REFERENCES

6 ABREVIATIONS 3

7 aa ADN ahif ALK AP-1 Ang ARE ARNm ARNT ATIII BCA BMEC BSA CAM CML CRS CRS-BP CTGF CSF CSH DAG DSS EDL EGF enos EPO ERK FDA FGF FGFR GAG G-CSF GM-CSF GPI HBGF HIF HIT HSPG I-CAM IAP Ig-like IM INOS acide aminé acide désoxyribonucléique antisens HIF anaplastic lymphoma kinase activator protein-1 angiopoïétine adenylate and uridylate-rich elements acide ribonucléique messager aryl receptor nuclear translocator antithrombine III bone marrow endothelial cell bovin serum albumin chorio-allantoïde membrane cellules musculaires lisses cell-retention sequence CRS-binding protein facteur de croissance du tissu conjonctif colony stimulating factor cellule souche hématopoïétique diacylglycérol dextran sodium sulfate Extensor Digitorum Longus epithelial growth factor NO synthase endothéliale érythropoïétine extracellular signal-regulated kinase food and drug administration fibroblast growth factor récepteur au FGF glycosaminoglycannes granulocyte colony stimulating factor granulocyte-macrophage colony stimulating factor glycosylphosphatidylinositol heparin binding growth factor hypoxia-inducible factor thrombocytopénie induite par l héparine protéoglycanne à héparanes sulfates intracellular adhesion molecule inhibitor apoptotic protein immunoglobulin-like intramusculaire NO synthase inductible IP3 inositol 1,4,5-triphosphate IV intraveineux JNK c-jun N-terminal protein kinase Kd constante de dissociation KO knock out MAPC multipotent adult progenitor cells MAPK mitogen activated protein kinase MEC matrice extracellulaire MMP matrix metalloproteases MT-MMP membrane type - matrix metalloprotease NFAT nuclear factor of activated T- cells NK natural killer NLS nuclear localisation sequence nnos NO synthase neuronale NO oxyde nitrique NP neuropiline PAI inhibiteurs de l activateur du plasminogène PEC progéniteurs endothéliaux circulants PET polyéthlylène téréphtalate PDGF platelet derived growth factor PG protéoglycanne PGI 2 prostacycline PI3K phosphatidylinositol-3-kinase PLC phospholipase C PLD phospholipase D PlGF placental growth factor RGTA regenerating agents ROS reactive oxygen species SCF stem cell factor SDF stromal cell-derived factor SDS sodium dodecyl sulfate Sp specificity protein 1 Stat signal transducers and activators of transcription svegfr-1 VEGFR-1 soluble TGFβ 1 transforming growth factor β1 Tie-2 tyrosine kinase with immunoglobin and epidermal growth factor homologie domain TIMP tissue inhibitor of matrix metalloproteases TNFα tumor necrosis factor α TPO thrompoïétine 4

8 tpa TSR upa V-CAM VEGF VEGFR VHL VRAP XIAP 2M2B activateur tissulaire du plasminogène thrombospondin region activateur urokinase du plasminogène vascular-cell adhesion molecule vascular endothelial growth factor vascular endothelial growth factor receptor Von Hippel-Lindau VEGFR-associated protein X chromosome-linked IAP 2-méthyle 2-butène 5

9 INTRODUCTION 6

10 Analogie entre l arbre botanique et l arbre vasculaire. (tiré de Léonard de Vinci, Anatomie de l homme : le système vasculaire, 1508)

11 Le travail présenté dans ce mémoire concerne l étude des effets sur l angiogenèse de mimétiques de synthèse des glycosaminoglycannes (GAG). Les GAG sont des polysaccharides linéaires constitués de disaccharides plus ou moins sulfatés. Les mimétiques présentés sont appelés RGTA (ReGeneraTing Agents) en raison de leur capacité à améliorer les processus de réparation de nombreux tissus dans lesquels l angiogenèse est un phénomène transitoire indispensable. L angiogenèse consiste en la formation d un réseau vasculaire fonctionnel qui s exprime au cours de l embryogenèse ou chez l adulte, naturellement dans certains tissus comme l utérus ou accidentellement après une blessure lors de la cicatrisation. Ainsi, l ischémie du muscle squelettique provoque une dégénérescence tissulaire qui va stimuler les cellules à générer des signaux de survie par l expression de facteurs de croissance. L afflux de cellules inflammatoires nécessaires au nettoyage du tissu nécrosé participe également à l apport et à l activation de facteurs de croissance qui sont à la fois impliqués dans la néovascularisation et dans la régénération du tissu. Il est maintenant reconnu que la matrice extracellulaire participe à la réparation tissulaire aussi bien comme inducteur physique que par sa capacité à stocker les facteurs de croissance et à réguler leur biodisponibilité. En effet, la composition de la matrice extracellulaire est impliquée dans la croissance des cellules spécifiques d un tissu lésé mais également dans le développement des cellules endothéliales en cours de prolifération, de migration et de différenciation qui vont aboutir à l établissement d un réseau vasculaire capable d assumer les fonctions de nutrition et de régulation physiologique d un tissu. La matrice extracellulaire est principalement composée de collagènes, d élastine, de glycoprotéines et de protéoglycannes. Ces derniers constituants, à l exception de l acide hyaluronique, comportent un corps protéique sur lequel sont greffées une ou plusieurs chaînes de GAG. Ces GAG possèdent de nombreuses fonctions parmi lesquelles des rôles dans la régulation de l activité des facteurs de croissance. Les GAG peuvent en effet séquestrer les facteurs de croissance au sein de la matrice extracellulaire ou à la surface des cellules et assurer leur libération au cours des processus de réparation survenant à la suite de lésions durant lesquelles les constituants de la matrice extracellulaire et notamment les GAG vont être dégradés. Les facteurs de croissance deviendront ainsi disponibles pour assurer les fonctions biologiques nécessaires aux processus de réparation tissulaire. Si les facteurs de croissance jouent un rôle dans la migration, la prolifération cellulaire et la reconstitution d un nouveau tissu, ils peuvent être également impliqués dans la survie des cellules d un tissu lésé. 7

