Manuel du PAXgene Blood RNA Kit

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1 Manuel du PAXgene Blood RNA Kit Version 2 Le système PAXgene Blood RNA est composé d un tube à prélèvement sanguin (PAXgene Blood RNA tube) et d une trousse de purification d acides nucléiques (PAXgene Blood RNA Kit). Le système a été développé pour le prélèvement, la conservation et le transport d échantillons sanguins, la stabilisation de l ARN intracellulaire dans un tube d échantillon fermé ainsi que l isolation et la purification de l ARN intracellulaire à partir de sang total pour la RT-PCR utilisée dans les tests de diagnostic moléculaire. Les caractéristiques de performance indiquées pour le système PAXgene Blood RNA s appliquent uniquement aux transcrits des gènes fos et IL-1b. L utilisateur est responsable d établir les caractéristiques de performance du système PAXgene Blood RNA relatives aux autres transcrits. Pour utilisation en diagnostic in vitro FR PreAnalytiX GmbH, Feldbachstrasse, CH-8634 Hombrechtikon Produit par QIAGEN GmbH pour PreAnalytiX R FR Avril 2008

2 Marques déposées : PAXgene, PreAnalytiX (PreAnalytiX GmbH) ; QIAGEN, QIAcube (QIAGEN Group) ; BD Vacutainer, BD Hemogard, Safety-Lok (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, États-Unis) ; Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Les kits PAXgene Blood RNA ne sont pas disponibles dans tous les pays ; nous consulter. Accord de licence limitée En utilisant ce produit, l acheteur ou l utilisateur du kit PAXgene Blood RNA consent aux termes suivants : 1 Le kit PAXgene Blood RNA ne doit qu être utilisé conformément au Manuel du PAXgene Blood RNA Kit et uniquement avec les composants fournis à l intérieur du kit. PreAnalytiX n accorde aucune licence sous sa propriété intellectuelle pour utiliser ou intégrer les composants fournis dans ce kit avec tous autres composants non fournis dans ce kit, à l exception de ce qui est expliqué dans le Manuel du PAXgene Blood RNA Kit, ainsi que d autres protocoles disponibles sur le 2 Hormis les licences énoncées expressément, PreAnalytiX n offre aucune garantie indiquant que ce kit et/ou son(ses) utilisation(s) ne violent pas les droits de tiers. 3 Ce kit et ses composants sont sous licence pour une utilisation unique ; il ne peut pas être réutilisé, remis à neuf ou revendu. 4 PreAnalytiX rejette notamment toutes autres licences, expresses ou tacites, autres que celle énoncée expressément. 5 L acheteur et l utilisateur du kit consentent à ne pas prendre, ni autoriser quiconque à prendre, de quelconques mesures pouvant entraîner ou faciliter la réalisation d actes interdits par les termes précédents. PreAnalytiX peut faire appliquer des interdictions de cet Accord de licence limitée par tout tribunal et pourra recouvrir tous ses frais de recherche et de justice, y compris les frais d avocats, en cas d action en application de cet Accord de licence limitée ou de tous ses droits de propriété intellectuelle liés au kit et/ou à ses composants. Pour obtenir les termes de licence mis à jour, consulter le PreAnalytiX GmbH, tous droits réservés. PreAnalytiX PreAnalytiX GmbH Feldbachstrasse CH 8634 Hombrechtikon Suisse Distributeurs PreAnalytiX Les produits PreAnalytiX sont fabriqués pour PreAnalytiX par QIAGEN ou BD et sont commercialisés par QIAGEN ou BD au nom de PreAnalytiX. Les produits ne peuvent pas être commandés directement chez PreAnalytiX GmbH. Veuillez vous référer à la dernière page pour connaître votre distributeur PreAnalytiX local.

3 Sommaire Explication des symboles 4 Contenu du kit 5 Conditions de conservation 6 Domaine d utilisation 6 Limites d utilisation 7 Contrôle qualité 7 Assistance technique 7 Informations de sécurité 7 Introduction 10 Le principe PAXgene et son application 10 Prélèvement et stabilisation de l échantillon 10 Purification manuelle des ARN 19 Purification automatisée des ARN 27 Matériel supplémentaire nécessaire 31 Note importante 32 Utilisation du QIAcube 32 Démarrage du QIAcube 32 Installation des protocoles sur le QIAcube 32 Chargement du QIAcube 34 Protocole : Purification manuelle d ARN total à partir de sang total humain prélevé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) 41 Protocole : Purification automatique d ARN total à partir de sang total humain prélevé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) 48 Résolution des principaux problèmes rencontrés (Troubleshooting) 54 Annexe A : Remarques générales sur la manipulation des ARN 56 Annexe B : Quantification et détermination de la qualité de l ARN total 57 Annexe C : Manipulation des tubes PAXgene Blood RNA 59 Pour commander 60 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 3

4 Explication des symboles i <N> Kit contient des réactifs pour <N> tests Lire les informations dans le manuel A utiliser avant Ne pas réutiliser Dispositif destiné au diagnostic in vitro Référence du catalogue Numéro de lot Référence du matériel Composants Nombre Méthode de stérilisation utilisant l irradiation UV Unités Kunitz Limites de température Limite maximale de température Fabricant Note importante? EtOH Noter la date du jour sur le flacon après avoir ajouté l éthanol A l arrivée Ajouter Contient Reconstitué Désoxyribonucléase I Ethanol Thiocyanate de guanidine DNase exempte de RNase Mène à 4 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

5 Contenu du kit Kit PAXgene Blood RNA (50) Référence n Nombre de préparations 50 BR 1 Tampon de resuspension 20 ml BR 2 Tampon de fixation* 18 ml BR 3 Tampon de lavage 1* 45 ml BR 4 Tampon de lavage 2 (concentré) 11 ml BR5 Tampon d élution 6 ml RNFW PK PRC PT Eau exempte de RNase (flacon) Protéinase K (couvercle vert) Colonnes PAXgene RNA Spin (rouge) Tubes de traitement (2 ml) 2 x 125 ml 2 x 1,4 ml 5 x 10 6 x 50 Hemogard Bouchons secondaires BD Hemogard 50 MCT RNFD Tubes de microcentrifugation (1,5 ml) DNase l, exempte de RNase (lyophilisée) 3 x 50 1 x unités Kunitz Suite du tableau à la page suivante * N est pas compatible avec des produits désinfectants contenant de l eau de javel (hypochlorite de sodium, NaOCl). Contient un sel de guanidine. Veuillez vous référer à la page 7 pour les informations de sécurité. Le tampon de lavage 2 (BR4) est fourni comme concentré. Avant de l utiliser pour la première fois, ajouter 4 volumes d éthanol (96 à100%, pureté p.a.) dans le flacon comme indiqué sur l étiquette pour obtenir une solution prête à l emploi. Les unités Kunitz sont généralement utilisées pour mesurer l activité enzymatique de la DNase I, voir à la page 43 ou 49 pour leur définition. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 5

6 Kit PAXgene Blood RNA (50) Référence n Nombre de préparations 50 RDD Tampon de digestion de l ADN (couvercle blanc) 2 x 2 ml DRB PSC Tampon de resuspension de la DNase (tube, couvercle lilas) Colonnes PAXgene Shredder (lilas) Manuel du PAXgene Blood RNA Kit (Version 2) 2 ml 5 x 10 1 Conditions de conservation Les colonnes PAXgene RNA (PRC), les colonnes PAXgene Shredder (PSC), la protéinase K (PK) et les tampons (BR1, BR2, BR3, BR4 et BR5) peuvent être conservés au sec à la température indiquée sur l étiquette du kit. Le RNase-Free DNase Set, qui contient la DNase I (RNFD), le tampon de digestion d ADN (RDD) et le tampon de resuspension d ADN (DRB), est livré à température ambiante. Conserver tous les composants du RNase-Free DNase Set immédiatement à la température indiquée sur l étiquette. Domaine d utilisation Le kit PAXgene Blood RNA a été développé pour la purification d ARN intracellulaire à partir de sang total prélevé dans le tube PAXgene Blood RNA (BRT). Lorsque le kit est utilisé avec le tube PAXgene Blood RNA (BRT), le système permet d obtenir de l ARN intracellulaire purifié, qui peut être utilisé pour les tests de diagnostic moléculaire basés sur la RT PCR. Se référer à la PAXgene Blood RNA Tube Product Circular pour savoir comment utiliser les tubes PAXgene Blood RNA (BRT). Les caractéristiques de performance indiquées pour le système PAXgene Blood RNA s appliquent uniquement aux transcrits des gènes fos et IL-1b. L utilisateur est responsable d établir les caractéristiques de performance du système PAXgene Blood RNA relatives aux autres transcrits. 6 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

7 Limites d utilisation Le kit PAXgene Blood RNA a été développé pour la purification d ARN intracellulaire à partir de sang total humain (4,8 x ,1 x 10 7 leucocytes/ml) pour des applications de diagnostic in vitro. Il n est pas destiné à la purification d ADN génomique ou d acides nucléiques viraux à partir de sang total humain. En raison du nombre limité de transcrits validés pour les spécifications de stabilisation (transcrits de gènes fos et IL1B), les caractéristiques de performance n ont pas été établies pour tous les transcrits. Il revient au personnel du laboratoire de comparer les données fournies par le fabricant avec les leurs et de décider si une validation est nécessaire pour d autres transcrits. Contrôle qualité En accord avec le Quality Management System QIAGEN certifié ISO, chaque lot du kit PAXgene Blood RNA a été testé conformément aux spécifications prédéterminées afin d assurer une qualité constante du produit. Assistance technique Avec son support technique, QIAGEN garantit à ses clients une consultation scientifique de qualité. Des scientifiques en biologie moléculaire expérimentés sont à votre disposition pour vous conseiller et vous aider à utiliser les produits PreAnalytiX. N hésitez pas à les contacter si vous avez des questions sur le kit PAXgene Blood RNA. Pour toute assistance technique ou pour plus d information, contactez le support technique QIAGEN (voir à la page 63). Informations de sécurité Lors de la manipulation de produits chimiques, toujours porter une blouse appropriée, des gants jetables et des lunettes de sécurité. Afin d éviter tout risque de contamination (par exemple avec les virus VIH ou Hépatite B) ou de blessure lorsque vous travaillez avec du matériel biologique et chimique, toujours porter une blouse appropriée, des gants jetables et des lunettes de sécurité. Pour plus d informations, veuillez consulter les fiches de données de sécurité (FDS). Elles sont disponibles sur notre site Internet en format PDF et vous pouvez les consulter ou les imprimer pour ce kit. Le tampon de fixation (BR2) et le tampon de lavage 1 (BR3) contiennent du thiocyanate de guanidine et peuvent former des composés hautement réactifs au contact de l eau de Javel. Au cas où du tampon de fixation (BR2) ou du tampon de lavage 1 (BR3) serait renversé, nettoyer avec un détergent de PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 7

