Petrifilm. Levures & Moisissures. Guide d'interprétation

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1 3 Petrifilm Levures & Moisissures Guide d'interprétation Le dénombrement des colonies de levures et de moisissures sur le Petrifilm est simple. Un indicateur coloré, permet de distinguer les colonies de levures et de moisissures, en améliorant le contraste, et en facilitant ainsi la lecture. LEVURES : - colonie de contour bien défini - de couleur beige rosé à bleu vert - colonie pouvant apparaître en relief (3D") - normalement sans centre de couleur intense Yeast count = 44 Figure 1 MOISISSURES : - larges colonies - colonies aux contours diffus - couleur variable (moisissures pouvant produire leur propre pigmentation) - colonies apparaissant plates - le centre de la colonie présente normalement une coloration intense Sur la photo 1, sont représentées des colonies de levures, dont l'aspect est caractéristique du Petri film : petites colonies bleu vert avec un contour bien défini et ne possédant pas de centre noir (nombre de colonies : 44 levures). La photo 2 représente des colonies de moisissures, dont l'aspect est caractéristique du Petrifilm : larges colonies aux couleurs variables, formes diffuses et avec un centre noir (nombre de colonies : 27 moisissures). Mold count = 27 Figure 2

2 Levures Yeast count = 480 (estimate); Mold count = 21 Figure 3 La photo 3 présente un Petrifilm Levures et Moisissures avec des colonies de moisissures facilement dénombrables (larges colonies vertes, diffuses avec un centre noir bien marqué) et un nombre important de levures. Les colonies de levures sont petites, beiges avec des contours bien définis ; leur centre n'est pas distinguable. Lorsque le nombre de colonies est supérieur à 150, procéder à une estimation.(nombre estimé de levures : 480 ; nombre de moisissures : 21). Pour cela, déterminer le nombre de colonies dans un carré (1 cm 2 ) et le multiplier par 30 afin d'obtenir le nombre total de colonies sur le Petrifilm. La surface de croissance sur le Petrifilm Levures et Moisissures est de 30 cm 2. Le Petrifilm Levures et Moisissures représenté sur la photo 4, comporte un nombre élevé de colonies de levures. Petrifilm incomptable. Les colonies, petites et bleues, visualisées sur le bord de la gélose permettent de différencier un Petrifilm incomptable en levures d'un Petrifilm incomptable en moisissures (Petrifilm incomptable, nombre réel > 10 4 ). Quelquefois, les Petrifilm Levures et Moisissures dont le nombre de levures est très élevé peuvent présenter une coloration bleue uniquement sur le bord de la gélose (photo 5). Ceci est aussi enregistré comme étant un Petrifilm incomptable en Levures (Petrifilm incomptable, nombre réel > 106). Yeast count = TNTC (actual count < 10 4 ) Figure 4 Si aucune colonie ne semble s'être développée sur le Petrifilm Levures et Moisissures, soulever le film supérieur et examiner la gélose qui adhère au film supérieur (photo 6). Si un nombre important de levures s'est développé, vous pourrez observer des colonies blanches dans la gélose. Le Petrifilm est alors considéré comme incomptable (Petrifilm incomptable). Yeast count = TNTC (actual count < 10 6 ) Figure 5 Yeast count = TNTC Figure 6

3 Moisissures Mold count = 59 Figure 7 Mold count = 120 (estimate) Figure 8 La pigmentation des colonies de moisissures sur le Petri film Levures et Moisissures (photo 7) est variable : leurs pourtours sont diffus et le centre des colonies est noir. Les colonies sont de taille importante, elles commencent à être très serrées, sporulent et envahissent la totalité du Petrifilm. Pour simplifier le dénombrement, diviser le Petrifilm en sections et visualiser les centres noirs afin de distinguer les colonies les unes des autres (nombre de colonies : 59). 15 moisissures sont dénombrées dans la section définie sur la photo. Sur le Petrifilm photo 8, noter la variation de pigmentation et les contours diffus causés par le nombre élevé de moisissures et un début de sporulation. Procéder à une estimation en comptant les centres foncés des colonies de moisissures. Ainsi, vous pouvez compter dans le carré 4 colonies (nombreestimé de colonies : 120). Comme pour toutes les méthodes de dénombrement, lorsque le Petrifilm est très chargé, les colonies peuvent apparaître de façon atypique. Il est important de faire des dilutions suffisantes pour obtenir un dénombrement correct. Les photos 9 et 10 présentent des Petrifilm Levures et Moisissures inoculés à partir respectivement de la dilution au 1: 10 et de la dilution 1 : 100 d'un même produit. Les colonies sur la photo 9 sont petites, colorées et nombreuses rendant la lecture très difficile ; de plus une bulle artefact est présente (Petrifilm incomptable). La plage de lecture optimale du Petrifilm permettant une numération est comprise entre 15 et 150 colonies ; la lecture du Petri film est alors plus facile. Au-delà et en deçà de ces limites, le nombre de colonies peut être estimé. Les moisissures (photo 10) sont larges avec des contours diffus et un centre foncé (nombre de colonies : 58). La trop forte contamination sur le Petrifilm (photo 9) ne permet pas une croissance typique des colonies de moisissures. Mold count = TNTC Figure 9 Mold count = 58 Figure 10