12 Le Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) est un facteur de croissance spécifique de la survie et de la croissance d un réseau vasculaire. C est un facteur essentiel de l angiogenèse, notamment par le mode de régulation de son expression qui met en cause la teneur en oxygène des tissus. Dès que le tissu se trouve en condition d hypoxie, comme c est le cas à la suite d une blessure, l expression de VEGF est augmentée. Le VEGF va stimuler la survie et la croissance des cellules endothéliales pour reconstituer un réseau vasculaire. Ce travail s est plus particulièrement intéressé à l étude des interactions entre les RGTA et le VEGF afin de mieux préciser les mécanismes de régulation de ces mimétiques des GAG dans l angiogenèse. Les RGTA sont des mimétiques structuraux et fonctionnels des GAG et plus spécifiquement des héparanes sulfates (HS). Ils sont obtenus par synthèse chimique et sont sélectionnés sur les effets protecteurs et/ou potentialisateurs similaires à ceux qu exerce l héparine vis-à-vis des Fibroblast Growth Factor (FGF) (Yayon et col., 1991). A l inverse, ils présentent une activité anticoagulante beaucoup plus faible que celle de l héparine, ce qui autorise leur administration chez l animal. Ils ont été nommés RGTA pour ReGeneraTing Agents en raison de leurs effets stimulateurs in vivo sur les processus de régénération et de cicatrisation de nombreux tissus comme la cicatrisation cutanée (Meddahi et col., 1994), la réparation de l os crânien (Blanquaert et col., 1995), la régénération et la réinnervation des muscles striés squelettiques lents et rapides (Aamiri et col., 1995; Gautron et col., 1995), la résistance à l étirement mécanique d anastomoses coliques (Meddahi et col., 1996). Présentant des effets bénéfiques dans le traitement des ulcères digestifs (Meddahi et col., 2002), ils exercent un effet protecteur vis-à-vis des ischémies musculaires (Desgranges et col., 1999) et protègent le muscle cardiaque infarcié (Yamauchi et col., 2000). Parallèlement, les RGTA modulent in vitro la prolifération cellulaire et la biosynthèse de molécules matricielles (Mestries et col., 1998), la prolifération cellulaire induite par les FGF, la protection et la dimérisation des FGF (Tardieu et col., 1992). L ensemble de ces observations conduit à envisager que les RGTA pourraient agir comme des régulateurs de l homéostasie tissulaire et cellulaire, probablement en modulant les activités des facteurs de croissance naturellement libérés au sein des lésions tissulaires. 8

13 Mon travail de thèse s est intéressé aux facteurs de croissance présentant une affinité pour l héparine et les GAG. Dans un premier temps, j ai participé à la validation fonctionnelle d une nouvelle technique de synthèse non-dégradante des RGTA. Mon travail s est ensuite intéressé à préciser certains des mécanismes par lesquels les RGTA pouvaient moduler l activité des facteurs ayant une affinité pour l héparine (HBGF pour heparin-binding Growth Factor) et plus particulièrement l angiogenèse en abordant les interactions de ces mimétiques vis-à-vis du VEGF dans des modèles in vitro et in vivo. Des travaux antérieurs réalisés dans un modèle d ischémie musculaire chez le rat (Desgranges et col., 1999), le porc (Yamauchi et col., 2000) ou le mouton (Zakine et col., 2003) ont démontré que l injection de RGTA induisait non seulement une régénération musculaire accélérée associée à une stimulation de l angiogenèse et à des effets antifibrotiques. Tout d abord, j ai étudié les relations structure/fonction au niveau des capacités d interactions de différents RGTA et de leurs intermédiaires de synthèse avec le VEGF. Les interactions de différents RGTA avec le VEGF ont été déterminées ainsi que leur capacité à augmenter la fixation du VEGF à ses récepteurs de haute affinité (VEFGR-1 et -2 pour vascular endothelial growth factor receptor, NP pour neuropiline) et à induire une activité biologique. Ensuite, la potentialisation des activités biologiques du VEGF telles que l induction de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales (CE) a été mise en évidence à la fois in vitro et ex vivo. Enfin, l effet des RGTA sur l évolution de l expression de différents marqueurs de l angiogenèse au cours du temps a été étudié dans le modèle de l ischémie du muscle squelettique chez le rat. Dans un dernier volet, j ai également participé à la mise en évidence de la formation d un effet dominant négatif du peptide correspondant aux 25 derniers acides aminés de la partie C-terminale du facteur HARP. HARP (pour Heparin Affin Regulatory Peptide) est un facteur de croissance décrit par Courty et col. en 1988 qui se caractérise par sa forte affinité pour l héparine (Courty et col., 1991). Ce facteur présente des effets angiogènes in vitro et in vivo. Ce travail a montré que le peptide P exprime une activité inhibitrice sur la 9

14 croissance tumorale et l angiogenèse associée en complexant le récepteur ALK, récepteur de haute affinité pour HARP. 10