8 laboratoire et de l eau. Si le liquide renversé contient des agents à risque infectieux, nettoyer l endroit contaminé d abord avec un détergent et de l eau, puis avec de l hypochlorite de sodium à 1% (v/v). ATTENTION : NE JAMAIS verser de l eau de Javel ou des solutions acides directement dans les déchets liquides de préparation des ARN. La solution de stabilisation d ARN et le mélange sanguin du tube PAXgene Blood RNA (BRT) peuvent être désinfectés avec 1 volume d eau de Javel (hypochlorite de sodium 5%) pour 9 volumes de la solution de stabilisation d ARN ou du mélange sanguin. Les déchets de la préparation de l échantillon, tel que le surnageant des étapes de centrifugation lors de la purification d ARN, doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Avant de les éliminer, les autoclaver ou les incinérer pour détruire tout matériel infectieux. Eliminer les déchets selon les normes de sécurité en vigueur dans le laboratoire. Les indications de risque et sécurité (R & S) de la classification CEE sont indiquées ci-dessous pour les composants du kit PAXgene Blood RNA. Se référer à la PAXgene Blood RNA Tube Product Circular pour connaître les informations de sécurité des tubes PAXgene Blood RNA (BRT). Tampon de fixation (BR2) Xn Contient du thiocyanate de guanidine : nocif (Xn). Indications de Risque et Sécurité* : R20/21/22-32, S Tampon de lavage 1 (BR3) Contient de l éthanol : inflammable. Indication de Risque* : R10 * R10 : Inflammable ; R20/2 1/22 : Nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion ; R32 : Au contact d un acide, dégage un gaz très toxique ; R36/37/38 : Irritant pour les yeux, les voies respiratoires et la peau ; R42/43 : Peut entraîner une sensibilisation par inhalation et par contact avec la peau ; S13 : Conserver à l écart des aliments et boissons, y compris ceux pour animaux ; S22 : Ne pas respirer la poussière ; S23 : Ne pas respirer les aérosols ; S24 : Eviter le contact avec la peau ; S26 : En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l eau et consulter un spécialiste ; S36 : Porter un vêtement de protection approprié ; S36/37 : Porter un vêtement de protection et des gants appropriés ; S46 : En cas d ingestion, consulter immédiatement un médecin et lui montrer l emballage ou l étiquette. 8 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

9 Protéinase K (PK) Xn Contient de la protéinase K (Tritirachium album) : agent sensibilisant, irritant. Indications de risque et sécurité* : R36/37/38-42/43 S /37. DNase I Xn Contient de la désoxyribonucléase (bovine) : agent sensibilisant. Indications de risque et sécurité* : R42/43, S /37 Service d informations 24h/24 En cas d urgence, contacter le Service d informations 24h/24 (en français, anglais et allemand) : Centre d information Anti-poison, Mayence, Allemagne Tél : * R10 : Inflammable ; R20/2 1/22 : Nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion ; R32 : Au contact d un acide, dégage un gaz très toxique ; R36/37/38 : Irritant pour les yeux, les voies respiratoires et la peau ; R42/43 : Peut entraîner une sensibilisation par inhalation et par contact avec la peau ; S13 : Conserver à l écart des aliments et boissons, y compris ceux pour animaux ; S22 : Ne pas respirer la poussière ; S23 : Ne pas respirer les aérosols ; S24 : Eviter le contact avec la peau ; S26 : En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l eau et consulter un spécialiste ; S36 : Porter un vêtement de protection approprié ; S36/37 : Porter un vêtement de protection et des gants appropriés ; S46 : En cas d ingestion, consulter immédiatement un médecin et lui montrer l emballage ou l étiquette. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 9

10 Introduction Le prélèvement de sang total est la première étape de nombreux tests moléculaires analysant l ARN cellulaire. L instabilité du profil d ARN cellulaire in vitro constitue un grand problème. Des études faites par PreAnalytiX ont démontré que le nombre de copies de chaque espèce d ARNm dans le sang total peut varier d un facteur 1000 lors du stockage ou du transport à température ambiante*. Ceci est dû à une dégradation rapide de l ARN et à l induction de l expression de certains gènes après le prélèvement du sang. De telles modifications du profil d expression de l ARN rendent impossible l obtention de résultats fiables lors d études d expression de gènes. Une méthode permettant de stabiliser le profil d expression de l ARN pendant et après la phlébotomie est donc essentielle pour une analyse exacte de l expression de gènes dans le sang total humain. Le principe PAXgene et son application PreAnalytiX a développé un nouveau système qui permet de prélever, stabiliser, conserver et transporter des échantillons de sang total humain, en combinaison avec un protocole rapide et efficace pour l extraction d ARN intracellulaire. Le système requiert l utilisation des tubes PAXgene Blood RNA (BRT ; brevets US et ) pour le prélèvement du sang et la stabilisation d ARN ainsi que la trousse PAXgene Blood RNA pour la purification manuelle ou automatique d ARN. Les protocoles manuel et automatique fournissent des performances substantiellement équivalentes concernant la qualité et le rendement en ARN. Les données relatives aux performances des protocoles manuel (pages 19 26) et automatique (pages 27 30) figurent dans ce manuel. Prélèvement et stabilisation de l échantillon Les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) contiennent un réactif spécifique basé sur une technologie brevetée de stabilisation d ARN. Ce réactif protège les molécules d ARN de la dégradation par les RNases et minimise les modifications ex vivo de l expression de gènes. Les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) pour le prélèvement de sang total humain assurent la stabilisation d ARN cellulaire jusqu à 3 jours à une température comprise entre 18 et 25 C (Figures 1 et 2, pages 12 et 13) ou jusqu à 5 jours entre 2 et 8 C (Figures 3 et 4, pages 14 et 15). Des données récentes démontrent une stabilisation d ARN cellulaire d au moins 24 mois quand le sang stabilisé est conservé à 20 C ou 70 C. Pour plus d informations sur les études de stabilité à plus long terme, veuillez contacter le support technique QIAGEN. * Rainen, L. et al. (2002) Stabilization of mrna expression in whole blood samples. Clin. Chem. 48, PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

11 La durée de la stabilisation d ARN peut varier selon le type d ARN cellulaire et l application ultérieure utilisée. En raison du nombre limité de transcrits validés pour les spécifications de stabilisation (transcrits de gènes fos et IL1B), les caractéristiques de performance n ont pas été établies pour tous les transcrits. Il revient au personnel du laboratoire de comparer les données fournies par le fabricant avec les leurs et de décider si une validation est nécessaire pour d autres transcrits. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

12 Stabilité de l ARN dans les échantillons sanguins entre 18 et 25 C : FOS Conservation (jours) Conservation (jours) Figure 1 : Le sang a été prélevé en duplicats sur 10 donneurs et conservé entre 18 et 25 C le nombre de jours indiqué jusqu à la purification d ARN total. Le sang a été prélevé et conservé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT). L ARN total a été purifié à l aide du kit PAXgene Blood RNA. Le sang a été extrait et conservé dans les tubes de prélèvement standard sur EDTA comme anticoagulant. L ARN total a été purifié par une méthode d extraction standard à base d une solution organique avec lavage de l ARN à base de membrane de silice. Les concentrations relatives de transcrits de FOS ont été déterminées par une RT-PCR duplex en temps réel avec l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique, avec la moyenne des valeurs et leur déviation standard. La ligne pointillée représente l intervalle de précision du test (± 3x la précision totale du test de ± 2,34 C T ). 12 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

13 Stabilité de l ARN dans les échantillons sanguins entre 18 et 25 C : IL-1b Conservation (jours) Conservation (jours) Figure 2 : Le sang a été prélevé et l ARN purifié comme à la figure 1, après conservation à une température comprise entre 18 et 25 C. Les concentrations relatives de transcrits de IL-1b ont été déterminées par une RT-PCR duplex en temps réel avec de l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique, avec la moyenne des valeurs et leur déviation standard. La ligne pointillée représente l intervalle de précision du test (± 3x la précision totale du test de ± 1,93 C T ). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

14 Stabilité de l ARN dans les échantillons sanguins entre 2 et 8 C : FOS Conservation (jours) Conservation (jours) Figure 3 : Le sang a été prélevé en duplicats sur 10 donneurs et conservé entre 2 et 8 C le nombre de jours indiqué jusqu à la purification de l ARN total. Le sang a été prélevé et conservé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT). L ARN total a été purifié à l aide du kit PAXgene Blood RNA. Le sang a été extrait et conservé dans les tubes de prélèvement standard sur EDTA comme anticoagulant. L ARN total a été purifié par une méthode d extraction standard à base d une solution organique avec lavage de l ARN à base de membrane de silice. Les concentrations relatives de transcrits de fos ont été déterminées par une RT-PCR duplex en temps réel avec l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique, avec la moyenne des valeurs et leur déviation standard. La ligne pointillée représente l intervalle de précision du test (± 3x la précision totale du test de ± 2,34 C T ). 14 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

15 Stabilité de l ARN dans les échantillons sanguins entre 2 et 8 C : IL-1b Conservation (jours) Conservation (jours) Figure 4 : Le sang a été prélevé et l ARN purifié comme à la figure 3, après conservation à une température comprise entre 2 et 8 C. Les concentrations relatives de transcrits de IL-1b ont été déterminées par une RT-PCR duplex en temps réel avec de l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique, avec la moyenne des valeurs et leur déviation standard. La ligne pointillée représente l intervalle de précision du test (± 3x la précision totale du test de ± 1,93 C T ). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

16 Concentration et purification des ARN Le kit PAXgene Blood RNA a été développé pour la purification d ARN total à partir de 2,5 ml de sang total prélevé dans un tube PAXgene Blood RNA (BRT). La procédure est simple et peut être réalisée manuellement ou automatiquement (voir le diagramme). Dans les deux protocoles, la purification commence par une étape de centrifugation en culots d acides nucléiques dans le tube PAXgene Blood RNA (BRT). Le culot est lavé et remis en suspension, puis l ARN est purifié manuellement ou automatiquement. En principe, les deux protocoles suivent les mêmes étapes et utilisent les mêmes composants du kit. 16 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

17 Le procédé manuel PAXgene Blood RNA Sang Ajouter la protéinase K (PK) et le tampon de fixation (BR2) Incuber Transférer dans la colonne PAXgene Shredder (PSC) Mélanger Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation Ajouter l éthanol Déposer sur la colonne PAXgene RNA (PRC) Laver le culot Fixer l ARN total Laver Reprendre Digérer l ADN Transférer dans un tube de microcentrifugat ion (MCT) Laver Eluer Chauffer à 65 C ARN prêt à l emploi PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

18 Le procédé automatique PAXgene Blood RNA Sang Ajouter la protéinase K (PK) et le tampon de fixation (BR2) Incuber Mélanger Transférer dans la colonne PAXgene Shredder (PSC) Ajouter l éthanol à l effluent Laver le culot Transférer dans un tube de traitement (PT) et le charger dans l agitateur QIAcube Reprendre Déposer sur la colonne PAXgene RNA (PRC) Fixer l ARN total Laver Digérer l ADN Laver Complètement automatisé sur le QIAcube Transférer la colonne PAXgene RNA (PRC) Eluer Fermer les couvercles des tubes de microcentrifugation (MCT) et les transférer dans l agitateur QIAcube Chauffer à 95 C ARN prêt à l emploi 18 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

