Introduction à l Algorithmique et la Programmation feuille de Projet Alignement de Séquences

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1 Introduction à l Algorithmique et la Programmation feuille de Projet Alignement de Séquences Le thème de ce projet est l alignement de séquences. Il permet d illustrer comment les principes algorithmiques et de programmation que nous avons abordés durant les cours peuvent être appliqués en utilisant le langage Python pour l analyse et l exploitation de données biologiques. Lorsque deux protéines ont des séquences d acides aminés similaires, on peut supposer qu elles adoptent la même forme (structure) en solution. C est ainsi l indication qu elles jouent le même rôle (qu elles ont la même fonction) dans la cellule. Cette similarité de séquence découle généralement du fait que ces protéines ont divergé à partir d une protéine ancestrale commune (on dit aussi qu elles sont homologues). Ainsi, la mise en correspondance (l alignement) de plusieurs séquences et l identification des portions de ces séquences qui sont conservées permet d identifier des domaines ou des motifs fonctionnels (par exemple impliqués dans une réaction catalytique ou dans la reconnaissance de partenaires cellulaires). Partie 1 : Alignement global de deux séquences L alignement de deux séquences consiste à décider de la manière optimale de les mettre l une en face de l autre. Par exemple pour les deux séquences S 1 =LALMEE et S 2 =LAME on pourrait les aligner de la manière suivante : LALMEE LA-M-E Chaque caractère - introduit dans S 2 correspond au fait qu il y a insertion de 1 caractère dans S 1 en l alignant avec S 2 (ici un L et un E). On note - un gap. On substitue donc S 1 et S 2 à S 1 et S 2 en rajoutant des caractères de gap le long de la séquence (ici S 1 =LALMEE et S 2 =LA-M-E). S 1 et S 2 sont de même longueur ( S 1 = S 2 ). Score d alignement On définit un score de l alignement entre les séquences modifiées S 1 et S 2 : S 1 score( S 1, S 2 ) = σ( s 1 i, s 2 i ) où σ( s 1 i, s2 i ) désigne le score d appariement des iè caractères de S 1 et S 2. Pour simplifier, on considère trois types d appariements associés à trois scores différents : σ match = σ(a, a) ; σ mis = σ(a, b) pour a b ; et σ gap = σ(a, ) = σ(, a). (Le coût σ match est généralement nul ou positif alors que les coûts de substitution σ mis et σ gap sont négatifs) Déterminer le meilleur alignement entre S 1 et S 2, consiste donc à déterminer au moins deux séquences S 1 et S 2 qui ont le meilleur score d alignement. i=1 1

2 Exercice - 1 Mise en route On considère un alignement ( S 1, S 2 ) de 2 séquences S 1 et S Montrer que le score associé à cet alignement, peut s écrire en fonction du nombre de matches (lettres identiques) n match, du nombre de mismatches (lettres différentes) n mis et du nombre d insertions ou gaps n gap avec la formule suivante : score( S 1, S 2 ) = σ match n match + σ mis n mis + σ gap n gap (1) Exercice - 2 Combinatoire d un alignement Soit 2 séquences S 1 et S 2, de même longueur l. Pour les aligner, une possibilité est de tester tous les alignements de toutes les sous-séquences de S 1 et S 2. C est ce que fait l algorithme d alignement suivant : Declaration: i,score, scoremax : Entier debut scoremax pour i 0 a l faire pour toutes les sous-séquences P 1 de S 1 de longueur i, faire pour toutes les sous-séquences P 2 de S 2 de longueur i, faire aligner S 1 et S 2 en mettant P 1 et P 2 en face l une de l autre calculer le score de l alignement si score > scoremax alors scoremax score finsi finpour finpour finpour ecrire("le meilleur alignement a pour score",smax) fin 1- Appliquez l algorithme aux séquences LEO et LIE. Quelle est le meilleur alignement et que vaut son score? On fixe σ match = 0, σ mis = 1 et σ gap = Quelle est la longueur maximale d un alignement pour deux séquences de longueur l? 3- Combien y a-t-il de sous séquences de longueur i dans une séquence de longueur l? 4- Pour une longueur i donnée, combien y a-t-il de résidus en face d un autre résidu et de résidus en face de gaps? Quelle est la complexité de l étape du calcul du score? 