15 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE 11

16 Un vaisseau sanguin conserve ou remodèle sa structure grâce à un équilibre précis entre de nombreux agents pro- et anti-angiogènes. Ces agents incluent des facteurs de croissance et leurs récepteurs, des facteurs de transcription et leurs gènes cibles, des protéines de la matrice extracellulaire, des enzymes, etc. La préservation de l intégrité vasculaire nécessite un contrôle strict de l équilibre entre différents mécanismes régulés par ces agents : la perméabilité des vaisseaux, la prolifération, l apoptose et la migration des CE et la stabilité de la matrice extracellulaire. La revue bibliographique de ce mémoire s attachera à préciser les mécanismes cellulaires et moléculaires de l angiogenèse puis déterminera l importance des HS au cours de ce phénomène et l effet de molécules mimétiques des HS dans ce processus. 12

17 Le système cardiovasculaire permet le transport du sang et de la lymphe à travers l organisme. Il est composé de quatre constituants : le cœur, la macrocirculation, la microcirculation et le système vasculaire lymphatique. La macrocirculation comprend les vaisseaux sanguins artériels et veineux visibles à l œil nu. Ils approvisionnent et drainent un réseau de fins vaisseaux sanguins, les capillaires. Par des mécanismes de transsudation capillaire, l eau et les constituants du plasma forment le liquide interstitiel qui réintègre la circulation par le système vasculaire lymphatique. Tous les vaisseaux sanguins et lymphatiques sont tapissés par un endothélium, constitué d une couche unique de cellules endothéliales ou CE. L endothélium est un élément essentiel de la paroi vasculaire. Constitué de cellules, il recouvre une surface de 7 m 2 chez l homme adulte. Les CE forment une interface entre le milieu sanguin et les tissus environnants. Elles régulent l apport des substances nécessaires au métabolisme des différents tissus et l élimination des déchets qui en découle. L endothélium participe à de nombreux processus physiologiques tels que l hémostase, l inflammation et l angiogenèse. La taille des CE varie de 25 à 50 µm de long sur 10 à 15 µm de large. Les cellules s orientent selon un axe parallèle à celui du courant sanguin. Les CE tapissant les vaisseaux ont quelques nanomètres d épaisseur et possèdent un noyau qui saillit du côté de la lumière vasculaire (Figure 1). Elles contiennent tout l équipement en organites (mitochondries, lysosomes, réticulum endoplasmique, granules de sécrétion, etc.) qui permet la synthèse, la conservation et la sécrétion de substances biologiques actives. Les CE sont caractérisées par la présence de corps de Weibel-Palade, corpuscules contenant le facteur de von Willebrand, spécifique des CE. Le diamètre de l ensemble des capillaires trois fois plus grand que le diamètre de l aorte implique une pression sanguine et un flux sanguin diminués. Ces facteurs ajoutés à la grande surface d échange des CE au sein des capillaires, facilitent les fonctions des capillaires : l approvisionnement en nutriments et en oxygène des tissus environnants et l élimination des déchets métaboliques ainsi que le dioxyde de carbone. Ces fonctions sont facilitées par une organisation simple des capillaires. La structure générale des vaisseaux sanguins comporte trois tuniques qui sont l intima composée de l endothélium et de sa lame basale, la media composée de cellules musculaires lisses et l adventice formée de tissu conjonctif (Figure 2). 13

18 Figure 1. Morphologie d une cellule endothéliale. (tiré de Figure 2. Structure d un vaisseau sanguin. (tiré de

19 Dans le cas des capillaires, l endothélium est uniquement recouvert d une lame basale et d une couche incomplète de péricytes. Il existe trois types de capillaires qui assurent une adéquation entre la perméabilité capillaire et les besoins physiologiques des tissus irrigués (Figure 3). Les capillaires continus sont formés d un endothélium et d une lame basale ininterrompus alors que les capillaires fenestrés possèdent des ouvertures au sein de l endothélium appelées fenestrations. Les capillaires discontinus sont fenestrés au niveau de l endothélium et de la lame basale. La néo-vascularisation consiste en la formation d un nouveau réseau vasculaire. Ce terme s applique à la fois aux processus de la vasculogenèse et de l angiogenèse. 14

20 Figure 3. Représentation schématique des différents types de capillaires : continus, fenestrés et discontinus. (tiré de

21 L angiogenèse L angiogenèse est le processus biologique par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins peuvent se former à partir des vaisseaux préexistants (Figure 4). Dans les phases précoces du développement embryonnaire, les premières CE se développent à partir de cellules souches progénitrices, les angioblastes (Risau and Flamme, 1995). Ce phénomène constitue la vasculogenèse. À partir des premiers vaisseaux sanguins ainsi formés, de nouveaux tubes capillaires peuvent se développer. Angiogenèse et vasculogenèse vont se dérouler concomitamment au cours du développement embryonnaire (Figure 5). Au sein d un organisme adulte, le système vasculaire est quiescent. Il n y a pas de processus actif de néo-vascularisation hormis au cours de quelques processus biologiques liés essentiellement à la reproduction chez la femme au cours de l ovulation, de la formation du corps jaune, des menstruations et de l implantation embryonnaire. La néo-vascularisation est également activée lors de processus physiologiques comme la réparation tissulaire ou au cours de pathologies telles que la croissance de tumeurs solides, la rétinopathie vasoproliférative chez le diabétique ou la polyarthrite rhumatoïde. Chez l adulte, ces nouveaux vaisseaux sanguins se forment à partir de capillaires préexistants. Toutefois, de nouveaux tubes vasculaires peuvent se développer par vasculogenèse même chez l adulte par la mobilisation d angioblastes de la moelle osseuse. 15

22 Figure 4. Représentation schématique de CE quiescentes et activées. Les CE activées sont caractérisées par une activité prolifératrice et migratrice, nécessitant la dégradation de la membrane basale. (tiré de