19 Purification manuelle des ARN En détail, le culot remis en suspension est incubé dans des tampons optimisés avec de la protéinase K (PK) pour digérer les protéines. Une étape de centrifugation additionnelle à travers la colonne PAXgene Shredder (PSC) est réalisée pour homogénéiser le lysat cellulaire et éliminer les restes cellulaires. Le surnageant est transféré dans un nouveau tube de microcentrifugation. De l éthanol est ajouté pour optimiser les conditions de fixation et le lysat est déposé sur une colonne PAXgene RNA (PRC). Au cours d une courte étape de centrifugation, l ARN est fixé à la membrane PAXgene à base de gel de silice, alors que les contaminants résiduels passent au travers. Les résidus de contaminants sont éliminés au cours de plusieurs étapes de lavage. La membrane est incubée avec de la DNase I (RNFD) entre la première et la deuxième étape de lavage pour supprimer toute trace d ADN fixé. Après les étapes de lavage, l ARN est élué dans le tampon d élution (BR5) et dénaturé à la chaleur. L ARN total purifié avec le système PAXgene Blood RNA est d une grande pureté. Avec le protocole manuel, le rapport A 260 /A 280 se situe entre 1,8 et 2,2 et une proportion d ADN génomique 1% (p/p) est présente dans 95% des échantillons. Ces valeurs ont été mesurées par une PCR quantitative en temps réel d une séquence du gène bêta-acétine. Lors d essais de RT- PCR, composés d éluat jusqu à 30% du volume de réaction, aucune inhibition du système n est apparue pour plus de 95% des échantillons. Avec le protocole manuel, la moyenne du temps de préparation d un échantillon (basé sur des données d un lot de 12) est d environ 90 minutes, dont 40 minutes de manipulation. Les rendements en ARN à partir de 2,5 ml de sang total humain d un donneur sain sont 3 μg pour plus de 95% des échantillons traités. Comme le rendement dépend fortement du donneur, les rendements individuels peuvent varier. Pour l analyse d un donneur en particulier, le système PAXgene Blood RNA permet d obtenir des rendements en ARN reproductibles et répétables (voir les figures 5 et 6 aux pages 20 et 21) et des résultats de RT-PCR également reproductibles et répétables (voir les figures 7 et 8 aux pages 24 et 25), de sorte que le système est très adapté aux analyses cliniques et diagnostiques. La reproductibilité et la répétabilité du système PAXgene Blood RNA sont représentées à la figure 5. L influence des différents lots du kit PAXgene Blood RNA ainsi que du personnel de laboratoire effectuant les tests sur la reproductibilité du rendement en ARN et des résultats de la RT- PCR en temps réel a été analysée au cours d études ultérieures. Un pool d échantillons sanguins a fait l objet de ces analyses, et non des échantillons prélevés individuellement dans des tubes PAXgene Blood RNA (BRT). Les résultats ne reflètent donc pas la répétabilité du système entier, qui prend en considération les différences résultat du type de prélèvement sanguin, mais la répétabilité de la préparation d ARN seulement (voir à la figure 6). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

20 Purification d ARN reproductible et répétable Rendements en ARN (μg/2,5 ml de sang) Donneur Moyennes du rendement en ARN (μg/2,5 ml de sang) Donneur Figure 5 : Des échantillons sanguins en quatre réplicats provenant de 14 donneurs ont été traités par 3 techniciens (A, B, C). Trois sets d équipement ont été utilisés et chaque technicien a utilisé le même équipement pour la préparation des échantillons. Sont présentées les moyennes et les déviations standard du rendement en ARN par réplicat du même donneur et traité par les différents techniciens. 12 répétitions de la purification d ARN provenant d échantillons de chacun des 14 donneurs ont été traités par 3 techniciens. Sont présentées les moyennes et les déviations standard du rendement en ARN par réplicat du même donneur et par tous les techniciens. Pour tous les échantillons d ARN, les ratios A 260 /A 280 étaient entre 1,8 et 2,2. 20 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

21 Répétabilité et reproductibilité du rendement en ARN d un pool d échantillons sanguins avec différents techniciens et différents lots du kit PAXgene Blood RNA Rendements en ARN (μg/2,5 ml de sang) Pool de donneurs CV du rendement en ARN (%) Donneur Figure 6 : Des échantillons de 30 donneurs ont été prélevés dans des tubes PAXgene Blood RNA (BRT) (12 tubes par donneur pour un total de 360 tubes). Le contenu de tous les tubes de trois donneurs a été poolé, puis répartis en 36 aliquotes. Ces pools de 36 échantillons de trois donneurs ont été préparés manuellement par trois techniciens. Chaque technicien a utilisé pour l extraction d ARN des kits PAXgene Blood RNA provenant de trois lots différents et effectué 4 réplicats (quadruplicats) à partir de chacun des 10 pools. Rendement d ARN et déviation standard pour chaque combinaison technicien-lot. 4 répétitions de préparation d échantillons sanguins de 10 pools de donneurs ont été traités par trois techniciens (utilisateur A, B et C) avec chacun des trois lots du kit (lot 1, 2 et 3). Sont présentées la moyenne du rendement en ARN (colonnes) et la déviation standard (barres d erreur) par réplicat d échantillon d un même pool de donneurs pour différents techniciens et différents lots de kit. Coefficient de variation (CV) du rendement de l ARN par pool de donneurs pour toutes les combinaisons technicien-lot (utilisateur A, B et C ; lot 1, 2 et 3) calculé à partir de la moyenne des rendements et des déviations standard indiquées à la figure 6A. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

22 Tableau 1A. Reproductibilité par lot de kit et pour chaque technicien Pool de donneurs 1 5,1 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 6 6,5 x 10 6 cellules/ml Combinaison de données Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Lot 1, technicien A 8,03 0,42 5 9,55 0,99 10 Lot 1, technicien B 7,98 1, ,38 1,94 21 Lot 1, technicien C 7,87 0, ,71 0,65 6 Lot 2, technicien A 7,32 0, ,78 1,89 19 Lot 2, technicien B 6,09 1, ,82 2,83 29 Lot 2, technicien C 6,87 0, ,37 0,74 7 Lot 3, technicien A 7,04 0, ,96 0,68 8 Lot 3, technicien B 6,98 1, ,73 0,97 13 Lot 3, technicien C 8,78 0, ,59 1,94 18 Tableau 1B. Reproductibilité entre tous les lots du kit par technicien Pool de donneurs 1 5,1 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 6 6,5 x 10 6 cellules/ml Combinaison de données Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Technicien A, tous les lots 7,46 0, ,43 1,22 13 Technicien B, tous les lots 7,02 1, ,98 2,09 23 Technicien C, tous les lots 7,84 0, ,56 1,15 11 Pool de donneurs 9 8,4 x 10 6 cellules/ml Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) 7,52 0,41 6 8,82 1, ,14 1, ,92 0,27 4 7,20 0, ,14 1, ,18 0,76 9 6,41 0, ,78 0,56 5 Pool de donneurs 9 8,4 x 10 6 cellules/ml Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) 7,54 0, ,48 1, ,02 1,34 13 Pool de donneurs 10 10,2 x 10 6 cellules/ml Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) 7,96 0,49 6 8,90 0, ,22 1, ,63 1, ,00 0, ,56 1, ,85 0, ,88 2, ,88 0,37 3 Pool de donneurs 10 10,2 x 10 6 cellules/ml Rendement moyen (μg) 7,81 SD (μg) 0,82 CV (% ) 11 8,26 1, ,89 1, PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

23 Tableau 1C. Reproductibilité entre tous les techniciens par lot du kit Pool de donneurs 1 5,1 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 6 6,5 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 9 8,4 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 10 10,2 x 10 6 cellules/ml Combinaison de données Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Lot 1, tous les techniciens 7,96 0,69 9 9,88 1, ,83 1, ,02 1,27 14 Lot 2, tous les techniciens 6,76 0, ,99 1, ,75 1, ,73 2,31 26 Lot 3, tous les techniciens 7,60 1, ,09 1, ,46 1, ,20 1,80 20 Tableau 1D. Reproductibilité entre tous les lots du kit et tous les techniciens Pool de donneurs 1 5,1 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 6 6,5 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 9 8,4 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 10 10,2 x 10 6 cellules/ml Combinaison de données Tous les lots et tous les techniciens Rendement moyen (μg) 7,44 SD (μg) 1,09 CV (%) 15 Rendement moyen (μg) 9,66 SD (μg) 1,65 CV (%) 17 Rendement moyen (μg) 8,35 SD (μg) 1,70 CV (%) 20 Rendement moyen (μg) 8,99 SD (μg) 1,80 CV (%) 20 Analyse détaillée de quatre pools de donneurs. Les pools ont été sélectionnés en fonction du nombre de leucocytes et établissent les valeurs minimale, moyenne et maximale de l intervalle normal du nombre de leucocytes (4,8 x ,1 x 10 7 leucocytes/ml). Les nombres de leucocytes ont été déterminés par la valeur moyenne du nombre de leucocytes des trois donneurs de chaque pool. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

24 Reproductibilité de la RT-PCR entre les techniciens Technicien Technicien Figure 7 : L ARN purifié au cours de l analyse décrite à la figure 6 a été utilisé lors d essais de RT PCR en temps réel. Les concentrations relatives de transcrits FOS et IL1b ont été déterminées à l aide d une RT PCR duplex en temps réel en utilisant l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées en fonction des valeurs de l utilisateur 1 (10 pools de donneurs x 3 lots de kit x 4 répétitions = 120 données par gène) incluant la valeur moyenne (trait rouge) et la déviation standard (barres noires). Les lignes pointillées représentent l intervalle de précision du test (± 3 fois la précision totale du test de ± 2,34 C T (FOS) et ± 1,93 C T (IL1b)). 24 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

25 Reproductibilité de la RT-PCR entre les lots du kit Lot Lot Figure 8 : L ARN purifié au cours de l analyse décrite à la figure 6 a été utilisé lors d essais de RT PCR en temps réel. Les concentrations relatives de transcrits FOS et IL1b ont été déterminées à l aide d une RT PCR duplex en temps réel en utilisant l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées en fonction des valeurs de lot du kit 1 (10 pools de donneurs x 3 utilisateurs x 4 répétitions = 120 données par gène) incluant la valeur moyenne (trait rouge) et la déviation standard (barres noires). Les lignes pointillées représentent l intervalle de précision du test (± 3 fois la précision totale du test de ± 2,34 C T (FOS) et ± 1,93 C T (IL1b)). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

26 Tableau 2. Résumé des résultats de RT-PCR des figures 7 et 8 Système du test Comparaison des données Test FOS/ARNr 18S Test IL1b/ARNr 18S Moyenne ( C T ) ±SD ( C T ) Moyenne ( C T ) ±SD ( C T ) Reproductibilité par technicien et entre tous les lots Tous les techniciens, lot 1 Tous les techniciens, lot 2 Tous les techniciens, lot 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,48 0,07 0,66 0,21 0,52 0,11 0,71 Reproductibilité par lot et entre tous les techniciens Tous les lots, technicien A 0,00 0,00 0,00 0,00 Tous les lots, technicien B 0,46 0,44 0,06 0,69 Tous les lots, technicien C 0,31 0,60 0,15 0,71 Technicien : technicien de laboratoire, qui effectue l analyse Lot : numéro de lot du kit utilisé SD : déviation standard Sont rapportées les moyennes des valeurs C T (N = 120) et les déviations standard des données représentées aux figures 7 et PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

27 Purification automatisée des ARN La procédure de préparation des échantillons avec le QIAcube est identique à la procédure manuelle, ce qui permet de continuer à utiliser le kit PAXgene Blood RNA pour purifier l ARN de haute qualité. Consulter le QIAcube User Manual et le pour de plus amples informations sur le QIAcube. Le protocole de purification automatique de l ARN se décompose en 2 étapes (ou protocoles), «PAXgene Blood RNA Part A» et «PAXgene Blood RNA Part B», avec une courte intervention manuelle entre les 2 parties. Le culot d acide nucléique centrifugé, lavé et remis en suspension (voir «Concentration et purification des ARN», page 16) est transféré du tube PAXgene Blood RNA (BRT) dans le tube de traitement (PT), puis placé sur l agitateur thermique de la table de travail du QIAcube. L opérateur sélectionne et lance le protocole «PAXgene Blood RNA Part A» à partir du menu. Le QIAcube réalise les étapes du protocole jusqu à l élution de l ARN dans le tampon d élution (BR5). Le technicien transfère les tubes de microcentrifugation (MCT) contenant l ARN purifié dans l agitateur thermique du QIAcube, puis sélectionne et lance le protocole «PAXgene Blood RNA Part B» à partir du menu ; la dénaturation par la chaleur est ensuite réalisée par le QIAcube. La moyenne du temps de préparation d un échantillon (basé sur des données d un lot de 12) est de 125 minutes, dont 20 minutes de manipulation. Les rendements en ARN à partir de 2,5 ml de sang total humain d un donneur sain sont 3 μg pour plus de 95% des échantillons traités. La figure 9 présente les rendements en ARN sur un total de 288 échantillons préparés selon le protocole automatique avec 3 lots du kit par 3 techniciens. Dans ces études, comme des échantillons de sang poolés ont été utilisés à la place de tubes PAXgene Blood RNA (BRT), les résultats ne reflètent pas le rendement en ARN attendu des échantillons individuels de chaque prélèvement sanguin. Comme le rendement dépend fortement du donneur, les rendements individuels peuvent varier (figure 9). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

