La stabilité des réticulocytes

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1 La stabilité des réticulocytes LUPACCHINO CÉLINE MARS - AVRIL 2008 LABORATOIRE FUTURELAB BBR-LTC SOUS LA DIRECTION DE : MME S.ANSERMET FutureLab BBR-LTC 1 47 ème volée ESSanté

2 TABLE DES MATIÈRES : 1 RÉSUMÉ INTRODUCTION ÉRYTHROPOÏESE Définition Localisation Caractères généraux Amplification et maturation Les différentes cellules de la lignée érythrocytaire LE RETICULOCYTE Définition Généralités Intérêt analytique Mise en évidence Avantages et désavantages de la technique du comptage des réticulocytes BUTS MÉTHODES ET MATÉRIELS L AUTOMATE SYSMEX XT 2000I Principe de détection Technique de numération des réticulocytes en cytométrie de flux Réactifs Types d échantillons LE COMPTAGE MANUEL DES RETICULOCYTES Principe Type d échantillon Matériels et réactifs Technique Numération RÉSULTATS RÉSULTAT DE LA 1 ÈRE SÉRIE Remarque Critères de validation de mes coefficients de variations et validation RÉSULTAT DE LA 2 ÈME SÉRIE Remarque Validation des CV RÉSUMÉ SUR LES ANTICOAGULANTS CHOISIS EDTA...27 FutureLab BBR-LTC 2 47 ème volée ESSanté

3 5.3.2 Héparine Lithium DISCUSSION RÉFLEXION ET HYPOTHÈSES SUR LA STABILITÉ DES RÉTICULOCYTES RAJOUT DE L ANALYSE DES RÉTICULOCYTES CONCLUSION CRITIQUES PERSONNELLES REMERCIEMENTS BIBLIOGRAPHIES LEXIQUE ANNEXES...35 FutureLab BBR-LTC 3 47 ème volée ESSanté

4 1 Résumé Un réticulocyte est un érythrocyte contenant au moins deux particules d ARN ribosomal pouvant être mises en évidence au moyen d une coloration supravitale. C est une cellule très particulière de l organisme, puisqu elle séjourne successivement au sein de la moelle osseuse, puis dans la circulation sanguine. Effectivement, après la perte du noyau le réticulocyte commence sa maturation dans la moelle et y séjourne entre 2 à 3 jours. Puis, il traverse la paroi endothéliale d un capillaire d un sinus de la moelle osseuse et entre dans la circulation sanguine où il achève sa maturation en l espace de 24 heures et devient érythrocyte. La littérature cite que pour la numération des réticulocytes, la stabilité des échantillons après la prise de sang est de 24 heures. Mon étude porte sur cette stabilité. On a pu démontrer que la stabilité des réticulocytes était supérieure à 24 heures avec des échantillons prélevés sur l anticoagulant EDTA, la stabilité est de 8 jours. Cette source des 24 heures mentionnée dans la littérature, a pu être prouvée avec la même étude mais sur des échantillons prélevés sur l anticoagulant Héparine- Lithium. Deux méthodes de comptages (manuel et sur un automate à cytométrie de flux) ont été utilisées afin de valider ces résultats. Un complément d analyse de la numération des réticulocytes sur une durée plus longue que 24 heures est alors possible. Cette stabilité contredit complètement la littérature. Des hypothèses ont été émises pour expliquer se phénomène mais la question de pourquoi la stabilité est rallongée sur EDTA et non sur les autres anticoagulants reste en suspend. A reticulocyte is an erythrocyte containing at least two ribosomal RNA particles that can be put in evidence thanks to a supravital coloration. It s a very peculiar organism s cell since it first stays inside the bone marrow and then lasts in the blood s circulation. In deed, once the reticulocyte looses his core, it starts its maturation in the bone marrow and stays in it for 2 or 3 days. Further on, it passes through a bone marrow s sinus capillary s endotheliale wall and enters the blood s circulation where it achieves its maturation in 24 hours to become an erythrocyte. Concerning the reticulocyte s count, the literature states that the sample s stability after blood test lasts for 24 hours. My study is focused on this stability. We proved that the reticulocyte s stability lasts for more than 24 hours while working with samples taken on EDTA anticoagulant. In fact, in this case the stability lasts for 8 days. The statements found in the literature concerning the 24 hour s stability have been proved by doing the same experiment as we have done. However, in the literature s case, the samples were taken on the Heparin-Lithium anticoagulant. Two counting methods (manual and on a flow citometry automat) have been used in order to valid these results. A reticulocyte s counting analysis s complement done on a greater length than 24 hours is thus possible. This stability completely contradicts the literature s one. Hypotheses have been done in order to try to explain this phenomenon, but the following question still remains: why is this stability longer on EDTA and isn t on the other anticoagulants? FutureLab BBR-LTC 4 47 ème volée ESSanté