4 Réaction de la Phosphatase Yeast and Mold count = 0 Figure 11 Yeast and Mold count = 0 Figure 12 Yeast count = 7; Mold count = 7 Figure 13 La phosphatase est une enzyme contenue dans toutes les cellules vivantes. En présence de la phosphatase, l'indicateur contenu dans le Petrifilm Levures et Moisissures est activé et les colonies de levures et moisissures prennent une couleur bleue. Quelques produits crus ou transformés contiennent des cellules vivantes (et par conséquent la phosphatase) pouvant aussi causer l'apparition de la coloration bleue. 2 types de réactions colorées dues aux produits, peuvent se présenter : * présence sur toute la gélose d'une coloration homogène bleue * présence de minuscules points bleu intense (cas observés, pour les épices ou les produits en granulés). Une réaction colorée due à la présence naturelle de phosphatase dans un produit peut être différenciée des colonies de levures et moisissures par une ou plusieurs des techniques suivantes : 1. Dilution : lorsque ce sera possible, des dilutions plus importantes élimineront l'apparition de la couleur bleue homogène sur l'ensemble de la gélose ou réduiront le nombre de points bleu intense. 2. Mélanger l'échantillon et laisser reposer 3 à 5 minutes afin de laisser décanter tous les débris importants du produit qui sont souvent la cause des réactions colorées donnant des points bleu intense. 3. Température d'incubation : incuber les Petrifilm à la température recommandée (25 C), la réaction enzymatique (phosphatase) apparaît plus rapidement lorsque les températures sont augmentées. 4. Surveiller et noter : Observer les Petrifilm Levures et Moisissures après 24 à 48 heures d'incubation. Le changement de couleur dû au produit peut apparaître en 24 ou 48 heures. Noter si une coloration est visible afin d'aider lors de l'interprétation finale. Le Petri film Levures et Moisissures (photo Il) est un exemple de coloration bleue homogène de l'ensemble de la gélose due à la présence de phosphatase naturelle dans l'échantillon testé (absence de levures et moisissures). Photo 12. Exemple de Petrifilm présentant des points de couleur bleu intense dus à une phosphatase naturelle contenue dans le produit alimentaire. Noter leur aspect : ils sont minuscules, de forme irrégulière et de couleur "bleue intense" ; celle-ci est souvent plus intense et plus diffuse autour des particules alimentaires (absence de levures et moisissures). Un autre exemple de réactions colorées bleu intense est montré sur la photo 13. Les points bleu intense sont très brillants, minuscules et de forme irrégulière. Les colonies de levures sont petites, bleu vert, leur pourtour est bien délimité. Les colonies de moisissures sont larges, de pigmentation variable et leur centre est foncé (nombre de levures : 7 ; nombre de moisissures : 7).