28 Rendement en ARN Traitement automatique Rendements en ARN (μg/2,5 ml de sang) Figure 9 : Des échantillons de 48 donneurs ont été prélevés dans des tubes PAXgene Blood RNA (BRT) (6 tubes par donneur pour un total de 288 tubes). Le contenu de tous les tubes de six donneurs ont été poolés, puis répartis en 36 aliquotes. Ces pools de 36 échantillons de six donneurs ont été préparés par trois techniciens (A, B, C). Chaque technicien a utilisé pour l extraction automatique d ARN des kits PAXgene Blood RNA provenant de trois lots différents (1, 2, 3) et a effectué 4 réplicats (quadruplicats) à partir de chacun des 8 pools. Les rendements en ARN de chaque échantillon sont présentés pour chaque combinaison technicien-lot. Lors d essais de RT- PCR, composés d éluat jusqu à 30% du volume de réaction, aucune inhibition du système n est apparue pour plus de 95% des échantillons. Avec le protocole automatique, la contamination croisée entre les échantillons est indétectable par RT-PCR quantitative en temps réel des séquences du bêta-globine et des transcrits de FOS dans les échantillons ARN négatifs (eau) associés aux échantillons ARN positifs (sang total humain) dans le même cycle. L ARN purifié avec le système PAXgene Blood RNA et le protocole automatique est d une grande pureté, comme le montre le manque d inhibition de la RT-PCR (voir ci-dessus) et le rapport A 260 /A 280 situé entre 1,8 et 2,2. Une proportion d ADN génomique 1% (p/p) est présente dans 95% des échantillons. Ces valeurs ont été mesurées par une PCR quantitative en temps réel d une séquence du gène bêta-acétine. Les figures 10 et 11 montrent le rapport A 260 /A 280, ainsi que l ADN génomique relatif de 288 échantillons au total, préparés à l aide du protocole automatique par trois techniciens avec chacun des trois lots du kit. 28 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

29 Pureté de l ARN (rapport A 260 /A 280 ) Traitement automatique Figure 10 : L ARN a été purifié par 3 techniciens (A, B, C), à l aide de 3 lots différents (1, 2, 3) du kit PAXgene Blood RNA dans l expérience présentée en figure 9. Le rapport A 260 /A 280 de chaque échantillon est illustré pour chaque combinaison technicien-lot. Pureté de l ARN (contamination de l ADN génomique en %) Traitement automatique ADN génomique (p/p) (%) Pureté de l AR N Figure 11 : L ARN a été purifié par 3 techniciens (A, B, C), à l aide de 3 lots différents (1, 2, 3) du kit PAXgene Blood RNA dans l expérience présentée en figure 9. Les quantités d ADN génomique (p/p) de chaque échantillon sont illustrées pour chaque combinaison technicien-lot. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

30 Le protocole automatique de purification de l ARN avec le système PAXgene Blood RNA fournit des résultats de RT-PCR reproductibles et répétables, comme illustré en figure 2, de sorte que le système est très adapté aux analyses cliniques et diagnostiques. Reproductibilité de la RT-PRC entre les protocoles automatique et manuel Figure 12 : L ARN a été purifié par 3 techniciens (A, B, C) et 3 lots différents (1, 2, 3) du kit PAXgene Blood RNA avec le protocole automatique dans l expérience présentée en figure 9. En parallèle, l ARN a été purifié à partir des tubes de réplicats correspondants avec le protocole manuel. Les concentrations relatives de transcrits de FOS et de IL1b ont été déterminées à l aide d une RT PCR duplex en temps réel en utilisant l ARNr 18S comme standard interne. Les différences potentielles de taux de transcrits entre l ARN préparé à partir d échantillons sanguins associés à l aide des deux protocoles d extraction (automatique et manuel) ont été calculées par la méthode C T. Chaque valeur C T de toutes les associations d échantillons (4 replicats x 8 pools de donneurs x 3 lots du kit x 3 techniciens = 288 associations pour chaque gène) est tracée sous forme de points isolés. Les moyennes (gros points) et les déviations standard (barres noires) sont affichées pour chaque échantillon. Les lignes pointillées représentent l intervalle de précision du test (± 3 fois la précision totale du test de ± 2,34 C T (FOS) et ± 1,93 C T (IL1b)). 30 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

31 Matériel supplémentaire nécessaire Lors de la manipulation de produits chimiques, toujours porter une blouse appropriée, des gants jetables et des lunettes de sécurité. Pour plus d informations, consulter les fiches de données de sécurité (FDS) disponibles chez le fabricant du produit. Pour tous les protocoles Tubes PAXgene Blood RNA (BRT, réf ) Ethanol (96 à 100%, degré de pureté p.a.) Pipettes* (10 μl à 4 ml) Cônes de pipette stériles, exempts de RNase, avec filtre aérosol contre la contamination Cylindre gradué Centrifugeuse* à vitesse variable entre 3000 et 5000 x g équipée d un rotor à angle variable avec des godets oscillants adaptés aux tubes PAXgene Blood RNA (BRT). Mixeur Vortex* Glace broyée Stylo indélébile pour l étiquetage Pour le protocole manuel Microcentrifugeuse* à vitesse variable entre 1000 et 8000 x g avec rotor pour tubes de microcentrifugation de 2 ml Un incubateur agitateur*, pour incubation à 55 C et 65 C à vitesse variable entre 400 et 1400 tr/min (Eppendorf Thermomixer Compact ou équivalent) Pour le protocole automatisé QIAcube* (QIAGEN, réf [110 V], réf [230 V]) Consommables du QIAcube Filtres, 1000 μl (1024) (QIAGEN, réf ) Flacons de réactif, 30 ml (6) (QIAGEN, réf ) Adaptateurs pour rotor (10 x 24) (QIAGEN, réf ) * S assurer que tous les instruments sont vérifiés et calibrés régulièrement selon les recommandations du fabricant. S assurer de bien lire les indications «Remarques générales sur la préparation d ARN» (voir l annexe A à la page 56). Pour mesurer la quantité d éthanol à ajouter au concentré de tampon BR4. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

32 Accessoires du QIAcube Portoir pour flacons de réactif (QIAGEN, réf ) Support d adaptateur pour rotor (QIAGEN, réf ) Ciseaux Note importante Utilisation du QIAcube S assurer de bien connaître le fonctionnement du QIAcube. Lire le QIAcube User Manual et toutes autres informations fournies avec le QIAcube, en prêtant notamment attention aux informations de sécurité, avant de lancer les protocoles PAXgene Blood RNA automatiques. Démarrage du QIAcube Fermer la porte du QIAcube et le mettre sous tension à l aide de l interrupteur Marche/Arrêt (voir la figure 13). Un bip retentit et l écran de démarrage apparaît. L appareil réalise des tests d initialisation automatiquement. Installation des protocoles sur le QIAcube Commencer par installer un protocole avant d exécuter le premier cycle de préparation d ARN sur le QIAcube. Installer les protocoles «PAXgene Blood RNA Part A» et «PAXgene Blood RNA Part B». Les protocoles sont disponibles sur le Les télécharger sur la clé USB fournie avec le QIAcube et les transférer sur le QIAcube via le port USB. Le port USB, situé derrière l écran de protection (voir la figure 13), permet de connecter la clé USB (fournie) au QIAcube. Les fichiers de données (par ex. fichiers journaux ou fichiers de rapport) peuvent également être transférés via le port USB du QIAcube vers la clé USB. Le port USB ne doit être utilisé qu avec la clé USB fournie par QIAGEN. Ne pas connecter d autres périphériques à ce port. Ne pas retirer la clé USB pendant le téléchargement de protocoles, le transfert de fichiers de données ou l exécution d un cycle de protocole. Egalement inclus dans le Starter Pack, QIAcube (QIAGEN, réf ). 32 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

33 Vue de face du QIAcube Figure 13 Ecran tactile Porte Port série RS232 à l arrière de l écran de protection (seuls les spécialistes de maintenance des appareils QIAGEN peuvent l utiliser) Port USB à l arrière de l écran de protection Interrupteur Marche/Arrêt Poubelle PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

34 Chargement du QIAcube Pour économiser du temps, le chargement peut être réalisé pendant une étape de centrifugation de 10 minutes ou les deux (étapes 3 et 5) dans «Protocol: Automated Purification of Total RNA from Human Whole Blood Collected into PAXgene Blood RNA Tubes (BRT)», page 48. Flacons de réactif Remplir soigneusement 4 flacons avec les réactifs QIAcube répertoriés dans le tableau 3 (remplir les flacons jusqu au niveau de l indicateur). Etiqueter clairement les flacons et les couvercles avec les noms des tampons et les placer où il convient sur le portoir pour flacons de réactif (voir les figures 14 et 15). Avant chaque cycle sur le QIAcube, s assurer que les flacons de réactif sont remplis jusqu au niveau des indicateurs (les volumes restant dans les flacons de tampon du kit d origine doivent servir à remplir les flacons de réactif). Placer le portoir pour réactifs et les flacons remplis sur la table de travail du QIAcube, comme illustré (figures 14 et 15). Veiller à retirer les couvercles des flacons avant de les placer sur la table de travail. Les volumes de tampon fournis dans le kit PAXgene Blood RNA (50) sont suffisants pour un maximum de 7 préparations d ARN sur le QIAcube. Eviter de réaliser plusieurs cycles avec peu d échantillon afin de laisser des volumes de tampons suffisants pour traiter 50 échantillons complets. Tableau 3. Positions sur le portoir pour flacons de réactif Position Réactif 1 Tampon de fixation (BR2) 2 Ethanol à % 3 Tampon de lavage 1 (BR3) 4 Tampon de lavage 2 (BR4)* 5 (laisser vide) 6 (laisser vide) * Le tampon de lavage 2 (BR4) est fourni comme concentré. Avant de l utiliser pour la première fois, ajouter 4 volumes d éthanol (96 à100%, pureté p.a.) dans le flacon comme indiqué sur l étiquette pour obtenir une solution prête à l emploi. 34 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

35 Chargement du portoir pour flacons de réactif Position 1 Tampon de fixation (BR2) Position 2 Ethanol à % Bande d étiquetage Position 3 Tampon de lavage 1 (BR3) Position 4 Tampon de lavage 2 (BR4) Bande d étiquetage Position 5 Position 6 Vide Vide Figure 14 : Schéma des positions et du contenu des flacons sur le portoir pour flacons de réactif. Chargement du portoir dans le QIAcube. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

36 Vue de l intérieur du QIAcube Figure 15 Couvercle de la centrifugeuse Centrifugeuse Agitateur Portoir pour flacons de réactif Espaces pour tubes de microcentrifugation Portoirs pour cônes Espaces d élimination pour cônes et colonnes Bras robotisé Capteur de cônes 36 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