5 2 Introduction Ce travail porte sur la stabilité des réticulocytes. Ces cellules érythropoïétiques peuvent être mises en évidence soit par coloration supravitale soit par une nouvelle technique automatisée, c'est-à-dire la cytométrie de flux. C est le professeur Paul Ehrlich qui a décrit les réticulocytes pour la première fois, en 1881, en révélant leur structure filamenteuse grâce à la coloration supravitale. Puis, il faudra attendre presque 100 ans afin d avoir une définition uniforme de cette cellule. Pour la bonne compréhension de ce travail, il est nécessaire de commencer par rappeler ce qu est l érythropoïèse de même que d approfondir la notion de réticulocyte. Il est également important d énumérer les pathologies dans lesquelles la recherche des réticulocytes est importante. 2.1 Érythropoïèse Définition L érythropoïèse est l ensemble des mécanismes qui aboutissent à la production des érythrocytes Localisation Selon Bessis (1976), «Chez l homme adulte normal, les cellules de la série érythrocytaire se trouvent dans la moelle osseuse hémopoïétique (moelle rouge). Chez le fœtus et dans certains états pathologiques, le foie, la rate et d autres organes peuvent aussi présenter une activité érythropoïétique.» (p.25) Caractères généraux La lignée érythrocytaire provient d une cellule souche myéloïde le CFU-GEMM, qui est ensuite déterminée en BFU-E et devient un précurseur spécifique, le CFU-E. Ce précurseur se différencie à son tour en proérythroblaste qui se reconnait déjà sous le microscope optique (L Italien & Lord Dubé, 1998, p.30). A partir de là, commence la série érythrocytaire. Figure 1: Schéma de l érythropoïèse FutureLab BBR-LTC 5 47 ème volée ESSanté

6 Il existe plusieurs stades de maturation : Le proérythroblaste (E1) Les érythroblastes basophiles I et II (E2 et E3) L érythroblaste polychromatophile (E4) L érythroblaste acidophile ou polychromatophile II (E5) Le réticulocyte (Rtc) L érythrocyte (E) Figure2: Erythropoïèse Amplification et maturation D après Aimé-Gentry (1999), «Cette maturation a pour principale caractéristique, la production et l accumulation de l hémoglobine cystosolique, mais s accompagne également d un certain nombre de divisions cellulaires permettant une amplification de la production des cellules.». Conformément aux sources littéraires utilisées, tous citent qu à partir du proérythroblaste, il y a 4 divisions cellulaires, qui aboutissent donc à la production de 16 cellules adultes. D après L Italien & Lord Dubé (1998), il y a 2 mitoses entre le stade de proérythroblaste à érythroblaste basophile I et II, puis les mitoses se succèdent jusqu au stade de l érythroblaste acidophile ou polychromatophile II. A ce stade là, il n y a plus de division cellulaire. Pour L Italien & Lord Dubé (1998), «Même si l érythroblaste ne se divise plus, la maturation commencée dès le proérythroblaste se poursuit. Le noyau est expulsé : c est le réticulocyte.». Celui-ci reste 24 et 36 heures dans la moelle osseuse, puis passe dans le sang, où il lui faut environ 24 heures pour se transformer en érythrocyte. Bessis (1976) cite qu «A partir du proérythroblaste, la cellule synthétise de l hémoglobine, qui s accumule dans le cytoplasme. Il a été supposé que c était le taux d hémoglobine qui réglait le moment ou la cellule entrait en mitose» Les différentes cellules de la lignée érythrocytaire Selon Aimé-Gentry (p.66), L évolution des érythroblastes de la lignée érythroblastique se traduit donc par une modification morpho-cytologique de la cellule originelle : la taille de son noyau va se réduire pendant que le cytoplasme va passer d une coloration basophile [ ] à une coloration acidophile [ ], conséquence de l augmentation de la quantité d hémoglobine cytoplasmique concomitante à la perte des ribosomes. FutureLab BBR-LTC 6 47 ème volée ESSanté