5- Quelle est la complexité de l algorithme? Est-ce qu elle varie en fonction des séquences à aligner, pour une longueur l donnée? Qu en déduisez-vous quant à l applicabilité de cet algorithme? UPMC - Licence Biologie Mathématiques 2

3 Exercice - 3 Manipulation de séquences Le format classique utilisé pour manipuler les séquences nucléiques (ADN) ou protéiques est le format FASTA. Une séquence de ce format comporte une ligne de description commençant par un ">" puis les lignes de la séquence. On atteint la fin d une séquence soit lorsqu on atteint la fin du fichier, soit lorsqu une autre séquence commence (ligne commençant par un ">"). Exemple de séquence au format fasta : > sp P62158 CALM_ HUMAN Calmodulin OS = Homo sapiens GN = CALM1 PE =1 SV =2 MADQLTEEQIAEFKEAFSLFDKDGDGTITTKELGTVMRSLGQNPTEAELQDMINEVDADG NGTIDFPEFLTMMARKMKDTDSEEEIREAFRVFDKDGNGYISAAELRHVMTNLGEKLTDE EVDEMIREADIDGDGQVNYEEFVQMMTAK 1- Ecrivez une fonction readfasta permettant de lire un fichier au format FASTA contenant une séquence. La fonction devra retourner la séquence lue sous la forme d une chaîne de caractères. 2- Ecrivez une fonction readfastamul permettant de lire un fichier au format FASTA contenant plusieurs séquences et qui retourne la liste des tuples (nom, sequence), le nom étant la ligne de description sans le ">". 3- Ecrivez une fonction dotplot permettant de représenter le degré d identité entre deux séquences S 1 et S 2 sous forme d une matrice. La fonction prendra en argument un fichier au format FASTA contenant deux séquences. Elle affichera une matrice, avec la première séquence S 1 en ligne et la deuxième séquence S 2 en colonne. Chaque case (i, j) de la matrice sera : laissée vide si les deux caractères s 1 i et s2 j sont différents remplie par le symbole * si les deux caractères s 1 i et s2 j sont identiques. Vous pourrez tester votre algorithme sur les séquences MADKRLQKQIAEKRVQK et MNGTKRLQKMMAIV. Exercice - 4 Alignement de 2 séquences par programmation dynamique Pour aligner 2 séquences efficacement, on aura recours à l algorithme de Needleman et Wunsch (NWS) qui utilise la technique de la programmation dynamique. Il s agit de remarquer que le meilleur alignement peut se calculer de manière récursive sur les deux séquences à aligner : le meilleur alignement entre deux séquences de longueurs i et j dépend du meilleur alignement pour les sous-séquences qui le composent, et du type d appariement (match, insertion ou délétion) à la position (i, j). Cet algorithme se décrit récursivement de la façon suivante : soient deux séquences A et B de longueurs respectives m et n, on note les séquences par les suites de résidus A = (a 1,..., a n ) et B = (b 1,..., b m ). Soit S i,j le score maximum entre les deux séquences alignées à partir des résidus a 1 et b 1 jusqu aux résidus a i et b j. Pour i 1 et j 1, S i,j peut se calculer à partir de l équation récursive suivante : S i 1,j 1 + σ(a i, b j ) diagonale, pas d indel S i,j = max S i 1,j + σ(a i, ) horizontale, insertion dans A (2) S i,j 1 + σ(, b j ) verticale, insertion dans B Si les scores calculés sont égaux, on choisit en général la substitution plutôt que l insertion. On peut représenter l alignement comme un chemin dans une matrice avec la séquence A en ligne et UPMC - Licence Biologie Mathématiques 3