37 Colonnes de centrifugation (PRC, PSC), tubes de microcentrifugation (MCT) et matériau plastique du QIAcube Placer 2 portoirs pour cônes remplis de filtres de 1000 μl dans le QIAcube (voir la figure 15). Remplir à nouveau les portoirs avec des cônes lorsque cela s avère nécessaire. Utiliser uniquement des filtres de 1000 μl destinés à être utilisés avec le QIAcube. Etiqueter les adaptateurs pour rotor et les tubes de microcentrifugation (MCT) pour chaque échantillon à l aide d un stylo indélébile. Ouvrir les colonnes PAXgene Shredder (PSC) à utiliser et couper les couvercles à l aide de ciseaux (voir la figure 16). Pour que la pince robotisée du QIAcube fonctionne correctement, retirer (couper) les couvercles et toutes les parties en plastique la reliant aux colonnes PAXgene Shredder (PSC ; voir la figure 16). Dans le cas contraire, la pince robotisée ne peut pas saisir les colonnes (PSC, PRC) correctement. Charger la colonne PAXgene RNA (PRC), la colonne PAXgene Shredder (PSC, sans couvercle) et le tube de microcentrifugation étiqueté (MCT) dans les positions appropriées dans chaque adaptateur pour rotor étiqueté, comme illustré dans le tableau 4 et la figure 17 (page 38). S assurer que les couvercles de la colonne (PRC) et du tube de microcentrifugation (MCT) sont enfoncés sur toute leur longueur au fond des espaces, sur le bord de l adaptateur pour rotor ; dans le cas contraire, ils seront coupés pendant la centrifugation. Chargement d une colonne PAXgene Shredder (PSC) Couvercle de colonne (PSC) retiré correctement Couvercle de colonne (PSC) retiré incorrectement ; une partie est restée Figure 16 : La colonne PAXgene Shredder (PSC) est chargée dans la position du milieu. Couper le couvercle avant de charger la colonne (PSC). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

38 Tableau 4. Matériel de laboratoire dans l adaptateur pour rotor Position Matériel de laboratoire Position du couvercle 1 Colonne PAXgene RNA Spin (rouge, PRC) L1 2 Colonne PAXgene Shredder (lilas, PSC) (couper le couvercle avant de la placer dans l adaptateur pour rotor) 3 Tube de microcentrifugation (MCT)* L3 * Utiliser les tubes de microcentrifugation (1,5 ml, MCT) compris dans le kit PAXgene Blood RNA. Figure 17 : L adaptateur pour rotor possède trois positions de tube (1 à 3) et trois positions de couvercles (L1 à L3). Chargement de la centrifugeuse Charger les adaptateurs pour rotor montés dans les godets de la centrifugeuse, comme illustré dans la figure 18. Si moins de 12 échantillons sont traités, veiller à charger le rotor de la centrifugeuse de manière équilibrée radialement (voir la figure 19). Tous les godets de la centrifugeuse doivent être montés avant de lancer un cycle de protocole, même s il y a moins de 12 échantillons à traiter. Il est impossible de traiter un seul échantillon ou 11 échantillons. Chargement de la centrifugeuse Figure 18 : Charger les adaptateurs pour rotor montés dans les godets de la centrifugeuse. 38 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

39 Chargement de la centrifugeuse et de l agitateur 2 échantillons 3 échantillons 4 échantillons 5 échantillons 6 échantillons 7 échantillons 8 échantillons 9 échantillons 10 échantillons Figure 19 : Les positions de la centrifugeuse et de l agitateur sont illustrées pour le traitement de deux (2) à dix (10) échantillons. Il est impossible de traiter 1 ou 11 échantillons. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

40 Traitement des tubes (PT) Retirer les tubes de traitement (PT) laissés dans les espaces pour tubes de microcentrifugation depuis les cycles précédents (voir la figure 15, page 36). Remplir 3 tubes de traitement (PT) avec la quantité de réactif indiquée dans le tableau 5. Etiqueter les tubes (PT) clairement avec le nom des réactifs et les placer dans la position appropriée dans les espaces pour tubes de microcentrifugation, comme indiqué dans le tableau 6. Pipeter le volume indiqué de tampon de digestion d ADN (RDD) dans le tube de traitement (PT), puis ajouter le volume indiqué de solution stock DNase I (RNFD). Mélanger en pipetant doucement l ensemble du mélange de haut en bas 3 fois à l aide d un cône de 1000 μl. Utiliser les tubes de traitement de 2 ml (PT) compris dans le kit PAXgene Blood RNA. Veiller à uniquement pipeter le volume requis, indiqué dans le tableau 5. Tableau 5. Volume de réactif requis dans les tubes de traitement à placer dans les espaces pour tubes de microcentrifugation Volume de réactif requis pour le nombre indiqué d échantillons (μl) Nombre d échantillons Protéinase K (PK) Mélange d incubation de DNase I Tampon d élution (BR5) (23 DNase I [RNFD] RDD) (33 DNase I [RNFD] RDD) (42 DNase I [RNFD] RDD) (51 DNase I [RNFD] RDD) (60 DNase I [RNFD] RDD) (69 DNase I [RNFD] RDD) (78 DNase I [RNFD] RDD) (88 DNase I [RNFD] RDD) (97 DNase I [RNFD] RDD) (115 DNase I [RNFD] RDD) 1177 Tableau 6. Espaces pour tubes de microcentrifugation Position A B C Concentration Protéinase K (PK) Mélange d incubation de DNase I Tampon d élution (BR5) Tube Tube de traitement (PT)* Tube de traitement (PT)* Tube de traitement (PT)* * Utiliser les tubes de traitement de 2 ml (PT) compris dans le kit PAXgene Blood RNA. 40 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

41 Protocole : Purification manuelle d ARN total à partir de sang total humain prélevé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) Remarques préliminaires importantes Vérifier à l arrivée si le kit est intact et en ordre et si les flacons de tampon sont bien étanches. Ne pas utiliser de kit endommagé. Lors de l utilisation d une pipette, vérifier qu elle indique le bon volume et s assurer que le liquide est complètement aspiré et déposé. Afin d éviter de transférer les échantillons dans le mauvais tube ou la mauvaise colonne, vérifier que tous les tubes et toutes les colonnes de centrifugation, ainsi que les couvercles, sont correctement étiquetés. Pour les colonnes de centrifugation, étiqueter le tube de prélèvement dans lequel aura lieu l élution. Fermer chaque tube ou chaque colonne de centrifugation après y avoir transféré le liquide. Des pertes d échantillons et de tampons au cours de la procédure peuvent réduire le rendement et la pureté des ARN. Sauf indication contraire, toutes les étapes (incluant les centrifugations) seront effectuées à température ambiante (15 à 25 C). En raison de la haute sensibilité des technologies d amplification d acides nucléiques (PCR), il est nécessaire de prendre les précautions suivantes lors de la manipulation des échantillons, afin d éviter toute contamination croisée : Déposer avec précaution l échantillon sur la colonne de centrifugation (PRC, PSC) sans en mouiller le bord. Changer les cônes de pipette entre chaque étape de transfert de liquide. Utiliser des cônes à filtre. Ne pas toucher la membrane de la colonne de centrifugation (PRC, PSC) avec le cône de la pipette. Après chaque étape d homogénéisation par vortex ou de chauffage, centrifuger brièvement les tubes de microcentrifugation (MCT) afin d éviter toute contamination croisée lors de l ouverture du tube, suite à un éclaboussement des gouttelettes d échantillon accumulées dans le bouchon. Porter des gants pendant toute la procédure. En cas de contact des gants avec l échantillon, les changer immédiatement. Toujours fermer la colonne de centrifugation (PRC, PSC) avant de l installer dans la microcentrifugeuse. Centrifuger comme décrit dans le protocole. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

42 Ouvrir une seule colonne de centrifugation (PRC, PSC) à la fois et prendre garde à ne pas générer d aérosols. Pour une manipulation efficace de plusieurs échantillons en parallèle, nous recommandons de remplir un portoir avec des tubes de prélèvement dans lesquels les colonnes de centrifugation (PRC, PSC) pourront être transférées après centrifugation. Jeter les tubes utilisés contenant l effluent et placer les nouveaux tubes de traitement (PT) contenant les colonnes de centrifugation (PRC, PSC) directement dans la microcentrifugeuse. Remarques préliminaires importante Le sang doit être prélevé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) selon les instructions accompagnant la PAXgene Blood RNA Tube Product Circular. Si nécessaire, se référer à l annexe C (page 59) concernant les recommandations sur la manipulation des tubes PAXgene Blood RNA (BRT). Après prélèvement du sang, incuber le tube PAXgene Blood RNA pendant au moins 2 heures à température ambiante afin d assurer une lyse complète du sang. Les rendements peuvent être légèrement augmentés par une incubation la nuit. Si le tube PAXgene Blood RNA (BRT) a été conservé à une température comprise entre 2 et 8 C ou à 20 C ou 70 C après prélèvement du sang, l équilibrer d abord à température ambiante, puis le garder 2 heures à température ambiante avant de commencer la procédure de purification. Lire les informations de sécurité à la page 7. Lire les indications sur la manipulation de l ARN (voir l annexe A à la page 56). Vérifier que les instruments utilisés, comme les pipettes et l incubateur agitateur, sont contrôlés et calibrés régulièrement selon les recommandations du fabricant. Utiliser un incubateur agitateur aux étapes 5 et 20. Régler la température de l instrument sur 55 C. Le tampon de fixation (BR2) peut former un précipité au cours de sa conservation. Si nécessaire, le chauffer à 37 C pour le dissoudre. Le tampon de lavage 2 (BR4) est fourni concentré. Avant de l utiliser pour la première fois, ajouter 4 volumes d éthanol (96 à100%, pureté p.a.) dans le flacon comme indiqué sur l étiquette pour obtenir une solution prête à l emploi. 42 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

43 Lors de la première utilisation du RNase-Free DNase Set, préparer une solution de DNase I. Dissoudre la DNase I (RNFD ; 1500 unités Kunitz)* dans 550 μl de tampon de resuspension de la DNase (DRB) fourni dans le set. Prendre garde à ne pas perdre de DNase I (RNFD) en ouvrant le flacon. Ne pas vortexer la DNase I reconstituée (RNFD). La DNase I est particulièrement sensible à toute dénaturation physique. Mélanger la solution DNAse I en retournant et/ou en secouant doucement le tube plusieurs fois. Des données récentes montrent que la DNase I (RNFD) reconstituée reste stable jusqu à 6 semaines entre 2 et 8 C. Pour une conservation de DNase I (RNFD) de longue durée, il est recommandé de répartir la solution en aliquotes à usage unique (utiliser les tubes de microcentrifugation de 1,5 ml [MCT] fournis dans le kit ; il y en a assez pour 5 aliquotes) et les conserver jusqu à 6 mois à 20 C. Les aliquotes décongelées peuvent être conservées jusqu à 6 semaines entre 2 et 8 C. Ne pas recongeler les aliquotes après les avoir décongelées. Lors de la reconstitution ou de l'aliquotage de la DNase I (RNFD), veiller à bien suivre les remarques sur la manipulation de l ARN (annexe A, page 56). Protocole 1. Centrifuger le tube PAXgene Blood RNA (BRT) 10 min entre 3000 et 5000 x g dans un rotor à angle variable. Vérifier que les échantillons ont été incubés au moins 2 heures à température ambiante (15-25 C) dans le tube PAXgene Blood RNA (BRT) afin d assurer une lyse complète des cellules sanguines. Le rotor doit contenir des adaptateurs pour tubes à fond rond. Si d autres types d adaptateurs sont utilisés, les tubes risquent de se casser pendant la centrifugation. 2. Eliminer le surnageant en le versant ou en l aspirant à l aide d une pipette. Ajouter 4 ml d eau exempte de RNase (RNFW) sur le culot et fermer le tube avec un nouveau bouchon de sécurité Hemogard (fourni avec le kit). Si le surnageant est décanté, prendre garde à ne pas décoller le culot de la paroi du tube et sécher le bord du tube avec une serviette en papier propre. Les unités Kunitz sont souvent utilisées pour mesurer la DNase I et sont définies comme la quantité de DNase I qui provoque une augmentation de l absorbance à A 260 de 0,001 par minute et par millilitre à 25 C, ph 5,0, avec de l ADN hautement polymérisé comme substrat (Kunitz, M. (1950) J. Gen. Physiol. 33, 349 et 363). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