7 Figure 3: Cellules de la série érythrocytaire 1. Le proérythroblaste (pronormoblast) : C est la cellule la plus jeune de la lignée érythrocytaire, elle représente que 1% des éléments nucléés. C est une cellule arrondie ou ovale, de 20 à 25 µm. Le noyau occupe les huit dixièmes environ de la cellule. Il est clair, mais présente déjà de petit amas de chromatine. Sa chromatine est homogène et présente 1 ou 2 nucléoles. Le cytoplasme forme une couronne d environ 2 µm de large. Il est coloré par une coloration basophile traduisant la présence d une grande quantité de ribosomes. 2. Les érythroblastes basophiles I et II (basophilic normoblast): Ils constituent environ 5% des cellules nucléées de la moelle. Ces stades sont caractérisés sur frottis par la perte progressive de l hyperbasophilie du cytoplasme. La taille du noyau (15 à 18 µm) diminue plus rapidement que celle du cytoplasme. Le noyau présente une chromatine qui se dispose en motte, ce qui lui donne un aspect caractéristique. Le nucléole a disparu. Le cytoplasme présente une teinte bleu uniforme. 3. Les érythroblastes polychromatophile I et II (polychromatophilic normoblast) : Leur taille se réduit encore (10 à 12 µm). Leur noyau ne représente plus que le quart de la cellule, mais garde son aspect caractéristique. Le cytoplasme, dans lequel la concentration d hémoglobine augmente petit à petit, prend une série de nuance allant progressivement du bleu vert au rose. A ce stade l érythroblaste polychromatophile II expulse son noyau et devient réticulocyte. 4. Le réticulocyte (reticulocyte) : C est donc une cellule anucléée, d environ 8 µm de diamètre, qui possède encore quelques organites cellulaires, en particuliers mitochondries et ribosomes. Les ribosomes FutureLab BBR-LTC 7 47 ème volée ESSanté

8 sont responsables d une basophilie discrète et précipitent en présence de colorants dits basiques (ex : bleu de Crésyl brillant) pour donner une coloration caractéristique des réticulocytes. A ce stade, le réticulocyte traverse la paroi d un capillaire pour entrer dans le courant sanguin. 5. L érythrocyte (erythrocyte) : C est une cellule discoïde, biconcave, dépourvue de noyau, de mitochondries, et de ribosomes. Cette cellule contient une importante quantité d'hémoglobine. Les érythrocytes transportent l'oxygène (O2) des poumons à toutes les cellules de l'organisme et une partie du gaz carbonique (CO2) des cellules aux poumons. Le glucose est la seule source d'énergie des érythrocytes. (Aimé-Gentry, 1999, p.66) ; (Bessis, 1976, p.28, 30, 32, 44, 46) 2.2 Le réticulocyte Définition Selon le NCCLS (National Committe for Clinical Laboratory Standardisation) un réticulocyte est un érythrocyte contenant au moins deux particules d ARN ribosomal pouvant être mises en évidence au moyen d une coloration supravitale Généralités Le réticulocyte est le dernier stade avant l érythrocyte, il est caractérisé comme un globule rouge immature. On lui donne ce nom dès le moment où le noyau est expulsé jusqu à ce qu il devienne un érythrocyte, c est à dire jusqu à ce que la cellule prenne une forme biconcave et ne contienne plus aucune organelle. (Bessis, 1976, p.44). «C est une cellule très particulière de l organisme, puisqu elle séjourne successivement au sein de la moelle osseuse, puis dans la circulation sanguine.» ( Effectivement, après la perte du noyau le réticulocyte commence sa maturation dans la moelle et y séjourne entre 2 à 3 jours. Puis, il traverse la paroi endothéliale d un capillaire d un sinus de la moelle osseuse et entre dans la circulation sanguine. De là, il achève sa maturation, la cellule se débarrasse de tous ses compartiments intracellulaires pour prendre l aspect caractéristique du globule rouge. «Le caractère unique de cette cellule, est sans aucun doute l importance de la synthèse protéique qu elle réalise, tout en étant dépourvue d ADN.» ( En effet, le réticulocyte contient certaines structures comme les mitochondries et un certain nombre de ribosomes, c est cette richesse en ARN ribosomal qui est responsable de cette synthèse et qui les distinguent des globules rouges. La formation de ribosomes cesse avec l expulsion du noyau de l érythroblaste polychromatophile II. Malgré la présence d ARN, la synthèse des protéines et de l hème continue. Pendant la maturation des réticulocytes, l ARN est catabolisé, donc le nombre de ribosomes décroît progressivement et entraîne une perte des autres organelles telles que les mitochondries. Cette perte des ribosomes et des mitochondries (principalement), FutureLab BBR-LTC 8 47 ème volée ESSanté