23 Figure 5. Représentation schématique des processus de vasculogenèse et d angiogenèse au cours du développement embryonnaire. Les angioblastes (a) migrent au niveau du mésoderme latéral du sac vitellin en formant des îlots sanguins. Les cellules situées en périphérie de ces îlots sanguins se différencient en CE primitives et les cellules internes forment les premières cellules hématopoïétiques (b). Le réseau vasculaire primitif se développe ensuite par angiogenèse (c). (tiré de Hendrix et al, Nature Reviews Cancer, 2003)

24 1. La vasculogenèse I. La vasculogenèse embryonnaire La vasculogenèse embryonnaire consiste en la détermination et la différenciation des cellules hémangioblastiques puis leur assemblage en un réseau vasculaire primitif (Risau and Flamme, 1995). Très précocement, ces cellules progénitrices migrent et se différencient pour former des amas cellulaires appelés îlots sanguins au niveau du mésoderme latéral du sac vitellin (Figure 6). Les cellules périphériques de ces îlots se différencient en CE alors que les cellules internes forment les cellules hématopoïétiques (Kessel and Fabian, 1986). Le raccordement des CE des îlots sanguins voisins permet la création d un réseau vasculaire primitif constitué de tubes endothéliaux (Hirakow and Hiruma, 1981). Après la formation de la vasculature du sac vitellin, des précurseurs angioblastiques migrent et forment des amas cellulaires qui donneront naissance à l aorte dorsale, aux veines cardinales et aux tubes endocardiques (Lanot, 1980; Hirakow and Hiruma, 1981; Hirakow and Hiruma, 1983; Pardanaud et col., 1987). Un petit nombre de cellules progénitrices migrent ensuite dans les différents sites de l hématopoïèse (foie, rate et moelle osseuse) pour donner naissance aux cellules hématopoïétiques définitives (Dieterlen-Lievre et col., 1988; Olah et col., 1988; Pardanaud and Dieterlen-Lievre, 1993). Après la perfusion du réseau vasculaire par les battements cardiaques, les cellules sanguines issues des îlots sanguins entrent en circulation et sont progressivement remplacées par les cellules sanguines définitives. L origine commune des cellules hématopoïétiques et des CE a été démontré par Eichman en 1997 (Eichmann et col., 1997). En effet, les cellules mésodermiques exprimant le VEGFR-2 isolées au moment de la gastrulation de l embryon d oiseau donnent naissance à une descendance de cellules hématopoïétiques ou endothéliales selon les conditions de culture utilisées. II. La vasculogenèse chez l adulte En 2002, l équipe de Jiang a purifié des cellules, appelées cellules adultes progénitrices mutipotentes (en anglais, MAPC pour multipotent adult progenitor cells), capables, sous stimulation in vitro par les cytokines appropriées, de se différencier un grand nombre de cellules somatiques des trois feuillets embryonnaires (Jiang et col., 2002). Par exemple, la stimulation par le VEGF permet en 14 jours à 90 % des MAPC de prendre le phénotype de 16

25 Figure 6. Représentation de la formation des îlots sanguins et de l établissement de la circulation sanguine primitive au cours de l embryogenèse. (tiré de

26 CE. In vivo, l injection de MAPC dans de jeunes blastocystes de souris a permis de montrer qu elles contribuaient à la formation de toutes les cellules somatiques. Enfin, ces cellules présentent un potentiel prolifératif important sans subir de sénescence ou perdre leurs propriétés de différenciation. Ainsi, l organisme adulte conserve la capacité de mobiliser des cellules souches très primitives comme c est le cas au cours de l embryogenèse. Au niveau vasculaire, ces cellules souches peuvent donc participer aux phénomènes de néovascularisation communément attribués à la seule angiogenèse. Ce processus de néovascularisation impliquant les cellules souches est appelé vasculogenèse post-natale. 1. Les cellules souches de la moelle osseuse Les cellules souches résident dans de nombreux sites au cours du développement embryonnaire pour se localiser, chez l adulte, dans la moelle osseuse (Lasky, 1996). La différenciation, le maintien et l expansion des cellules souches dans le microenvironnement de la moelle chez l adulte sont contrôlés par des facteurs de croissance, des cytokines et des chimiokines selon des mécanismes paracrine/autocrine et juxtacrine impliquant les cellules stromales et les cellules souches. Au sein de la moelle, les cellules forment un réseau continu dans lequel les cellules stromales sont intercalées avec les progéniteurs hémangioblastiques. Au sein de l organisme, la moelle osseuse constitue le principal réservoir de cellules souches telles que les cellules souches hématopoïétiques (CSH), les progéniteurs endothéliaux, neuronaux et les cellules souches musculaires (Blau et col., 2001). Les cellules souches les plus étudiées sont les CSH qui ont la capacité soit de proliférer soit d entrer en différenciation pour générer l ensemble des cellules sanguines (Cheshier et col., 1999). L isolation de ces cellules a été possible par l identification de molécules de surface telles que le CD34 (Fennie et col., 1995) et l AC133 (Yin et col., 1997). La transplantation d un nombre limité de CSH permet de réactiver l hématopoïèse chez des individus irradiés. Les principales cytokines impliquées dans l hématopoïèse sont le G-CSF, le GM-CSF, l EPO et le TPO. Le réseau vasculaire irriguant la moelle osseuse est composé d une simple couche de CE, appelées BMEC pour bone marrow endothelial cells, formant un réseau vasculaire dit sinusoïdal. Le passage des cellules souches à travers cet endothélium est appelé mobilisation. Pour cela, les cellules souches doivent reconnaître les BMEC par l intermédiaire de molécules d adhésion telles que les sélectines. Si le VEGFR-2 est indispensable au développement des CSH durant le développement embryonnaire, il semble également essentiel pour les CSH chez l adulte. Toutefois, la 17