44 3. Resuspendre le culot en vortexant et centrifuger 10 minutes entre 3000 et 5000 x g dans un rotor à angle variable. Eliminer le surnageant aussi complètement que possible. La présence de petits débris cellulaires dans le surnageant avant centrifugation n affectera pas la procédure. Par contre une élimination incomplète du surnageant peut inhiber la lyse et diluer le lysat, affectant ainsi les conditions de fixation de l ARN sur la membrane PAXgene. 4. Ajouter 350 μl de tampon de resuspension (BR1) et mélanger au vortex jusqu à resuspension totale du culot. 5. Transférer l échantillon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml (MCT). Ajouter 300 μl de tampon de fixation (BR2) et 40 μl de protéinase K (PK). Mélanger 5 s par vortex et incuber 10 minutes à 55 C dans l incubateur agitateur, entre 400 et 1400 tr/min. Après incubation, régler la température de l incubateur agitateur à 65 C (pour l étape 20). Ne pas mélanger le tampon de fixation (BR2) et la protéinase K (PK) avant de les ajouter à l échantillon. 6. Transférer en pipetant le lysat directement sur une colonne PAXgene Shredder (PSC, lilas) placé dans un tube de réaction de 2 ml (PT) et centrifuger 3 minutes à vitesse maximale (mais ne pas dépasser les x g). A l aide d une pipette, déposer tout le lysat avec précaution sur la colonne de centrifugation (PSC) et vérifier visuellement que le lysat est complètement transféré dans la colonne (PSC). Afin de ne pas abîmer les colonnes (PSC) et les tubes de réaction (PT), ne pas dépasser x g. Certains échantillons risquent de s écouler par la colonne PAXgene Shredder (PSC) sans centrifugation. Cela est dû à la faible viscosité de certains échantillons ; ne pas le considérer comme une indication d échec du produit. 7. Transférer avec précaution la totalité du surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml (MCT) sans décoller le culot du tube d origine. 8. Ajouter 350 μl d éthanol (96 à 100%, degré de pureté p.a.). Mélanger en vortexant et centrifuger brièvement (1 à 2 s entre 500 et 1000 x g) afin d éviter toute contamination croisée lors de l ouverture du tube, suite à un éclaboussement des gouttelettes d échantillon accumulées dans le bouchon. 44 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

45 La centrifugation ne doit pas dépasser 1 à 2 s, car les acides nucléiques risquent d être culottés et de réduire le rendement en ARN. 9. A l aide d une pipette, déposer 700 μl d échantillon sur la colonne PAXgene (PRC, rouge) placée dans un tube de réaction de 2 ml (PT) et centrifuger 1 min entre 8000 et x g. Mettre ensuite la colonne PAXgene (PRC) dans un nouveau tube de réaction de 2 ml (PT) et jeter l ancien tube (PT) contenant l effluent. 10. A l aide d une pipette, déposer le reste de l échantillon sur la colonne PAXgene RNA (PRC) et centrifuger 1 min entre 8000 et x g. Mettre ensuite la colonne PAXgene (PRC) dans un nouveau tube de réaction de 2 ml (PT) et jeter l ancien tube (PT) contenant l effluent. A l aide d une pipette, déposer l échantillon avec précaution sur la colonne de centrifugation (PSC) et vérifier visuellement que l échantillon est complètement transféré dans la colonne (PSC). 11. Déposer 350 μl de tampon de lavage 1 (BR3) sur la colonne PAXgene RNA (PRC). Centrifuger 1 min entre 8000 et x g. Mettre ensuite la colonne PAXgene (PRC) dans un nouveau tube de réaction de 2 ml (PT) et jeter l ancien tube (PT) contenant l effluent. 12. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml (MCT), ajouter 10 μl de solution stock de DNase I (RNFD) à 70 μl de tampon de digestion d ADN (RDD). Mélanger en tapotant légèrement avec le doigt sur le tube et centrifuger brièvement pour récupérer les gouttelettes sur les parois du tube. Par exemple, pour traiter 10 échantillons, ajouter 100 μl de solution de DNase I (RNFD) à 700 μl de tampon de digestion d ADN (RDD). Utiliser les tubes de microcentrifugation de 1,5 ml (MCT) fournis dans le kit. La DNase I est particulièrement sensible à toute dénaturation physique. La mélanger en tapotant légèrement avec le doigt sur le tube. Ne pas vortexer. 13. Déposer le mélange d incubation de DNase I (80 μl) directement sur la membrane de la colonne PAXgene RNA (PRC) et laisser incuber 15 min entre 20 et 30 C. Vérifier que le mélange d incubation de DNase I (RNFD) déposé se trouve directement sur la membrane. La digestion de la DNase risque d être incomplète si une partie du mélange reste sur les parois ou sur l anneau de sertissage du tube (PRC). 14. Déposer 350 μl de tampon de lavage 1 (BR3) sur la colonne PAXgene RNA (PRC) et centrifuger 1 min entre 8000 et x g. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

46 Mettre ensuite la colonne PAXgene (PRC) dans un nouveau tube de réaction de 2 ml (PT) et jeter l ancien tube (PT) contenant l effluent. 15. Déposer 500 μl de tampon de lavage 2 (BR4) sur la colonne PAXgene RNA (PRC) et centrifuger 1 min entre 8000 et x g. Mettre ensuite la colonne PAXgene (PRC) dans un nouveau tube de réaction de 2 ml (PT) et jeter l ancien tube (PT) contenant l effluent. Le tampon de lavage 2 (BR4) est fourni comme concentré. Vérifier que l éthanol a bien été ajouté au tampon (BR4) avant la première utilisation (voir «Remarques préliminaires importantes», page 42). 16. Ajouter une nouvelle fois 500 μl de tampon de lavage 2 (BR4) à la colonne PAXgene RNA. Centrifuger 3 min entre 8000 et x g. 17. Jeter le tube de traitement (PT) contenant l effluent et placer la colonne PAXgene RNA (PRC) dans un nouveau tube de traitement (PT) de 2 ml. Centrifuger 1 min entre 8000 et x g. 18. Jeter le tube de réaction (PT) contenant l effluent. Placer la colonne PAXgene RNA (PRC) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml (MCT) et déposer 40 μl de tampon d élution (BR5) directement sur la membrane de la colonne PAXgene RNA (PRC). Centrifuger 1 min entre 8000 et x g afin d éluer l ARN. Il est très important d humidifier complètement la membrane avec le tampon d élution (BR5) afin d assurer une meilleure efficacité de l élution. 19. Répéter l étape d élution (étape 18) comme décrit avec 40 μl de tampon d élution (BR5) et le même tube de microcentrifugation (MCT). 20. Incuber l éluat 5 min à 65 C dans l incubateur agitateur (de l étape 5) sans agitation. Après incubation, le mettre directement dans la glace. Cette incubation à 65 C dénature les ARN pour les applications ultérieures. Ne pas prolonger le temps d incubation ni augmenter la température. 21. Si les échantillons d ARN ne sont pas utilisés immédiatement, les conserver à 20 C ou 70 C. Comme l ARN reste dénaturé après plusieurs cycles de congélation/décongélation, il n est pas nécessaire de répéter l incubation à 65 C. Si les échantillons d ARN sont utilisés dans un test diagnostic, suivre les instructions du fabricant. Afin d obtenir une quantification d ARN précise et fiable en mesurant l absorbance à 260 nm, il est recommandé de diluer l échantillon avec du Tris-Cl 10 mm (ph 7,5).* Les valeurs risquent d être imprécises ou diminuées si l échantillon est dilué avec de l eau exempt de RNase. Utiliser 46 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

47 lors de la mise à zéro du spectrophotomètre le même tampon que pour la dilution de l ARN et ajouter un volume de tampon d élution (BR5) équivalent au volume d ARN élué. Le tampon d élution (BR5) présente une forte absorbance à 220 nm, pouvant induire un bruit de fond trop élevé des valeurs d absorbance si le zéro du spectrophotomètre n est pas convenablement calibré. Remarque : Pour la quantification dans le tampon Tris, utiliser la relation A 260 = 1 => 44 μg/ml. Se référer à l annexe B, page 57. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

48 Protocole : Purification automatique d ARN total à partir de sang total humain prélevé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) Remarques préliminaires importantes Vérifier à l arrivée si le kit est intact et en ordre et si les flacons de tampon sont bien étanches. Ne pas utiliser de kit endommagé. Lors de l utilisation d une pipette, vérifier qu elle indique le bon volume et s assurer que le liquide est complètement aspiré et déposé. Pour éviter de transférer les échantillons dans les mauvais tubes et consommables en plastique, vérifier que tous les tubes de traitement (PT), tubes de microcentrifugation (MCT) et adaptateurs pour rotor sont correctement étiquetés à l aide d un stylo indélébile. Etiqueter le couvercle et le corps de chaque tube de microcentrifugation (MCT), le corps de chaque tube de traitement (PT) et la paroi extérieure de chaque adaptateur pour rotor. Des pertes d échantillons et de tampons au cours de la procédure peuvent réduire le rendement et la pureté des ARN. Sauf indication contraire, toutes les étapes (incluant les centrifugations) seront effectuées à température ambiante (15 à 25 C). En raison de la haute sensibilité des technologies d amplification d acides nucléiques (PCR), il est nécessaire de prendre les précautions suivantes lors de la manipulation des échantillons, afin d éviter toute contamination croisée : Pipeter avec précaution l échantillon au fond du tube de traitement (PT), sans humidifier le bord. Changer les cônes de pipette entre chaque étape de transfert de liquide. Utiliser des cônes à filtre. Ne pas toucher la membrane de la colonne de centrifugation (PRC, PSC) avec le cône de la pipette. Après chaque étape d homogénéisation par vortex ou de chauffage, centrifuger brièvement les tubes de microcentrifugation (MCT) afin d éviter toute contamination croisée lors de l ouverture du tube, suite à un éclaboussement des gouttelettes d échantillon accumulées dans le bouchon. Porter des gants pendant toute la procédure. En cas de contact des gants avec l échantillon, les changer immédiatement. 48 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