9 parallèlement à la synthèse de l hémoglobine, marque la transition entre le stade de réticulocyte à celui d érythrocyte. (Turgeon,1993, p.61) Intérêt analytique La numération réticulocytaire dans le sang périphérique reflète l activité érythropoïétique de la moelle osseuse. Elle est une étape fondamentale du diagnostic étiologique des anémies, de l évaluation de la réponse aux traitements et du suivi des patients aplasiques ou ayant subi une greffe de moelle osseuse. La réticulocytose s'élève dans toutes les circonstances où la moelle osseuse fait un effort de régénération : les taux les plus élevés sont donc observés dans les anémies hémolytiques et après une hémorragie aiguë. Toutefois un pourcentage légèrement élevé de réticulocytes ne signifie pas nécessairement qu'il existe une hyperactivité médullaire. La numération des réticulocytes est avant tout un indicateur du type d'anémie. En effet, pour compenser l'anémie, la moelle produit plus d'érythrocytes lorsque ces derniers ont une durée de vie raccourcie, la durée de vie normale étant de 120 jours. Si leur durée de vie est ramenée à 20 jours, par exemple, la moelle devra produire six fois plus de globules. Dix pour cent de ces globules rouges seront âgés de moins de deux jours et seront donc des réticulocytes. Un taux accru de réticulocytes signe donc la compensation par la moelle d'une perte anormale d'hématies, qu'il s'agisse d'une hémolyse de toute origine possible, ou d'une hémorragie chronique. D'une manière générale, on estime qu'un taux sanguin de réticulocytes inférieur à 120 Giga par litre est signe d'une anémie hyporégénérative (la moelle ne compense pas la perte de globules rouges), alors qu'un taux de réticulocytes supérieur à 120 Giga par litre est signe d'une anémie régénérative (la moelle compense). ( Mise en évidence Figure4:Coloration supravitale des réticulocytes Dans le sang, les réticulocytes ne se différencient pas vraiment des érythrocytes mis à part lors d une polychromasie qui les caractérise. Leur numération se fera par une coloration spéciale qui permettra d en déterminer le pourcentage ou le pourmille, suivant les unités des laboratoires. La technique traditionnelle utilise un colorant supravital comme le bleu de Crésyl brillant ou le bleu de méthylène nouveau, cela afin de mettre en évidence l ARN ribosomal réticulocytaire. Ces colorations supravitales mettent en évidence une structure filamenteuse fine à l intérieur du réticulocyte, cette substance est appelée la substance granulo-filamenteuse. Ces colorants peuvent FutureLab BBR-LTC 9 47 ème volée ESSanté