27 surexpression du facteur de croissance placentaire, le PlGF, facteur de croissance spécifique du VEGFR-1, dans des cellules de moelle osseuse déficientes en VEGF suffit à la survie des CSH in vitro et à la reconstitution d une population de CSH in vivo. Cette activité provient d une boucle autocrine impliquant le VEGF et ses deux récepteurs (Gerber et col., 2002) 2. Les cellules endothéliales progénitrices Les cellules endothéliales progénitrices ont été initialement caractérisées par l expression de VEGFR-2 et de CD34. Le recrutement de ces cellules a été démontré dans de nombreux types de néovascularisation tels que la néoangiogenèse tumorale ou suite à des ischémies cardiaques de la patte et des blessures de la peau ou de la cornée (Asahara et col., 1999; Takahashi et col., 1999; Kalka et col., 2000; Schatteman et col., 2000; Grant et col., 2002). L intégration des cellules souches endothéliales progénitrices aux sites de néovascularisation implique le transit de ces cellules dans la circulation sanguine. Toutefois, la majorité de ces cellules réside dans la moelle osseuse avec les cellules souches hématopoïétiques au sein du stroma de la moelle osseuse, microenvironnement optimal pour l hématopoïèse. Plusieurs études ont suggéré que les cellules souches hématopoïétiques et les cellules stromales contribuent à la prolifération locale et à la migration des progéniteurs endothéliaux circulant à travers la barrière moelle osseuse/sang. En effet, les cellules souches hématopoïétiques sécrètent du VEGF, processus stimulé par les cytokines (Bautz et col., 2000). En retour, le VEGF peut induire l expression de facteurs de croissance hématopoïétiques, tels que le GM-CSF par les BMEC (Bautz et col., 2000) et la thrombopoïétine par les cellules stromales (Tordjman et col., 1999). Si le VEGF, en synergie avec l angiopoïétine-1 (Ang-1), stimule la survie des cellules progénitrices endothéliales, ces facteurs de croissance semblent également augmenter le recrutement de cellules de la moelle osseuse par expansion de la vasculature de la moelle osseuse (Hattori et col., 2001). 3. Les progéniteurs endothéliaux circulants Chez l adulte, des progéniteurs endothéliaux circulant (PEC) circulant dans le sang périphérique, capables de se différencier en CE in vitro et de contribuer à l angiogenèse in vivo, ont été isolés grâce à des billes magnétiques recouvertes d anticorps dirigés contre CD34 ou VEGFR-2 (Asahara et col., 1997). Ils forment in vitro des structures ressemblant à des capillaires sur la fibronectine ou le collagène. Les PEC sont capables de s intégrer in vivo 18

28 dans les parois des vaisseaux aux sites de néovascularisation dans un modèle de vascularisation au sein d un tissu de granulation induit expérimentalement (Crosby et col., 2000). Ils représentent 10 % de l ensemble des CE intégrées dans le réseau vasculaire alors que, dans un tissu sain, les PEC ne représentent que 0.2 à 1.4 % (Crosby et col., 2000). Ces PEC sont issus de la moelle osseuse et leur nombre dans la circulation augmente après administration de GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) (Takahashi et col., 1999). Les PEC sont recrutés et incorporés dans les sites de néovascularisation tels que la patte ou le myocarde ischémié, la cornée lésée, les plaies cutanées et la vasculature tumorale (Asahara et col., 1999; Kalka et col., 2000; Schatteman et col., 2000). De plus, les CE progénitrices sont impliquées dans l angiogenèse et la réendothélialisation d implants (Peichev et col., 2000). Chez l adulte sain, le nombre de PEC est de 2,6 par millilitre de sang (Solovey et col., 1997). Initialement identifiées et isolées par l expression de VEGFR-2 et de CD34, des antigènes spécifiques des angioblastes et des progéniteurs hématopoïétiques (Asahara et col., 1997), la moitié de ces cellules sont de nature microvasculaire par la présence du marqueur CD 36 (Solovey et col., 1997). Toutefois, ces cellules expriment également la VE-cadherine et la protéine AC133, spécifique des progéniteurs non-différenciés (Peichev et col., 2000). La forte capacité à proliférer distingue les PEC des CE intégrées dans les parois vasculaires (Lin et col., 2000). 4. Les progéniteurs des cellules musculaires lisses Récemment, la croissance de cellules musculaires lisses (CML) a été observée dans une culture de cellules mononucléées sanguines (Simper et col., 2002). Toutefois, des expériences antérieures avaient déjà présumé de l existence de progéniteurs des CML dans la circulation. En effet, suite à une transplantation cardiaque ou aortique, la plupart des CML des artères coronaires et de l aorte provenait du receveur. Toutefois, la proportion de CML dérivées de la moelle osseuse impliquées dans la ré-endothélialisation porte à controverse. Certaines études démontrent que 10 à 50 % des CML ont une origine circulante alors que d autres estiment cette proportion inférieure à 10 %. Il existe également des progéniteurs vasculaires parmi les cellules souches embryonnaires. Leur différenciation conduit à la formation à la fois de CE et de CML. Leur injection chez l adulte démontre également leur intégration dans la paroi à la fois sous forme de CE et de CML (Yurugi-Kobayashi et col., 2003). Ce type de cellules serait caractérisé par 19