49 Remarques préliminaires importante Le sang doit être prélevé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) selon les instructions accompagnant la PAXgene Blood RNA Tube Product Circular. Si nécessaire, se référer à l annexe C (page 59) concernant les recommandations sur la manipulation des tubes PAXgene Blood RNA (BRT). Après prélèvement du sang, incuber le tube PAXgene Blood RNA pendant au moins 2 heures à température ambiante afin d assurer une lyse complète du sang. Les rendements peuvent être légèrement augmentés par une incubation la nuit. Si le tube PAXgene Blood RNA (BRT) a été conservé à une température comprise entre 2 et 8 C ou à 20 C ou 70 C après prélèvement du sang, l équilibrer d abord à température ambiante, puis le garder 2 heures à température ambiante avant de commencer la procédure de purification. Lire les informations de sécurité à la page 7. Lire les «Remarques importantes», pages Lire les indications sur la manipulation de l ARN (voir l annexe A à la page 56). Lire le QIAcube User Manual et toutes autres informations fournies avec le QIAcube en prêtant particulièrement attention aux informations de sécurité. Vérifier que les instruments utilisés, comme les pipettes et le QIAcube, sont vérifiés et calibrés régulièrement selon les recommandations du fabricant. Le tampon de fixation (BR2) peut former un précipité au cours de sa conservation. Si nécessaire, le chauffer à 37 C pour le dissoudre. Le tampon de lavage 2 (BR4) est fourni concentré. Avant de l utiliser pour la première fois, ajouter 4 volumes d éthanol (96 à100%, pureté p.a.) dans le flacon, comme indiqué sur l étiquette, pour obtenir une solution prête à l emploi. Lors de la première utilisation du RNase-Free DNase Set, préparer une solution de DNase I. Dissoudre la DNase I (RNFD ; 1500 unités Kunitz)* dans 550 μl de tampon de resuspension de la DNase (DRB) fourni dans le set. Prendre garde à ne pas perdre de DNase I (RNFD) en ouvrant le flacon. Ne pas vortexer la DNase I reconstituée (RNFD). La DNase I est particulièrement sensible à toute dénaturation physique. Mélanger la solution DNAse I en retournant et/ou en secouant doucement le tube plusieurs fois. * Les unités Kunitz sont souvent utilisées pour mesurer la DNase I et sont définies comme la quantité de DNase I qui provoque une augmentation de l absorbance à A 260 de 0,001 par minute et par millilitre à 25 C, ph 5,0, avec de l ADN hautement polymérisé comme substrat (Kunitz, M. (1950) J. Gen. Physiol. 33, 349 et 363). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

50 Des données récentes montrent que la DNase I (RNFD) reconstituée reste stable jusqu à 6 semaines entre 2 et 8 C. Pour une conservation de DNase I (RNFD) de longue durée, il est recommandé de répartir la solution en aliquotes à usage unique (utiliser les tubes de microcentrifugation de 1,5 ml [MCT] fournis dans le kit ; il y en a assez pour 5 aliquotes) et les conserver jusqu à 6 mois à 20 C. Les aliquotes décongelées peuvent être conservées jusqu à 6 semaines entre 2 et 8 C. Ne pas recongeler les aliquotes après les avoir décongelées. Lors de la reconstitution et de l aliquotage de la DNase I (RNFD), veiller à bien suivre les remarques sur la manipulation de l ARN (annexe A, page 56). Installer l adaptateur pour agitateur qui convient (fourni avec le QIAcube ; utiliser l adaptateur pour tubes safe-lock de 2 ml marqués par un «2») et placer le portoir de l agitateur en haut de l adaptateur. Vérifier la poubelle et la vider si nécessaire. Installer les protocoles si cela n a pas encore été fait au cours des cycles précédents. Installer les protocoles «PAXgene Blood RNA Part A» et «PAXgene Blood RNA Part B». Voir «Installation des protocoles sur le QIAcube», page 32. Protocole 1. Fermer la porte du QIAcube et le mettre en marche à l aide de l interrupteur Marche/Arrêt (voir la figure 13, page 33). Un bip retentit et l écran de démarrage apparaît. L appareil réalise des tests d initialisation automatiquement. 2. Ouvrir la porte du QIAcube et charger les réactifs nécessaires, ainsi que le matériel en plastique dans le QIAcube. Voir «Chargement du QIAcube» pages Pour économiser du temps, le chargement peut être réalisé pendant une étape de centrifugation de 10 minutes ou les deux (étapes 3 et 5). 3. Centrifuger le tube PAXgene Blood RNA (BRT) 10 min entre 3000 et 5000 x g dans un rotor à angle variable. Vérifier que les échantillons ont été incubés au moins 2 heures à température ambiante (15-25 C) dans le tube PAXgene Blood RNA (BRT) afin d assurer une lyse complète des cellules sanguines. Le rotor doit contenir des adaptateurs pour tubes à fond rond. Si d autres types d adaptateurs sont utilisés, les tubes risquent de se casser pendant la centrifugation. 4. Eliminer le surnageant en le versant ou en l aspirant à l aide d une pipette. Ajouter 4 ml d eau exempte de RNase (RNFW) sur le culot et 50 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

51 fermer le tube avec un nouveau bouchon de sécurité Hemogard (fourni avec le kit). Si le surnageant est décanté, prendre garde à ne pas décoller le culot de la paroi du tube et sécher le bord du tube avec une serviette en papier propre. 5. Resuspendre le culot en vortexant et centrifuger 10 min entre 3000 et 5000 x g dans un rotor à angle variable. Eliminer le surnageant aussi complètement que possible. La présence de petits débris cellulaires dans le surnageant avant centrifugation n affectera pas la procédure. Par contre une élimination incomplète du surnageant peut inhiber la lyse et diluer le lysat, affectant ainsi les conditions de fixation de l ARN sur la membrane PAXgene. 6. Ajouter 350 μl de tampon de resuspension (BR1) et mélanger au vortex jusqu à resuspension totale du culot. 7. Transférer l échantillon dans un tube de traitement de 2 ml (PT). Utiliser les tubes de microcentrifugation de 2 ml (PT) compris dans le kit PAXgene Blood RNA. 8. Charger les tubes de traitement (PT) ouverts contenant l échantillon dans l agitateur du QIAcube (voir la figure 15, page 36). Les positions des échantillons sont numérotées pour faciliter leur chargement. Insérer les broches du portoir de l agitateur (fournies avec le QIAcube) dans les espaces, sur les bords du portoir de l agitateur, à côté de chaque tube de traitement. Cela permet de détecter les échantillons pendant le contrôle de chargement. Vérifier que l adaptateur pour agitateur (2 ml, tubes safe-lock, marqués par un «2», fournis avec le QIAcube) est le bon. Si moins de 12 échantillons sont traités, veiller à charger le portoir de l agitateur comme illustré en figure 19, page 39. Il est impossible de traiter 1 ou 11 échantillons. 9. Fermer la porte de l appareil QIAcube (voir la figure 13, page 33). 10. Sélectionner le protocole «PAXgene Blood RNA Part A» et le lancer. Suivre les instructions fournies à l écran du QIAcube. S assurer que les deux parties du programme (A et B) sont installées sur l appareil QIAcube (voir «Installation des protocoles sur le QIAcube», page 32). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

52 Le QIAcube réalise des contrôles de chargement des échantillons, des cônes, des adaptateurs pour rotor et des flacons de réactif. 11. Une fois le protocole «PAXgene Blood RNA Part A» terminé, ouvrir la porte de l appareil QIAcube (voir la figure 13, page 33). Retirer et éliminer les colonnes de centrifugation d ARN PAXgene (PRC) des adaptateurs pour rotor et retirer les tubes de traitement (PT) de l agitateur. Au cours du cycle, l appareil transfère les colonnes de centrifugation de la position 1 de l adaptateur pour rotor (position du couvercle L1) à la position 3 (L2) (voir la figure 17, page 38). 12. Fermer les couvercles de tous les tubes de microcentrifugation (MCT) de 1,5 ml contenant l ARN purifié dans les adaptateurs pour rotor (position 3, position du couvercle L3, voir la figure 17, page 38). Transférer les tubes de microcentrifugation (MCT) de 1,5 ml dans l adaptateur pour agitateur du QIAcube (voir la figure 15, page 36). 13. Fermer la porte de l appareil QIAcube (voir la figure 13, page 33). 14. Sélectionner le protocole «PAXgene Blood RNA Part B» et le lancer. Suivre les instructions fournies à l écran du QIAcube. Ce programme incube les échantillons à 65 C et dénature les ARN pour les applications ultérieures. Même si l application en aval inclut une étape de dénaturation à la chaleur, ne pas ignorer cette étape. Une dénaturation des ARN suffisante est essentielle pour obtenir une efficacité optimale des applications en aval. 15. Une fois le programme «PAXgene Blood RNA Part B» terminé, ouvrir la porte de l appareil QIAcube (voir la figure 13, page 33). Placer les tubes de microcentrifugation (MCT) contenant les ARN purifiés immédiatement dans de la glace. AVERTISSEMENT Surface brûlante L agitateur peut atteindre des températures allant jusqu à 70 C. Eviter de le toucher lorsqu il est chaud. Ne pas laisser les ARN purifiés dans le QIAcube. Dans la mesure où les échantillons ne sont pas refroidis, les ARN purifiés peuvent se dégrader. Il est généralement déconseillé de laisser des cycles de préparation des échantillons au repos toute la nuit. 16. Si les échantillons d ARN ne sont pas utilisés immédiatement, les conserver à 20 C ou 70 C. Dans la mesure où l ARN reste dénaturé après des congélations/décongélations répétées, il est inutile de recommencer le protocole d incubation à la chaleur («PAXgene Blood RNA Part B»). 52 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

53 Pour la quantification dans le tampon Tris, utiliser la relation A 260 = 1 => 44 μg/ml. Se référer à l annexe B, page Retirer le portoir de flacons de réactif de la table de travail du QIAcube (voir la figure 15, page 36), puis fermer tous les flacons à l aide des couvercles présentant l étiquetage correspondant. Le tampon présent dans les flacons peut être conservé à température ambiante (15 25 C) jusqu à 3 mois. Retirer et éliminer les réactifs restant dans les tubes de traitement (PT), dans les espaces pour tubes de microcentrifugation du QIAcube (voir la figure 15, page 36). Retirer et éliminer les adaptateurs pour rotor de la centrifugeuse (voir la figure 15, page 36). Vider la poubelle du QIAcube (voir la figure 13, page 33). Fermer la porte de l appareil QIAcube et l arrêter à l aide de l interrupteur Marche/Arrêt (voir la figure 13, page 33). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

54 Résolution des principaux problèmes rencontrés (Troubleshooting) Ce guide de résolutions de principaux problèmes rencontrés peut aider à répondre à certaines questions. Les scientifiques du Support Technique QIAGEN sont toujours heureux de répondre aux questions portant sur les informations et le protocole de ce manuel (voir à la page 63 ou consulter le pour savoir à qui s adresser). ARN dégradé Contamination par RNases Faible rendement en ARN a) Moins de 2,5 ml de sang ont été collectés dans le tube PAXgene Blood RNA (BRT) b) Concentration de l ARN mesurée dans de l eau c) Débris cellulaire transféré dans la colonne PAXgene RNA (PRC) aux étapes 9 et 10 du protocole manuel d) Le surnageant n a pas été entièrement éliminé à l étape 3 Commentaires et suggestions Veiller à ne pas contaminer les RNases réactifs avec des RNases tout au long de la procédure de purification ou des analyses ultérieures (voir l annexe A, page 56). S assurer que 2,5 ml de sang sont prélevés dans le tube PAXgene Blood RNA (BRT ; se référer à la PAXgene Blood RNA Tube Product Circular). La concentration en ARN doit être mesurée dans du Tris-Cl 10 mm, ph 7,5* pour une quantification exacte (se référer à l annexe B, page 57). Eviter de transférer de larges particules au moment de pipeter le surnageant après l étape 7 du protocole manuel (le transfert des petits débris flottant dans le surnageant n affectera pas la procédure). S assurer que tout le surnageant est éliminé. S il est décanté, supprimer les gouttes du bord du tube (BRT) en le tapotant doucement avec une serviette en papier. Prendre les précautions appropriées afin d éviter tout risque de contamination croisée. * Lors de la manipulation de produits chimiques, toujours porter une blouse appropriée, des gants jetables et des lunettes de sécurité. Pour plus d informations, consulter les fiches de données de sécurité (FDS) disponibles chez le fabricant du produit. 54 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