10 pénétrer dans les érythrocytes en suspension et se fixer sur cette substance tout en les laissant vivants, cela afin de les différentier des érythrocytes. Selon l aspect de la structure granulo-filamenteuse, il est possible de classer les réticulocytes en 4 stades : Stade I Stade II Stade III Stade IV la substance granulo-filamenteuse est un amas dense la substance granulo-filamenteuse forme une couronne la substance granulo-filamenteuse en forme de couronne se dissout quelques granulations sont colorées Figure 5: Schéma des différents stades des réticulocytes Ces différents stades peuvent être observés sous le microscope ainsi que sur les graphiques et les valeurs rendues par l automate de cytométrie de flux, mais ils n ont aucune importance au niveau du diagnostic. En microscopie, on ne les différencie même pas. Le comptage des réticulocytes comprend donc, tous les différents stades de maturation de réticulocytes Avantages et désavantages de la technique du comptage des réticulocytes La technique du comptage au microscope optique des réticulocytes est une technique aléatoire sur les plans de la sensibilité et la reproductibilité des résultats. Les causes d erreurs dans le comptage manuel sont fréquentes, celles citées ci - dessous sont les plus les plus courantes : Différences d un technicien à l autre Différences dans la coloration, parfois agrégats de colorant Différences dans le nombre de cellules analysées, l estimation de 100 érythrocytes par champs est différente pour chacun Une confusion entre les réticulocytes et les corps de Heinz est possible (Résumé du mode opératoire du Sysmex XT-2000i, p.101) FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

11 Toutes ces causes d erreurs ont amené de nouvelles perspectives au niveau de l industrie médicale. Une nouvelle technique automatisée a été mise en place, afin de limiter ces erreurs et d être plus fiable. A ce jour, les techniques automatisées sont de plus en plus appréciées pour ce comptage. La cytométrie de flux utilisant un marquage à l ARN ribosomal par fluorochrome, a ouvert de nouvelles perspectives dans le domaine du comptage des réticulocytes. De nombreuses études ont mis en évidence la grande sensibilité, la bonne répétabilité et l extrême précision de cette technique. ( L intervalle de référence des réticulocytes au sein du laboratoire se situe : En valeurs relatives 5 à 15 En valeurs absolues 20 à 120 G/l FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

12 3 Buts Ce travail porte sur la stabilité des réticulocytes. Le laboratoire BBR-LTC donne un temps de stabilité pour les réticulocytes de 24 heures. Cette stabilité est utilisée pour accepter ou refuser un complément d analyse. Ce délai de 24 heures est avant tout utile pour les cabinets médicaux où les rajouts d analyses sont souvent demandés le lendemain. Ce délai permet de leurs donner une indication s il est possible ou non de réaliser cette analyse. S il s avère que le délai des 24 heures est dépassé, il sera nécessaire de repiquer le patient. La 1 ère question qui nous a interpellé concernait la stabilité des réticulocytes, ces cellules sont-elles réellement stable que 24 heures? Effectivement en repassant des tubes de la veille, on s est aperçu que les réticulocytes sont stables plus de 24 heures. Le but premier de mon travail est de rechercher d où vient ce délai de 24 heures et surtout de démonter si ce délai est juste ou non. Afin de démontrer que la stabilité de ces cellules est plus longue que 24 heures, des analyses ont été effectuées sur plusieurs jours autant avec la technique automatisée qu avec la technique manuelle. La technique manuelle a aussi été utilisée afin de voir si les filaments de la substance granulo-filamenteuse ne disparaissaient pas au bout d une certaine durée. Les 1 ers essais ont montré une stabilité des réticulocytes sur une durée de plusieurs jours et cela avec les 2 techniques utilisées, alors la question des 24 heures est remise en cause. La littérature et les connaissances des TAB de BBR-LTC citent que la stabilité est de 24 heures. Pour essayer de comprendre cette source de 24 heures, une 2 ème étude a été effectuée sur un autre anticoagulant : L Héparine-Lithium. Cette 2 ème étude a été réalisée dans les mêmes conditions que la 1 ère. La finalité de cette étude permettrait au laboratoire d avoir la possibilité d instaurer un complément d analyse des réticulocytes. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