29 l expression de c-kit et n appartient pas à la lignée des cellules souches hématopoïétiques (Lin-) (Orlic et col., 2001). 2. Angiogenèse L angiogenèse peut dans certaines conditions être activée chez l adulte. Tout d abord, elle permet la vascularisation d un tissu en cours de cicatrisation. D autre part, l angiogenèse peut être activée dans des conditions pathologiques qui vont déstabiliser l équilibre établi entre les facteurs angiogènes et anti-angiogènes comme, par exemple, durant le développement d une tumeur. I. Angiogenèse physiologique L angiogenèse physiologique apparaît au cours du cycle menstruel chez la femme, de l implantation embryonnaire et de la régénération tissulaire. 1. L angiogenèse au cours du cycle menstruel L endomètre est constitué d une couche de cellules épithéliales et d une matrice sousjacente composée principalement de fibroblastes. La croissance de cet organe est directement liée à la croissance du réseau vasculaire. Au cours de la première étape du cycle menstruel, les cellules de l endomètre sont en phase proliférative. L oestradiol stimule une forte expression du VEGF par les cellules épithéliales et les fibroblastes. Après l ovulation, le corps jaune sécrète de l oestradiol et de la progestérone et l expression du VEGF diminue dans les cellules stromales. Toutefois, l endomètre est infiltré par de nombreuses cellules inflammatoires qui sécrètent du VEGF et de l angiopoïétine. Au moment de la menstruation, les deux tiers de l endomètre sont éliminés par nécrose à la suite de l hypoxie. Cette hypoxie stimule l expression des facteurs angiogènes qui initient la reformation d un réseau vasculaire au début d un nouveau cycle menstruel (Figure 7). 2. L angiogenèse au cours de l implantation embryonnaire Un prérequis à l initiation de l implantation est l augmentation de la perméabilité vasculaire endométriale au site d apposition du blastocyste. Ce phénomène coïncide avec l attachement du trophectoderme du blastocyste à l épithélium luminal de l endomètre. Une décidualisation locale apparaît ensuite, concomitamment avec une apoptose de l épithélium luminal au site d implantation facilitant l invasion par le blastocyste de la membrane basale (Parr et col., 1987). Ces évènements induisent un remodelage de la matrice extracellulaire et l activation de l angiogenèse (Figure 7) (Schlafke and Enders, 1975). 20

30 Figure 7. Régulation de l angiogenèse au cours du cycle menstruel. (tiré de

31 3. L angiogenèse au cours de la régénération tissulaire Au cours de la réparation tissulaire, le caillot de fibrine, formé en cas d hémorragie, est progressivement remplacé par un tissu de granulation richement vascularisé. Ce tissu de granulation fait ensuite place à une matrice extracellulaire composée de collagène avec un réseau vasculaire moins important (Welch et col., 1990). La migration cellulaire et le développement de tubes capillaires sont dépendants de la production et de l organisation des composants de la matrice extracellulaire tels que la fibronectine, le collagène, la vitronectine, la tenascine et la laminine à la fois dans le tissu de granulation et la membrane basale des CE. La matrice extracellulaire est importante en tant que support physique pour la croissance des CE, en tant que réservoir pour de nombreux facteurs de croissance liant l héparine et en tant que modulateur de la signalisation intracellulaire en modulant la progression dans le cycle cellulaire et la morphologie cellulaire. En effet, les CE ensemencées sur un gel de collagène prolifèrent et migrent, avec un dépôt irrégulier et discontinu de protéines de la membrane basale telles que la laminine et le collagène IV, caractéristique d une phase proliférative précoce de l angiogenèse. Lorsque les CE sont mises en culture sur un gel en 3D la prolifération cellulaire est inhibée et les CE se différencient en formant des structures pseudotubulaires. L expression du PDGF, détectable au cours de la prolifération des CE, est perdue et le dépôt de collagène IV et de laminine est continu. Ce phénotype se rapproche de celui d un endothélium quiescent au cours des étapes tardives de l angiogenèse. II. Angiogenèse pathologique 1. L angiogenèse tumorale Les tumeurs sont caractérisées par la forte induction de l expression de facteurs de croissance. La surexpression de VEGF permet d augmenter la perméabilité vasculaire en provoquant la formation d un gel extravasculaire de fibrine, substrat de la croissance tumorale (Dvorak et col., 1987). Le TNFα augmente l expression à la fois du VEGF (Ryuto et col., 1996) et du FGF-2 (Okamura et col., 1991). Cette régulation doit entraîner dans la tumeur une boucle paracrine d induction de la néo-vascularisation (Figure 8). Les vaisseaux qui irriguent les tumeurs présentent des caractéristiques structurales et fonctionnelles différentes de celles de vaisseaux normaux. La membrane basale qui les entoure est interrompue ou absente et les CE sont parfois manquantes. Ces caractéristiques sont également impliquées dans l augmentation de la perméabilité vasculaire citée précédemment. La vascularisation au sein des tumeurs présente des ramifications tortueuses qui rappellent la morphologie des 21