55 e) Après prélèvement dans le tube PAXgene Blood RNA, (BRT), le sang a été incubé pendant moins de 2 heures Commentaires et suggestions Incuber le sang dans le tube PAXgene Blood RNA (BRT) au moins 2 heures après prélèvement. Faible ratio A 260 /A 280 a) L ARN a été dilué dans de l eau avant de mesurer sa pureté b) Le spectrophotomètre n est pas correctement mis à zéro Utiliser du Tris-Cl 10 mm, ph 7,5 pour diluer les ARN avant de mesurer leur pureté* (se référer à l annexe B, page 57). Pour la mise à zéro du spectrophotomètre, utiliser un échantillon «blanc» dont la composition en tampon d élution (BR5) et en tampon de dilution est équivalente à celle des échantillons. Le tampon d élution (BR5) présente une forte absorbance à 220 nm, pouvant induire un bruit de fond trop élevé des valeurs d absorbance si le zéro du spectrophotomètre n est pas convenablement remis à zéro. Dysfonctionnement de l appareil Le QIAcube fonctionne mal Lire le QIAcube User Manual, en prêtant particulièrement attention à la section Résolution des principaux problèmes rencontrés. S assurer que le QIAcube est correctement entretenu, comme expliqué dans le QIAcube User Manual. * Wilfinger, W.W., Mackey, M., and Chomczynski, P. (1997) Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22, 474. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

56 Annexe A : Remarques générales sur la manipulation des ARN Manipulation de l ARN Les ribonucléases (RNases) sont des enzymes très stables et très actives qui ne nécessitent généralement pas de cofacteurs pour être activées. Comme les RNases sont difficiles à inactiver et que de très petites quantités d enzyme suffisent à détruire les ARN, ne pas utiliser de matériel en plastique ou en verre sans le traiter au préalable contre une contamination possible par les RNases. Prendre garde de ne pas introduire par inadvertance des RNases dans l échantillon d ARN tout au long ou après la préparation. Afin de créer et de maintenir un environnement exempt de RNase, il est important de prendre les précautions suivantes au cours du prétraitement et de l utilisation des récipients jetables ou non jetables et des solutions. Manipulation générale Lors de la préparation des ARN, toujours respecter les principes de techniques aseptiques de microbiologie. Les mains et les particules de poussière peuvent être porteuses de bactéries et de champignons et sont la source la plus fréquente de contaminations par les RNases. Toujours porter des gants en latex ou en vinyle pour travailler avec des réactifs et des échantillons d ARN afin d éviter une contamination par les RNases par la peau ou par l équipement de laboratoire poussiéreux. Changer souvent de gants et fermer les tubes immédiatement après usage. Garder les ARN purifiés dans la glace si des aliquotes sont préparées pour les applications ultérieures. Des protocoles d élimination des RNases du matériel en verre ou dans les solutions sont disponibles dans des guides généraux de biologie moléculaire comme Sambrook, J. et al., eds. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 56 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

57 Annexe B : Quantification et détermination de la qualité de l ARN total Quantification de l ARN Les concentration et rendement en ARN doivent être déterminés par mesure photométrique de l absorbance à 260 nm (A 260 ) dans un spectrophotomètre. Afin d obtenir une mesure des plus précises, les valeurs doivent se trouver dans l intervalle linéaire du spectrophotomètre. Une unité d absorbance à 260 nm correspond à une concentration de 44 μg d ARN par ml (A 260 = 1 => 44 μg/ml). Cette relation est uniquement valable pour les mesures réalisées avec du Tris-Cl*,10 mm, ph 7,5. Il est donc nécessaire de diluer l échantillon d ARN avec du Tris-Cl 10mM. Comme expliqué ci-dessous (voir «Pureté de l ARN» à la page 58), le rapport entre les valeurs d absorbance à 260 et 280 nm donne une mesure de la pureté de l ARN. Lors de la mesure des échantillons d ARN, s assurer que les cuvettes sont exemptes de RNase. Lors de la mise à zéro du spectrophotomètre, utiliser le même tampon que pour la dilution de l ARN et ajouter un volume de tampon d élution (BR5) équivalent au volume d ARN élué. Le tampon d élution (BR5) présente une forte absorbance à 220 nm, pouvant induire un bruit de fond trop élevé des valeurs d absorbance si le zéro du spectrophotomètre n est pas convenablement remis à zéro. Exemple d un calcul de concentration et de rendement en ARN : Volume de l échantillon d ARN = 80 μl Dilution = 10 μl de l échantillon d ARN μl Tris-Cl 10 mm, ph 7,5 (Dilution 1/15) Mesure d absorbance de l échantillon dilué dans une cuvette exempte de RNase. A 260 = 0,3 Concentration de l échantillon d ARN = 44 x A 260 x facteur de dilution = 44 x 0,3 x 15 = 198 μg/ml Rendement total = concentration x volume de l échantillon en ml = 198 μg/ml x 0,08 ml = 15,8 μg RNA * Lors de la manipulation de produits chimiques, toujours porter une blouse appropriée, des gants jetables et des lunettes de sécurité. Pour plus d informations, consulter les fiches de données de sécurité (FDS) disponibles chez le fabricant du produit. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

58 Pureté de l ARN Le rapport des valeurs d absorbance à 260 nm et 280 nm (A 260 /A 280 ) donne une mesure estimée de la pureté de l ARN par rapport aux contaminants absorbant les UV (par ex. la protéine). Le ratio A 260 /A 280 est toutefois considérablement influencé par le ph. Les rapports A 260 /A 280 et la sensibilité par rapport à la contamination par les protéines sont réduits en présence de ph relativement bas*. Pour obtenir des valeurs exactes et fiables, nous recommandons de mesurer l absorbance dans du Tris-Cl 10 mm, ph 7,5. L ARN pur a un rapport A 260 /A 280 entre 1,8 et 2,2 dans du Tris-Cl 10mM, ph 7,5. Lors de la mise à zéro du spectrophotomètre, utiliser le même tampon que pour la dilution de l ARN et ajouter un volume de tampon BMR5 équivalent au volume d ARN élué. Le tampon BMR5 présente une forte absorbance à 220 nm, pouvant induire un bruit de fond trop élevé des valeurs d absorbance si le zéro du spectrophotomètre n est pas convenablement calibré. * Wilfinger, W.W., Mackey, M., and Chomczynski, P. (1997) Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22, PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

59 Annexe C : Manipulation des tubes PAXgene Blood RNA Les recommandations suivantes de BD peuvent aider à manipuler les tubes PAXgene Blood RNA (BRT). Pour plus d information sur l utilisation des tubes PAXgene Blood RNA (BRT), se référer à la description PAXgene Blood RNA Tube Product Circular. Instructions pour retirer le bouchon BD Hemogard 1. Tenir le tube PAXgene Blood RNA (BRT) dans une main et placer le pouce directement sous le bouchon BD Hemogard (pour plus de stabilité, poser le bras sur une surface solide). Avec l autre main, tourner le bouchon BD Hemogard tout en poussant vers le haut avec le pouce JUSQU A CE QUE LE BOUCHON DU CAOUTCHOUC SOIT DESSERRE. 2. Retirer le pouce avant de soulever le bouchon. NE PAS pousser le bouchon avec le pouce pour finir d ouvrir le tube. Attention : si le tube (BRT) contient du sang, il y a une possibilité d exposition à un risque biologique. Afin de prévenir tout risque de blessures pendant l ouverture du tube, il est important que le pouce utilisé pour soulever le bouchon soit retiré du tube (BRT) dès que le bouchon BD Hemogard est desserré. 3. Retirer le bouchon du tube (BRT). Dans le rare cas où la partie en plastique se détache du bouchon en caoutchouc, NE PAS LE REASSEMBLER. Retirer avec précaution le bouchon en caoutchouc du tube (BRT). Instructions pour la pose du bouchon secondaire (Secondary BD Hemogard Closure) 1. Placer le bouchon sur le tube (BRT). 2. Tourner le bouchon en poussant fermement sur le tube. Il est nécessaire que le bouchon soit complètement enfoncé afin de permettre une manipulation sans risque des tubes. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

60 Pour commander Produit Description Référence Système PAXgene Blood RNA Produits pouvant être commandés chez QIAGEN PAXgene Blood RNA Kit (50) 50 Colonnes PAXgene RNA, 50 Colonnes PAXgene Spin, Tubes de traitement, DNase I exempt de RNase Réactifs et tampons exempts de RNase. A utiliser avec les tubes PAXgene Blood RNA QIAcube (110 V)* QIAcube (230 V) Garantie PLUS 2 complète, QIAcube Starter Pack, QIAcube Poste de travail robotisé pour la purification automatique de l ADN, de l ARN ou de protéines à l aide des kits de colonnes de centrifugation QIAGEN, garantis un ans pièces et main d œuvre Garantie de 3 ans, réponse prioritaire sous 48 heures (deux jours ouvrés), tout travail, déplacement ou réparation des pièces Packs inclus : portoirs de flacons de réactif (3), bandes d étiquetage des portoirs (8), filtres de 200 μl (1 024), filtres de 1000 μl (1024), filtres de 1000 μl, grand diamètre (1024), flacons de réactif de 30 ml (18), adaptateurs pour rotor (240), support d adaptateur pour rotor * Filtres, 1000 μl (1024) Filtres jetables stériles, sur portoirs Flacons de réactif, 30 ml (6) Flacons de réactif (30 ml) avec couvercles, pack de 6 à utiliser avec le portoir pour flacons de réactif du QIAcube * Etats-Unis, Canada et Japon. Reste du monde. Ces accessoires pour le prélèvement du sang sont des produits courants qui peuvent être utilisés avec les tubes PAXgene Blood RNA. Pour en savoir plus et pour savoir comment les commander, consulter le 60 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

61 Produit Description Référence Adaptateurs pour rotor (10 x 24) Pour 240 préparations : 240 adaptateurs pour rotor jetables à utiliser avec le QIAcube Portoir pour flacons de réactif Support d adaptateur pour rotor Portoir destiné à accueillir 6 flacons de réactif de 30 ml sur la table de travail du QIAcube Support pour 12 adaptateurs pour rotor jetables à utiliser avec le QIAcube Produits pouvant être commandés chez BD et chez les distributeurs autorisés BD PAXgene Blood RNA Tubes (100) 100 Tubes de prélèvement sanguin. A utiliser avec le kit PAXgene Blood RNA (50) Set de prélèvement sanguin BD Vacutainer ; corps à usage unique BD Vacutainer Plus Serum Tubes BD Vacutainer Safety-Lok Set de prélèvement sanguin : adaptateur aiguille de 0,75 pouces 21G, Tubulures de 30 cm avec luer ; 50 par boîte, 200 par carton Corps seulement pour diamètre de 13 mm et 16 mm ; 1000/carton Tubes 13 x 75 mm 4,0 ml de vide avec bouchon BD Hemogard rouge et étiquette papier ; 100/boîte, 1000/carton PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

62 Page volontairement blanche 62 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

63 PreAnalytiX dans le monde Les produits PreAnalytiX sont commercialisés par QIAGEN et les sociétés BD Australia Orders Fax Technical Austria Orders 0800/ Fax 0800/ Technical 0800/ Belgium Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Germany Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) Australia BD North Ryde Orders Fax Belgium BD Erembodegem Orders Fax Canada BD Oakville Orders Fax Poland BD Warsaw Orders Fax USA BD Diagnostics Preanalytical Systems 1 Becton Drive Franklin Lakes NJ Orders Fax Technical support PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/

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