5 Sur la photo 14 est représenté un Petrifilm inoculé avec une dilution du même produit que sur la photo 13. L'inoculation a été réalisée après décantation des particules pendant 3 à 5 minutes. Il reste toujours quelques petits points bleus dus à une interférence avec les particules alimentaires (cf. les carrés représentés sur la photo), mais la majorité des interférences dues aux particules alimentaires a disparu (nombre de levures : 7 ; nombre de moisissures : 7). Yeast count = 12; Mold count = 4 Figure 14 Temps et températures Les temps et températures d'incubation sont des facteurs très importants à maîtriser pour assurer la croissance des levures et des moisissures, qui peuvent être à]' origine de l'altération du produit alimentaire. Ces levures et moisissures ont en général un développement lent, elles sont sensibles aux températures élevées, quelle que soit la méthode utilisée. Pour s'assurer d'un bon développement, incuber le Petrifilm Levures et Moisissures à 2SOC : t 1 C, et vérifier le développement des colonies après 3 et 5 jours d'incubation. S'il est difficile de compter les colonies après 5 jours, retenir la numération obtenue après 3 jours et préciser la durée d'incubation sur le procès verbal d'essai. Étant donné que les colonies de moisissures se développent entre les films, vérifier qu'il n'y a pas de dissémination de spores pouvant provoquer le développement de nouvelles colonies. Incuber les Petrifilm Levures et Moisissures à une température plus élevée ne réduira pas le délai de lecture et peut entraîner]' obtention de résultats erronés, comme cela est illustré sur les photos 15 et 16. Les Petri film qui y sont photographiés ont été inoculés avec la même suspension de produit, mais ont été incubés à des températures et des temps différents. Levures incomptables Incubation 3 jours à 35 C Nombre de moisissures estimé = 120 Levures incomptables (nombre réel > 10 7 ) Incubation 5 jours à 25 C

6 Différentiation microscopique Les levures et moisissures sont des micro-organismes très variés, et ne peuvent pas toujours être distingués macroscopiquement les unes des autres. Comme pour les autres méthodes, une différentiation peut être réalisée après observation microscopique. Pour isoler une colonie en vue d'une caractérisation plus poussée, soulever le film supérieur et prélever la colonie à l'aide d'une anse stérile. Remettre les micro-organismes en suspension dans une goutte d'eau stérile, sur une lame microscopique, recouvrir la préparation d'une lamelle, et observer au microscope. Noter la forme ovale et l'aspect bourgeonnant des cellules. Il s'agit de LEVURES. Noter la présence de filaments ramifiés ou non (mycelium) ; Il s'agit de MOISISSURES. Moisissures à différentes étapes de la germination.

7 3M Petrifilm Levures & Moisissures Fiche d'utilisation Stockage Petrifilm Petrifilm Petrifilm 1 Conserver les poches fermées au réfrigérateur. Utiliser les Petrifilm avant la date d'expiration indiquée sur les poches. 2 Pour refermer les poches, replier l'extrémité et fermer à l'aide d'un ruban adhésif ou d'une pince. 3 Garder les poches entamées à une température ~21 C et à l'abri de l'humidité "50 % HR). Ne pas les placer au réfrigérateur. Utiliser les Petrifilm dans le mois qui suit l'ouverture de la poche. Préparation 4 Préparer la suspension de l'échantillon. Peser ou pipetter le produit dans un container stérile (sac stomacher, bouteille stérile ) 5 Ajouter la quantité nécessaire de l'un des diluants suivants : Eau peptonée, eau distillée. Ne pas utiliser de tampons contenant du citrate de sodium, du thiosulfate ou du phosphate. 6 Broyer ou homogénéiser l'échantillon en utilisant la procédure habituelle Ensemencement 7 Placer le Petrifilm sur une surface plane. Soulever le film supérieur. 8 Avec une pipette tenue perpendiculairement au Petrifilm, déposer 1 ml de l'échantillon, ou de l'échantillon dilué au centre du film inférieur. 9 Relâcher le film supérieur. Ne pas le faire rouler.

8 Placer le diffuseur Levures & 10 Moisissures, face rainurée vers le bas, au centre du film supérieur, au-dessus de l'inoculum. Étaler l'échantillon en exerçant une 11 légère pression sur la poignée du diffuseur. Ne pas tourner ou faire glisser le diffuseur! Retirer le diffuseur. Attendre 1 minute pour permettre au gel de 12 se solidifier. Incubation Interprétation <70 F 13 Incuber le Petrifilm face supérieure vers le haut, sans empiler plus de 20 unités aux températures préconisées par les méthodes de référence, 25 C ± 1 C pendant 3, 4 et 5 jours. Lire le Petrifilm en se référant 14 au guide d'interprétation. Pour l'expression des résultats, se référer à la norme ISO NFV Informations complémentaires Pour toute information technique, appeler le : Pour vos commandes de Petrifilm, appeler le : Date Version Février Département Microbiologie Laboratoires 3M Santé Boulevard de l Oise F Cergy Pontoise Cedex Tél For Europe, please contact : Laboratoires 3M Santé Tél. : (33) Fax : (33)