32 Figure 8. Régulation de l angiogenèse au cours de la croissance tumorale. (tiré de

33 capillaires aux étapes précoces de l angiogenèse physiologique, lorsque l orientation et la sélection des troncs vasculaires définitifs n ont pas encore été réalisées. Ces caractéristiques proviendraient du microenvironnement spécifique dans lequel s est réalisée la vascularisation, notamment en l absence de péricytes qui empêchent le remodelage et l élagage de l arbre vasculaire. figure 9. L ensemble des mécanismes impliqués au cours de l angiogenèse est schématisé dans la III. Les types d angiogenèse L angiogenèse peut se dérouler selon deux processus : l excroissance ou bourgeonnement et la compartimentation de vaisseaux préexistants (Figure 10). La formation de néo-vaisseaux par bourgeonnement est un processus comprenant une phase de construction et une phase de stabilisation. La phase de construction, ou tubulogenèse, consiste en la dégradation protéolytique de la matrice extracellulaire entourant le vaisseau, la prolifération et la migration des CE. La phase de maturation ou de stabilisation comprend l arrêt de la prolifération et de la migration des CE, la reconstruction d une matrice extracellulaire autour du néo-vaisseau. Le recrutement et la différenciation des péricytes et des CML stabilisent le nouveau réseau vasculaire généré. Le VEGF et ses récepteurs sont fortement impliqués dans la phase de construction tandis que les angiopoïétines et le TGFß contrôlent l étape de maturation. L angiogenèse par compartimentation d un vaisseau pré-existant résulte de l insertion de CE dans la lumière vasculaire. Ce processus se caractérise par un cloisonnement de cette lumière. L angiogenèse par compartimentation est prédominante dans le poumon qui possède des précurseurs de CE permettant l irrigation de cet organe par vasculogenèse (Pardanaud et col., 1989). En revanche, l angiogenèse par bourgeonnement est majoritaire dans le cerveau qui ne contient pas de précurseurs. IV. Remodelage et maturation du réseau vasculaire Cette étape correspond à une régulation fine de l ensemble du réseau vasculaire selon le type de vaisseau et son rôle dans l irrigation d un organe donné. Tout d abord, au cours du développement de la vascularisation, le flux sanguin peut s inverser et transformer des artérioles en veinules. D autre part, lorsque le flux sanguin s établit, la structure des vaisseaux 22

34 Figure 9. Mécanismes cellulaires de l angiogenèse et principaux facteurs de croissance impliqués. (tiré de Larcher E, Médecine/Science, 2003) A B Figure 10. Schématisation de l angiogenèse par compartimentation (A) et par excroissance ou bourgeonnement (B). (tiré de D'Angio et Maniscalco, Frontiers in Bioscience, 2002)

35 se stabilise et les vaisseaux qui ne seront pas recrutés au sein du réseau vasculaire rétrécissent et régressent rapidement. Des CE caractérisées par un noyau irrégulier et condensé font saillie dans la lumière de ces vaisseaux. Le blocage du débit sanguin entraîne ensuite une cascade d apoptoses secondaires et l atrophie du vaisseau. Si les vaisseaux sanguins non perfusés régressent, une forte irrigation d un tissu peut provoquer une hyperoxygénation responsable d une régression vasculaire, vraisemblablement impliquée dans l absence de vascularisation des artères à l inverse des veines. Le système vasculaire peut également être sensible aux contraintes physiques de la circulation sanguine. Ce stress affecte les CE en modifiant leurs jonctions intercellulaires et leur interaction avec la matrice extracellulaire. Enfin, les parois vasculaires subissent une maturation à travers la modification de la membrane basale, le recrutement des cellules murales de l endothélium et le début de l élastogenèse dans les artères élastiques. V. Le recrutement des cellules murales La vascularisation s achève par la mise en place d une paroi vasculaire formée de deux types cellulaires : les CE en contact avec la lumière vasculaire entourées par des cellules murales. Selon le type des vaisseaux, les cellules murales sont des CML ou des péricytes. Les CML apparaissent majoritairement dans les grands vaisseaux alors que les péricytes sont associés aux artérioles, aux veinules et aux capillaires. Le recrutement et la différenciation des cellules murales sont dépendants de signaux provenant des CE (Lindahl et col., 1997; Hirschi et col., 1998; Lindahl and Betsholtz, 1998; Hirschi et col., 1999). En retour, les cellules murales sont impliquées dans la régulation et la stabilisation des tubes endothéliaux en formation (Orlidge and D'Amore, 1987; Sato and Rifkin, 1989; Sato et col., 1990). Il apparaît que le degré de recouvrement de l endothélium par les péricytes est important dans les propriétés structurales et fonctionnelles d un type de microvaisseau donné. Il existe plus de péricytes dans le système nerveux central que dans le muscle squelettique ou les capillaires coronaires (Tilton et col., 1979; Sims et col., 1994; Balabanov and Dore-Duffy, 1998). En effet, le fort recouvrement de l endothélium vasculaire du système nerveux central doit intervenir dans le maintien d une barrière hémato-encéphalique imperméable (Balabanov and Dore-Duffy, 1998) alors qu un plus faible recouvrement permet une plus forte perméabilité vasculaire. L association des CE aux cellules murales marque la fin d une phase de dépendance des CE vis à vis des facteurs de croissance. En effet, en l absence de cellules musculaires lisses ou de péricytes, les tubes naissants formés par les CE sont instables et vont régresser si le VEGF, en tant que facteur de survie, n est pas présent. D après ce mécanisme, 23

36 le réseau vasculaire tumoral reste dans un état primitif puisqu il est sous l influence de nombreux facteurs de croissance et ces vaisseaux immatures peuvent se maintenir même en absence de cellules murales. La néo-vasculature tumorale et la tumeur en général peuvent ainsi être considérés comme une blessure qui ne cicatrise jamais. Ainsi, la privation de facteurs de croissance pour la tumeur provoque un arrêt de la croissance vasculature, voire une régression de la néo-vascularisation immature (Benjamin et col., 1999). 24