13 4 Méthodes et matériels Au cours de ce travail 2 techniques de comptage des réticulocytes ont été utilisées : La cytométrie de flux Comptage manuel au microscope otique par coloration supravitale Il est important de rappeler le principe et le fonctionnement de ces différentes méthodes. 4.1 L automate Sysmex XT-2000i Cet appareil effectue des analyses hématologiques, cela par 2 techniques, l une par focalisation hydrodynamique, en d autre mot par mesure de l impédance, et l une par cytométrie de flux dont le fonctionnement repose sur l emploi d un laser à semiconducteur. C est un automate à 5 populations. Le comptage des réticulocytes s effectue que par cytométrie de flux mais la méthode par impédance sera abordée, afin d améliorer la compréhension de l appareil. Figure 6:L automate Sysmex XT-2000i Principe de détection Méthode de focalisation hydrodynamique ou mesure par impédance Principe : La mesure d impédance est basée sur le passage de cellules en suspension dans un liquide conducteur à travers un orifice qui modifie la résistance électrique entre 2 électrodes. Cette modification est enregistrée sous forme d impulsions. Le nombre d impulsions enregistrées correspond au nombre de cellules qui passent. La hauteur des impulsions est proportionnelle au volume de la cellule détectée. Figure 7: Schéma du principe de la mesure par impédance FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

14 Chemin d une cellule : Après que l échantillon dilué soit poussé dans la chambre conique par la buse, il est alors entouré de CELL-PACK (qui joue le rôle de liquide de gaine) et passe à travers l orifice, exactement au centre. Le passage des cellules au centre de l orifice assure la forme optimale des signaux cellulaires. Une fois passé dans l orifice de comptage, l échantillon dilué est envoyé vers la tubulure de réception. Cela empêche les cellules sanguines se trouvant dans cette zone de rebondir dans le sens inverse La cytométrie de flux Principe : La cytométrie de flux est employée pour analyser les caractéristiques physiologiques et chimiques des cellules et d autres particules biologiques. Dans la fluoro-cytométrie en flux, chaque cellule sanguine colorée par des fluorochromomes est éclairée par un faisceau laser semi-conducteur, ce qui permet une analyse sophistiquée basée sur la teneur en ARN/ADN de toute la cellule (noyau et cytoplasme), la taille de la cellule, le contenu de la cellule et la texture de la surface cellulaire. En regardant à l intérieur de la cellule et en jugeant les activités Figure 8: Schéma de l intensité de la fluorescence physiologiques liées à la réplication de l ADN et de la synthèse protéique, il devient possible de déterminer facilement le type de cellule et sa phase de maturation. La collecte et le traitement rapide de trois signaux optiques obtenus à partir de chaque cellule sont la base de l identification cellulaire. Au niveau du banc optique de la série XT, un laser semi-conducteur, la cellule de flux, des systèmes de focalisation optiques et des détecteurs sont réunis dans un système sophistiqué. Le signal de la diffusion avant (taille de la cellule), le signal de la diffusion latérale (teneur en ARN/ADN) de chaque cellule sont analysés lorsqu ils passent à travers la cellule de flux. La combinaison de ces signaux décrit une image concise et précise de chaque cellule sanguine périphérique détectée. Cette méthodologie de l analyse cellulaire sanguine garantit une précision et une exactitude sans pareille. ( Figure9:Schéma de la diffusion de la lumière FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

