PATCH CLAMP Stéphane LOURDEL

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1 LV207 Physiologie cellulaire intégrée Section AHA Année PATCH CLAMP Stéphane LOURDEL

2 Canaux ioniques Pore (conductance) membrane plasmique Filtre de sélectivité Contrôle / Modulation de l activité Porte («gate») Macromolécules ou complexes macromoléculaires formant des pores dans des bicouches lipidiques L ouverture du pore provoque un déplacement de charges courant électrique

3 Le patch clamp, une technique d étude des canaux ioniques Loi d Ohm : + V = R. i imposé calculé mesuré (Volts) (Ohms) (Ampères) V ref Patch = fragment de membrane Clamp = maintien

4 Le patch clamp, une technique d étude des canaux ioniques Loi d Ohm : + V = R. i imposé calculé mesuré (Volts) (Ohms) (Ampères) V ref On dépose une pipette de verre remplie d une solution conductrice à la surface d une membrane cellulaire contenant des canaux ioniques La pipette est connectée à un amplificateur L amplificateur permet d imposer : des potentiels et de recueillir des courants (voltage clamp) des courants et de recueillir des voltages (current clamp) Recueil des courants : à travers un seul canal ionique (canal unitaire, single channel) à travers tous les canaux ioniques présents sur la surface de la cellule (courant global, courant macroscopique, whole cell)

5 Conductance Pore (conductance) membrane plasmique Filtre de sélectivité Contrôle / Modulation de l activité Porte («gate») (V imposé E ion ) = R. i R = 1 / g i = g. (V imposé E ion ) Unité de la conductance : Siemens (S) Représente la facilité avec laquelle les ions traversent le pore

6 Relation courant voltage Courant (pa) conductance (g) + Voltage imposé (mv) + E ion i = g. (V imposé E ion ) Le flux des ions dépend du gradient électrochimique (V imposé E ion ) : Si (V imposé E ion ) > 0 : flux sortant de cations ou flux entrant d anions (courant positif). Hyperpolarisation de la membrane plasmique. Si (V imposé E ion ) < 0 : flux entrant de cations ou flux sortant d anions (courant négatif). Dépolarisation de la membrane plasmique.

7 Réalisation d un scellement sur la membrane plasmique X X Les courants générés par un canal sont très faibles (~ A, picoampère) Il est donc nécessaire de diminuer au maximum le bruit de fond Seal (joint) très fort entre la pipette et la membrane plasmique

8 Le poste de patch clamp

9 La chambre de perfusion

10 Les configurations de base du patch clamp Int. Ext. Cellule attachée (cell attached) Retrait de la pipette Ext. Int. Détaché face interne vers le dehors (inside out) Aspiration très forte Retrait de la pipette Int. Cellule entière (whole cell) Ext. Détaché face externe vers le dehors (outside out)

11 Configuration cellule attachée Int. Ext. Cellule attachée (cell attached) AVANTAGES : Milieu interne de la cellule conservé. Méthode non invasive INCONVENIENTS : Milieu interne de la cellule non contrôlé

12 Enregistrement en canal unitaire (single channel) Canal ouvert Enregistrement théorique Canal fermé Enregistrement pratique Un seul créneau de courant Un seul canal actif sous la pointe la pipette

13 Enregistrement en canal unitaire (single channel) 3 créneaux de courant de MÊME amplitude 3 canaux identiques

14 Détermination de la conductance : relation courant voltage g = 10 ps 145 NaCl 145 NaCl

15 Quelques régulations possibles des canaux ioniques A Facteurs physiques B Facteurs intracellulaires potentiel électrique tension membranaire H +, Ca 2+, ATP C Phosphorylation déphosphorylation D Protéines G kinase phosphatase P E Canaux récepteurs Récepteur nicotinique de l acétylcholine

16 Quantification de l activité d un canal : la probabilité d ouverture 40 mv 0 mv 40 mv 80 mv Exemple : dépendance au voltage

17 Quantification de l activité d un canal : la probabilité d ouverture ouvert t.t.t.t.t..t.. fermé Probabilité d ouverture : t Po = T total t = temps pendant lequel le canal est ouvert T = temps total d enregistrement

18 Quantification de l activité d un canal : la probabilité d ouverture 40 mv 0 mv 40 mv 80 mv

19 Configuration détachée face interne vers le dehors Ext. Int. Détaché face interne vers le dehors (inside out) AVANTAGES : Milieu interne parfaitement contrôlé INCONVENIENTS : Perte d éventuels facteurs de régulation du canal

20 Configuration détachée face externe vers le dehors Int. Ext. Détaché face externe vers le dehors (outside out) AVANTAGES : Milieu externe parfaitement contrôlé INCONVENIENTS : Perte d éventuels facteurs de régulation du canal Assez difficile à obtenir en pratique

21 Détermination de la sélectivité ionique d un canal 150 KCl Courant (pa) Int. Ext. Voltage (mv) 145 KCl Canal K + ou canal Cl???

22 Détermination de la sélectivité ionique d un canal Courant (pa) Int. 150 KCl Ext. Voltage (mv) E K = +60 mv 15 KCl Le potentiel d inversion du canal se déplace vers le potentiel d équilibre de l ion le plus perméant (E K = +60 mv ; E Cl = 60 mv) C est un canal K +

23 Configuration cellule entière AVANTAGES : Milieux externe/interne bien contrôlés On enregistre les courants de toute la cellule (~ 10 9 A) INCONVENIENTS : Cellule entière (whole cell) Perte d éventuels facteurs de régulation du canal

24 Configuration cellule entière 100 mv 60 mv 100 mv 0.2 na 0.2 s 20 ms / 2s Protocole de stimulation Courants observés N canaux du même type I global = N. Po. i unitaire