37 3. Les facteurs impliqués dans l angiogenèse I. L HARP et la MK La protéine HARP a été isolé à partir de tissus tels que le cerveau de rat nouveau-né (Rauvala, 1989), l utérus bovin (Milner et col., 1989), le cœur de poulet (Hampton et col., 1992) et le cerveau de bœuf adulte (Courty et col., 1991). C est une protéine de 17 kda qui possède des propriétés analogues à celles des FGF comme une forte affinité pour l héparine et des activités mitogène, angiogène et de croissance neuritique. La présence de ponts disulfures confère à l HARP une structure constituée de deux domaines globulaires (Figure 11). L HARP est détectée dans la prostate et les glandes mammaires au niveau des capillaires (Ledoux et col., 1997; Vacherot et col., 1999). Les CE capillaires de rétine, de cerveau et de glande surrénale expriment également l HARP. La phase progestative du cycle menstruel est associée à une augmentation de l expression de l HARP au sein des CE des capillaires de l endomètre (Milhiet et col., 1998). Dans un modèle d ischémie cérébrale chez le rat, une forte expression de l HARP a été décrite au niveau des CE proches de la zone ischémiée (Yeh et col., 1998). L HARP stimule la prolifération des CE, leur différenciation et la formation de structures pseudo-capillaires sur gel de collagène (Courty et col., 1991; Fang et col., 1992; Laaroubi et col., 1994; Souttou et col., 2001). L HARP est également impliquée dans la dégradation de la matrice, étape essentielle de l angiogenèse, en stimulant l expression de l activateur tissulaire du plasminogène (tpa) et diminuant celle de son inhibiteur (PAI-1 pour inhibiteur de l activateur du plasminogène) (Kojima et col., 1995). II. Les FGF La famille des FGF comprend une vingtaine de membres de structures homologues. Les FGF-1 et -2 sont préférentiellement impliqués dans l angiogenèse (Friesel and Maciag, 1995). Ce sont des protéines de 18 kda, non-glycosylées et formées d une seule chaîne. Les FGF-1 et -2 sont synthétisés par de nombreux types de cellules impliquées dans l angiogenèse dont les cellules inflammatoires, les CE et les fibroblastes. Ils peuvent être libérés par les CE endommagées. Les FGF agissent sur les CE de façon paracrine lorsqu ils sont libérés de la matrice extracellulaire ou de façon autocrine lorsque les CE les sécrètent elles-même. Ils ont une forte activité mitogène envers les CE et stimulent la prolifération et la différenciation des CE (Folkman and Klagsbrun, 1987). Ils stimulent la migration des CE dans les phases précoces de la réparation tissulaire en activant les enzymes impliquées dans la formation du 25

38 Figure 11 : Représentation de la structure tridimentionnelle de l'harp. Les 10 cystéines qui forment les 5 ponts disulfures sont colorées en jaune, les feuillets β en rouge, et les extrémités N- et C- terminales en bleu. (tiré de la structure tridimensionnelle de la midkine : NIH gi sp P21741 MK_HUMAN[127116])

39 caillot sanguin et d un dépôt de fibrine. Le FGF-2 stimule également la migration des CE en surexprimant des protéines d interaction entre les CE et la matrice extracellulaire, telles que les intégrines (Pepper and Meda, 1992). Les récepteurs FGFR-1 et -2 sont exprimés à la surface des CE (Bastaki et col., 1997). In vivo, le FGF-2 stimule l angiogenèse dans plusieurs modèles de néovascularisation comme ceux de la cornée de souris et de lapin (Jain et col., 1997) et stimule la différenciation des angioblastes en CE matures (Flamme and Risau, 1992). III. Le VEGF Le VEGF a été initialement caractérisé comme un facteur capable d accroître la perméabilité vasculaire (Senger et col., 1983). Cette protéine associée à la formation d œdèmes cérébraux dans les gliomes a été nommée vascular permeability factor (VPF) (Bruce et col., 1987). En 1989, Plouët et Ferrara rapportent indépendamment la purification d un facteur mitogène pour les CE qu ils ont nommé respectivement vasculotropine (Plouet et col., 1989) et vascular endothelial growth factor (Ferrara and Henzel, 1989). L attribution des mêmes activités physiologiques ou pathologiques vis-à-vis de la croissance des vaisseaux a conduit à définir un seul et même facteur appelé VEGF (Keck et col., 1989; Leung et col., 1989). 1. Structure du VEGF Le VEGF est constitué d un homodimère N-glycosylé sur le résidu arginine 75. Toutefois, cette glycosylation ne semble pas impliquée dans les activités biologiques du VEGF. En effet, la mutation de l arginine 75 n altère pas l induction de la prolifération des CE in vitro ni son effet angiogène in vivo dans un modèle d ischémie de la patte de rat (Walter et col., 1996) et son activité sur la perméabilité vasculaire (Claffey et col., 1995). Toutefois, le temps de sécrétion du VEGF non-glycosylé est retardé (Yeo et col., 1991). 1. Structure tridimensionnelle du VEGF La structure tridimensionnelle du VEGF consiste en un homodimère antiparallèle lié par deux ponts disulfure entre les cystéines 51 et 60 (Muller et col., 1997). Le motif dominant du VEGF est un domaine en nœud riche en cystéine, retrouvé dans la structure de nombreux facteurs de croissance (Figure 12) (Murray-Rust et col., 1993). Ce domaine consiste en huit résidus cystéine formant des ponts disulfure entre les résidus 57 et 102, 61 et 104. Un troisième pont formé entre les résidus 26 et 68 passe à travers les deux premiers. A partir de ce motif, il existe un domaine central composé de quatre feuillets β (1, 3, 5 et 6). La région reliant les feuillets β 1 et 3 contient une petite hélice α (α 2) et un court feuillet β (β 2). Ces 26