Traitement et analyse d images 2D et 3D

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Georgette Cantin
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1 DEA de Biologie Structurale et Fonctionnelle - DEA de Biologie Cellulaire et Moléculaire Module de Microscopie Structurale Cours n 6 Traitement et analyse d images 2D et 3D Yves Usson Institut Albert Bonniot Domaine de la Merci La Tronche cedex Yves.Usson@ujf-grenoble.fr

2 Etapes de la cytométrie par analyse d image Préparation cytologique Image numérique Objectif SEGMENTATION Image physique Masques de segmentation Capteur vidéo EXTRACTION DE MESURES Image analogique NUMERISATION cell 1 : cell 2: Fichier de mesures

3 Nature de l image Intensité de la lumière 0 noyau hématies fond Coordonnée spatiale x (µm) Coordonnée spatiale y (µm) Coordonnée spatiale x (µm)

4 L image numérique points élémentaires ou pixels (picture elements) Image numérique 256x256 pixels Agrandissement de la zone encadrée (8 fois)

5 L échantillonnage spatial Taille du pixel 0,1 x 0,1µm Nombre de pixels 256x256 Taille du pixel 0,2 x 0,2µm Nombre de pixels 128x128 Taille du pixel 0,4 x 0,4µm Nombre de pixels 64x64 Taille du pixel 0,8 x 0,8µm Nombre de pixels 32x32

6 L échantillonnage dynamique Dynamique : 256 niveaux de gris Dynamique : 32 niveaux de gris Dynamique : 16 niveaux de gris Dynamique : 8 niveaux de gris

7 Image et information Nombre de pixels Niveau de gris Distribution des niveaux de gris dans une image numérique. L axe vertical correspond au nombre de pixels par classe de niveau de gris. L axe horizontal correspond aux niveaux de gris : 0 -> noir et 255 -> blanc

8 Segmentation - Approche par régions Masque binaire B A Nombre de pixels Niveau de gris Segmentation par fenêtre de seuillage sur l histogramme des intensités pixels fond pixels objet

9 Segmentation - Approche par frontières Filtrage de Sobel (valeur absolue de la dérivée seconde) Gx = Ix-1-2.Ix + Ix+1

10 Segmentation - Approche par frontières Seuillage des niveaux de gris Calcul du squelette du masque binaire Image filtrée : image des gradients Masque binaire Squelette binaire Seuil de détection

11 Filtrage morphologique DILATATION EROSION Les pixels du fond au contact de l objet deviennent des pixels objets Les pixels de l objet au contact du fond deviennent des pixels du fond

12 Filtrage de forme Opération de fermeture Dilatations Erosions Opération d ouverture Erosions Dilatations

13 Etiquetage en composantes connexes Chemin non-connexe Chemin connexe Ensembles séparés Image binaire Image des étiquettes

14 Etiquetage - Règles de connexité Connexité 4 voisins voisins latéraux Connexité 8 voisins voisins latéraux & diagonaux Masque à étiqueter 7 ensembles de composantes connexes 4 ensembles de composantes connexes

15 Paramètres morphométriques Masque binaire Profil binaire extraction de bord (automate cellulaire) - Surface (nombre de pixels) - Périmètre (nombre de pixels) - Centre de gravité (analyse de position, anisotropie, cartographie cellulaire) - Enveloppe convexe - Energie de courbure - Facteur de forme - Grand et petit axe - Orientation

16 Lumière transmise - Densitométrie Cuvette contenant la solution à concentration donnée Isol Iref Div log Opérateurs électroniques cablés Loi de Beer & Lambert DO = k C DO = densité optique C = concentration k = constante de proportionnalité Densité optique log Iref Isol Source lumineuse λ donnée Cuvette de référence Blanc (solvant)

17 Lumière transmise - Densitométrie Image d intensité Image des densités optiques I Op Op Op DO Io Opérateur numérique logiciel: DO = Log (Io ) - Log (I) Image du champ vide

18 Microscope confocal à balayage laser Photo-détecteur Filtre confocal Plan image Image reconstruite point par point par balayage laser Miroir dichroïque Source de lumière Laser Objectif Obtention directe de coupes optiques sans information parasite des plans voisins Plan focal

19 Description des données 3D Pile de sections numérisées Volume numérique X Y Z voxel Connexité (voisinage) dans un volume numérique facette commune arête commune sommet commun

20 Limites des méthodes d'acquisition en microscopie confocale Modes de microscopie limités Profondeur d'observation limitée par les propriétés des objectifs Photodégradation des fluorochromes Absorption de la lumière par le specimen Atténuation du signal lumineux par l'optique du microscope Bruits photonique et électronique Déformations dues aux différences d'indice de réfraction

Absorption de la lumière par le specimen 60 Axe optique (50µm) Vue latérale brute (noyaux de cellules myocardiques) 40 20 Intensité moyenne 0 0 20 40 60 80 100 Numéro de section 60

21 Absorption de la lumière par le specimen 60 Axe optique (50µm) Vue latérale brute (noyaux de cellules myocardiques) Intensité moyenne Numéro de section Numéro de section 5,0 4,0 3,0 Axe optique (50µm) Intensité moyenne Vue latérale après compensation par une fonction log-logistique (Rigaut et al., 1991) 2,0

22 Photodégradation de la fluorescence Photodégradation d'une préparation homogène Photodégradation en fonction du temps d'exposition 250 Gel de F.I.T.C Axe optique Intensité de fluorescence Les molécules de fluorochrome situées dans le double cône de lumière sont altérées Temps en min.

23 Formation de l image par une lentille Convolution par un filtre passe-bas hxy oxy ixy = hxy oxy ixy Disque de Airy Source ponctuelle -1 = ôxy hxy ixy rayons diffractés Restauration par déconvolution Plan image

24 Restauration de la résolution par déconvolution Spermatozoïde démembrané de Xenopus laevis incubé dans un extrait d'oeuf Etude de la cinétique de recondensation chromosomique (1h30) Marquage YOYO (de la Barre & Dimitrov) 2 1 Données brutes Sections XY Sections XZ Reconstructions 2 1 Données restaurées

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