4 la séquence B en colonne. Chaque cellule i, j de la matrice contient le score S i,j. La cellule en bas à droite n, m contient le score S n,m de l alignement optimal des 2 séquences. 1- Initialisation de la récursion La définition pour S i,j ci dessus ne prend pas en compte les cas d initialisation avec i = 0 ou j = 0 (ou les deux). Donnez les conditions d initialisation pour S 0,0, S i,0 et S 0,j. Vous pouvez vous aider de la question suivante pour faire l initialisation. 2- Application Aligner les séquences LEON et LIE à la main, en appliquant l algorithme de NWS et en représentant l alignement sous forme d une matrice. On fixe σ match = 0, σ mis = 1 et σ gap = Version récursive simple Ecrivez une fonction récursive NWSRecur qui détermine l alignement optimal de 2 séquences par l algorithme NWS. Cette fonction prendra en argument les 2 séquences et les coûts de substitution et de gap. Elle retournera un tuple (score, chemin). Le chemin est une suite de lettres décrivant le parcours effectué dans la matrice pour arriver à la case présente. Comme il y a 3 directions possibles, il y a 3 lettres possibles : d, si on vient de la diagonale, g si on vient de la gauche, h si on vient du haut. Tester la fonction sur les séquences LAFLALMEE et LAME. On fixe σ match = 0, σ mis = 1 et σ gap = Affichage de l alignement Ecrivez une fonction qui permet d afficher un alignement en représentant les gaps par des tirets. Cette fonction prendra en argument le chemin et les 2 séquences. Elle affichera l alignement des 2 séquences décrit par le chemin. 5- Version itérative Il est possible d écrire une version beaucoup plus efficace de l algorithme NWS en conservant la matrice d alignement, ce qui évite beaucoup de re-calculs inutiles. Chaque cellule de la matrice d alignement est alors représentée par un tuple (score, direction). a- Afin d appréhender l algorithme à implémenter, remplissez vous même une matrice d alignement avec deux séquences de longueur 5 à 8 que vous choisirez et déduisez en l alignement optimal. b- Ecrivez une fonction NWSIter qui prend en argument les deux séquences à aligner et les coûts de substitution et de gap, et qui retourne la matrice d alignement. La matrice devra être initialisée à False et elle sera de taille (m + 1) (n + 1), m et n étant les longueurs des deux séquences. c- Lorsque la matrice d alignement a été calculée, il faut alors trouver le meilleur chemin en parcourant la matrice à reculons en partant du coin inférieur droit. Ecrivez une fonction NWSBacktrack qui prend en argument une matrice d alignement remplie et retourne le chemin correspondant à l alignement optimal. Vérifiez que l alignement calculé est le même que celui obtenu avec la fonction d alignement récursive. d- Quelle est la complexité de cette version de l algorithme? Comparez avec la version récursive. UPMC - Licence Biologie Mathématiques 4

5 Partie 2 : alignement multiple de n séquences Un alignement multiple se présente sous cette forme : 2 logo 1 CGC CG G T GACTA AG G T C TC AG C AGCTT CGAGA TCTG AC T G ATT AC CGT AC G T C GATC C T T GT CCA 2 1 A C G AQP1nuc.SEQ CCTGGGCATTGAGATCATTGGCACCCTGCA 443 AQP2nuc.SEQ TGTGACTGTAGAGCTCTTCCTGACCATGCA 419 AQP3nuc.SEQ.CCAATGGCACAGCTGGTATC..TTTGCCA 424 AQP4nuc.SEQ GCTCCTGGTGGAGCTAATAATCACTTTCCA 506 AQP5nuc.SEQ CATGGTGGTGGAGTTAATCTTGACTTTCCA 422 consensus *** **** *!!