MODE OPERATOIRE Coloration histologique

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1 Version : 2 08/04/2011 Page 1 sur 5 MODE OPERATOIRE Coloration histologique 1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION Ce mode opératoire décrit les différentes techniques de colorations histologiques des coupes paraffine. 2. MATERIEL / EQUIPEMENT Appareil Marque N d inventaire Pièce Etuve à 62 C MEMMERT ICT-BIOXX007 Laboratoire 3. REACTIFS ET CONSOMMABLES 3.1. Liste des réactifs et consommables Dénomination Lieu de stockage Fournisseur Acide périodique Fast Green FCF Sol 0,02% GIEMSA stain solution Reactif de schiff Trichrom stain (Masson) Weigert's iron hematoxylin set Eosine 225 Eosine 1% dans H 2 O milliq (poudre armoire Réfrigérateur µscopie (poudre armoire EMS (delta microscopies) Réf. Fournisseur RAL (Labonord) HT15-1KT HT1079-1set Caractéristique 1% dans H 2 O milliq Préparation interne SIGNATAIRES Rédacteur Vérificateur Approbateur Application par Service Qualité Support : Date :

2 Page 2 sur 5 Réactif de méthénamine argentique Solution de BORAX Solution de chlorure d or Solution de thiosulfate de sodium Ethanol 95 Ethanol absolu Toluène Baume d'inclusion eukitt de 250ml Hématoxyline de Harris Kit coloration trichrome de masson Cuve avec couvercle pour boite à coloration en verre Anse pour panier boite de coloration Panier boite de coloration (réfrigérateur Réfrigérateur et µscopie µscopie réserve au bunker µscopie réserve au bunker µscopie réserve au bunker µscopie µscopie Tiroirs µscopie paillasse µscopie Tiroirs µscopie HT mg/flacon HT % dans H 2 O milliq G4022-1G 0.2% H 2 O milliq S G 2% dans H 2 O milliq LPCR PROL Technisol LPCR c AnalaR NORMAPUR LPCR RECTAPUR Dominique Dutscher HHS32 HT15 Dutscher Dutscher Dutscher Préparation des réactifs Solution de méthénamine argentique : Mélanger 8 ml de solution de borax, 100 ml d eau déionisée et le contenu d un flacon de réactif de méthénamine argentique. Mélanger jusqu à dissolution. 4. MODE OPERATOIRE - Avant coloration histologique : placer les lames 2h à O/N à l étuve 62 C pour une meilleure adhésion des coupes sur les lames 4.1. Hématoxyline - éosine Placer les lames O/N à l étuve 62 C retour à température ambiante - 2 min éthanol absolu. - 1 min éthanol min H 2 O milliq. - 3 min hématoxyline de Harris filtrée sur papier Whatman pour éliminer les dépôts. - Rinçage à l eau courante jusqu a ce que l eau devienne claire.

3 Page 3 sur 5-2 fois 2 min H 2 O milliq. - 3 min éosine 1% H 2 O milliq. - Rinçage rapide H 2 O milliq. - Montage en milieu hydrophobe (eukitt) PAS (Periodic Acid Schiff) Placer les lames O/N à l étuve 62 C retour à température ambiante - 2 min éthanol absolu. - 1 min éthanol min H 2 O milliq min acide périodique 0.5% (préparé extemporanément). - Rinçage 10 min à l eau courante min réactif de Schiff. - Rinçage 10 min à l eau courante chaude. - Rinçage 10 min à l eau courante froide. - 2 min hématoxyline de Harris filtrée. - Rinçage à l eau courante jusqu a ce que l eau devienne claire. - Rinçage rapide H 2 O milliq. - Montage en milieu hydrophobe (eukitt) Argent méthénamine - Placer la solution de méthénamine argentique au bain-marie à 62 C. - Déparaffiner les coupes de tissus et les réhydrater avec H 2 O milliq. 10min toluène. 1 min éthanol min H 2 O milliq. - Acide périodique 1% 11 minutes. - Rincer dans H 2 O milliq changée 6 fois. - Placer les lames dans la solution de méthénamine argentique préchauffée. Examiner au microscope toutes les 5 minutes. La membrane basale doit être noire sur un fond jaune foncé-marron : temps environ 45min. Remarques : Placer une jarre de Coplin contenant de l eau déionisée dans un bain-marie à 62 C. Utiliser cette eau pour rincer avant observation et replacer les lames dans la solution de méthénamine argentique chaude jusqu à obtention de l intensité désirée. - Rincer 6 fois dans de l eau déionisée à température ambiante. - Teinter les coupes dans la solution de chlorure d or, pendant 30 secondes. - Rincer 6 fois dans de l eau déionisée à température ambiante. - Placer les coupes dans la solution de thiosulfate de sodium pendant 2 minutes.

4 Page 4 sur 5 - Bien laver à l eau du robinet. - Contre-colorer au Fast Green FCF 0,1 % (eau déionisée) pendant 5 min. - Déshydrater : 10 min toluène. - Monter entre lame et lamelle en milieu hydrophobe (eukitt) Trichrome de Masson (Noyaux : noirs, cytoplasme : rouge, fibres musculaires : rouge et collagène : bleu) Préparation - Préparer la solution d acide phosphotungstique / phosphomolybdique en mélangeant 1 volume phosphotungstique et 1 volume d acide phosphomolybdique avec 2 volumes d eau milliq. Jeter après l avoir utilisé une seule fois - La solution d hématoxyline ferrique de Weigert se prépare en mélangeant se prépare en mélangeant un volume égal de solution A et de solution B. Une nouvelle solution doit être préparée pour chaque utilisation - Préparer l acide acétique à 1% en diluant 8.8ml d acide acétique 1N dans 41.2ml d eau milliq. Protocole - Déparaffiner les coupes de tissus et les réhydrater avec H 2 O milliq. 10min toluène. 1 min éthanol min H 2 O milliq - Incuber 15 min dans la solution de Bouin préchauffée à 56 C pendant 15min au bain marie ou toute la nuit à température ambiante - Refroidir les lames à l eau du robinet (18-26 C) - Laver sous l eau du robinet pour retirer la couleur jaune des coupes - Colorer dans la solution d hématoxyline ferrique de Weigert pendant 5min - Laver sous l eau du robinet pendant 5min - Rincer à l eau milliq - Colorer dans l écarlate de Biebrich-fuschine acide (HT15-1) pendant 5min - Rincer à l eau milliq - Placer les lames dans la solution d acide phosphotungstique / phosphomolybdique pendant 5min - Placer les lames dans la solution de bleu d aniline (HT15-4) pendant 5min - Placer les lames dans de l acide acétique 1% pendant 2min. jeter la solution - Rincer les lames à l eau milliq - Montage en milieu hydrophobe (eukitt) 5. NETTOYAGE ET TRAITEMENT DES DECHETS Evacuer les solutions de fixateurs chimiques et les solvants dans les containers en plastique situés sous la hotte qui sont évacués selon les procédures de l UdS Nettoyer les bacs de coloration à l eau de javel pour les décolorer et bien les rincer ensuite

5 Page 5 sur 5 6. SECURITE Utiliser solvants, Eukitt et fixateurs chimiques (Bouin) sous la hotte