*! *! * ******!! Ici, cinq séquences nucléiques sont alignées. Chaque ligne représente une séquence alignée. Toutes les lignes comportent le même nombre de caractères ("A", "C", "G", "T" ou "."). Les numéros à droite de l alignement indiquent les positions des derniers caractères dans leurs séquences respectives. La ligne consensus indique le degré de conservation de chaque colonne ("*" pour 3 caractères identiques, "!" pour tous les caractères identiques). La graphe logo représente le contenu en information ("Information content") de chaque lettre à chaque position. Cette quantité est déduite de la proportion de chacune des lettres (plus une lettre est caractéristique d une position sa proportion élevée, plus cette valeur est haute). Formalisation du problème Soit un ensemble de n séquences S 1, S 2,..., S n, on cherche un tuple ( S 1, S 2,..., S n ) tel que : S 1 = S 2 = S 3 =... = S n S i est obtenu à partir de S i par l insertion de gaps. La solution optimale correspond à l alignement global optimal, qui maximise la similarité des tuples. On évalue la similarité des tuples en calculant la somme des scores d alignement entre toutes les paires de séquences (SP-score) : score( S 1, S 2,..., S n ) = S 1 n i=1 k=1,l=2,k<l σ( s k i, s l i) Nous allons voir par la suite qu une solution exacte à ce problème impose une complexité qui augmente exponentiellement avec le nombre de séquences (il est NP - difficile). Exercice - 5 Généralisation de l algorithme NWS à n séquences L algorithme de programmation dynamique de Needleman-Wunsch-Sellers qui donne l alignement optimal pour deux séquences est généralisable à l alignement de n séquences. Dans le cas de 2 séquences, chaque position de l alignement correspond à une cellule de matrice 2D, pour laquelle trois types d avancement sont possibles : (1) match/mismatch (diagonale), (2) insertion dans la première séquence (côté horizontal), (3) insertion dans la deuxième séquence (côté vertical). 1- Pour un alignement de 3 séquences, chaque position correspond à une cellule 3D. Combien y a-t-il de possibilités d avancement? 2- Donnez la formule de récurrence permettant de déterminer le score dans chaque cellule 3D d un alignement de 3 séquences. Pour vous aider, vous pouvez reproduire l exemple donné dans la Figure 1, en fixant σ match = 0, σ mis = 1 et σ gap = 1. UPMC - Licence Biologie Mathématiques 5

6 Figure 1 Exemple d alignement optimal de trois séquences. 3- Si vous aviez aligné les séquences données dans la Figure 1 2 à 2, auriez-vous obtenu des alignements par paire compatibles avec l alignement optimal global des 3 séquences? Qu en déduisezvous? 4- De manière générale, pour n séquences, combien d opérations sont nécessaires pour déterminer le score de chaque case? Donnez une estimation de la complexité en temps et en espace d un algorithme utilisant la programmation dynamique, comme NWS, pour déterminer l alignement optimal de n séquences. UPMC - Licence Biologie Mathématiques 6

7 Partie 3 : Application à des données biologiques Exercice - 6 Matrices de substitution Afin de pouvoir aligner avec plus de précision des séquences de protéines, nous devons prendre en compte l information sur le type des acides aminés qui sont substitués (par exemple les acides aminés hydrophobes seront plus similaires entre eux qu avec des acides aminés polaires). Nous allons donc utiliser une matrice qui intègre les coûts de substitution possibles entre toutes les paires d acides aminés. Une matrice classique est la matrice BLOSUM62, de dimension 20 20, représentée ci dessous : A B C D E F G H I K L M N P Q R S T V W A B C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Afin de vous faciliter la tache, vous avez à disposition une variable globale BLOSUM (à copier coller au début du code python) qui peut être utilisée directement sur des couples de lettres. Par exemple le code python BLOSUM[ W ][ D ] renvoie le score de substitution entre les acides aminés W et D (soit la valeur 4). 1- Ecrire une nouvelle version du programme de l algorithme NWS : NWSiterBlosum qui prend en compte les scores BLOSUM62 des paires de lettres pour calculer le score de l alignement. 2- Tester vos deux versions de la fonction d alignement (avec et sans BLOSUM) sur les deux séquences dans la base de donnée UniprotKB ( qui ont les identifiants HBA_HUMAN et LGB2_LUPLU. Comparez les résultats. Exercice - 7 Alignement local Dans certains cas, au lieu d aligner deux séquences entièrement, il peut s avérer plus pertinent d identifier les deux sous-séquences qui sont le plus similaires. On parle dans ce cas d alignement local (au lieu de global). Pour obtenir cet alignement, on utilise l algorithme de Smith et Waterman (SW), dérivé de l algorithme NWS. UPMC - Licence Biologie Mathématiques 7

8 On procède à nouveau par programmation dynamique en construisant une matrice S dont chaque élément S i,j est défini récursivement par les équations suivantes pour i 1 et j 1 : 0 réinitialisation du meilleur score S S i,j = max i 1,j 1 + σ(a i, b j ) (3) S i 1,j + σ(a i, ) S i,j 1 + σ(, b j ) L identification du meilleur alignement local consiste ensuite à trouver la cellule dans toute la matrice S de score maximal et à l utiliser comme point de départ pour parcourir la matrice à reculons. 1- Comment faut-il modifier les équations d initialisation de la matrice pour S 0,0, S 0,j et S i,0 par rapport à l algorithme NWS? 2- Programmer la fonction SWIter qui remplit la matrice de programmation dynamique pour l alignement local. On procédera de la même manière que pour NWSIter en stockant dans chaque case de la matrice un tuple (score, direction). Cette fonction devra aussi fonctionner avec la matrice BLOSUM de substitution. 3- Programmer la fonction SWBacktrack qui identifie le meilleur alignement local et le retourne. 4- Appliquer l algorithme d alignement local aux exemples précédents. Que remarquez-vous? Exercice - 8 Alignement de plusieurs séquences Comme nous l avons vu précédemment, il n est pas possible d utiliser un algorithme de programmation dynamique pour aligner plusieurs séquences. Il est nécessaire de recourir à une heuristique. Contrairement aux algorithmes de programmation dynamique, les algorithmes heuristiques ne garantissent pas de trouver la solution exacte du problème (en l occurrence, le meilleur alignement), mais devraient fournir une solution approchée raisonnable. Vous travaillerez avec un jeu de séquences protéiques appartenant à des synthétases des ARN de transfert. Vous disposez de 7 séquences issue de différents règnes et stockées dans un fichier au format FASTA sur SAKAI sous le nom sequences_synthetases.fasta. 1- Ecrire une fonction qui calcule, à partir d une liste de séquences retournées par la fonction ReadFastaMul, tous les scores d alignement 2 à 2 et stocke le résultat dans un tableau de scores. 2- Proposez un moyen de transformer les scores de similarité obtenus en distances (rappel : une distance vaut 0 pour deux séquences identiques). 3- Pour construire l alignement multiple, une stratégie simple est de procéder de manière séquentielle. 1. A la première étape, on regroupe les deux séquences les plus proches (avec le meilleur score d alignement) et on construit un premier alignement. 2. Aux étapes suivantes, on aligne toutes les séquences restantes deux à deux et aussi avec chaque alignement déjà réalisé. On regroupe de nouveau les séquences ou groupe de séquences (alignements) les plus proches. Pour aligner une séquence avec un alignement déjà réalisé, ou deux alignements entre eux, vous considérerez, à chaque position, la paire de séquences fournissant le meilleur score. Ecrire une fonction qui construit l alignement multiple des séquences à partir de cette procédure séquentielle. UPMC - Licence Biologie Mathématiques 8