15 Chemin des cellules dans le cytomètre : Un échantillon de sang est aspiré, quantifié, c est à dire que les quantités de sang nécessaire à chaque canal sont mesurées précisément et dirigées vers le canal désiré, puis l échantillon est dilué à une concentration donnée et enfin coloré par un colorant appelé polyméthine. L échantillon est ensuite acheminé dans le flowcell. Ce mécanisme de flux froid (Sheath) augmente la précision et la reproductibilité. Un faisceau laser à semi-conducteur est dirigé sur les cellules sanguines traversant le flowcell. La lumière diffusée vers l avant et la lumière diffusée latéralement sont détectées par une photodiode et l activité fluorescente est détectée par un tube photomultiplicateur. Cette lumière est convertie en impulsion électrique, ces dernières fournissant des informations sur les cellules sanguines. Lorsqu une particule passe à travers le faisceau lumineux, elle entraîne une diffusion de la lumière dans diverses directions. En détectant la lumière diffusée, on obtient des informations sur la taille de la cellule ainsi que ses propriétés physiques. C est exactement ce qui se produit lorsque le faisceau du rayon laser est dirigé sur les cellules sanguines. L intensité de la lumière diffusée est influencée par plusieurs facteurs tels que le diamètre de la particule et l angle d incidence. La lumière diffusée vers l avant donne une information sur la taille de la cellule, et celle latéralement fournit une information sur l intérieur de la cellule (taille du noyau, etc.). Le fait de projeter de la lumière sur une matière fluorescente, telle que les cellules sanguines colorées, génèrent une lumière dont la longueur d onde est plus élevée que celle de la lumière de départ. Plus la concentration en colorant est forte, plus l intensité de l activité fluorescente augmente. La mesure de l intensité de la lumière fluorescente émise permet d obtenir des informations sur le taux de coloration des cellules. (Mode opératoire du Sysmex XT-2000i (p.14-14) Technique de numération des réticulocytes en cytométrie de flux La numération des réticulocytes est analysée par un canal RET. Ce canal permet d appliquer la technologie de laser à diode pour l analyse réticulocytaire. L ARN et l ADN des cellules réticulées sont spécifiquement colorés. Seul les réticulocytes, les érythrocytes en mode otique et les plaquettes en mode otique sont comptée dans ce canal. Figure 10: marquage des cellules à la polméthine Le sang est tout d abord aspiré soit en mode manuel, soit en mode clos. Puis pour ce canal l appareil a besoin que de 4 μl de sang. Ce sang est dilué avec ml de RET SEARCH (II) Diluent, puis le toute est envoyé dans la chambre de réaction où 20 μl de RET SEARCH (II) DYE est ajouté au mélange. Les cellules sont alors dans FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

16 un milieu où le ratio est de 1 :255, les cellules se colorent cela durant 35,5 secondes. Ensuite les cellules colorées partent vers le laser semi-conducteur. Pour être acheminées jusqu à celui-ci, les cellules sont diluées avec un liquide de gainage le CELLPACK. Figure 11: Schéma du déroulement de l analyse du canal RET Puis lors de leur passage dans le laser semi-conducteur, chaque cellule émet une fluorescence. C est à partir des caractéristiques de la cellule, telle de sa taille er l intensité de sa fluorescence, que l appareil pourra les classer selon leurs types. (Mode opératoire du Sysmex XT-2000i (p.14-14) Figure 12: Schéma de l intensité des cellules du canal RET Les différents stades des réticulocytes peuvent aussi être analysés dans ce canal. La teneur en ARN des réticulocytes diminue pendant le processus de maturation jusqu à ce qu ils se transforment en érythrocytes matures. L intensité de la fluorescence et l intensité de la diffusion avant, de chacune de ces cellules sont individuellement mesurées et les informations concernant la teneur en ARN ainsi que la taille de la cellule sont enregistrée. L automate sépare les différentes phases de maturation sur la base des ces critères. Il les sépare en 3 fractions, la première la fraction HFR (réticulocytes à fluorescence élevée), la deuxième MFR (réticulocytes à fluorescence moyenne) et la dernière LFR (réticulocytes à fluorescence basse). Une quatrième FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

17 fraction IFR (réticulocytes immatures) est déterminée mais cela par une addition de la fraction MFR et HFR. Figure 13: Graphique du canal RET Réactifs Les réactifs nécessaires à l analyse des réticulocytes sont contenus dans un kit qui est constitué du RET-SEARCH (II) DILUENT qui est le diluant et du RET-SEARCH (II) DYE qui est le colorant. Ce kit est commandé chez Sysmex. Principe actif : RET-SEARCH (II) DILUENT : Tampon tricine 0.18% RET-SEARCH (II) DYE: Colorant polyméthine 0.03% Methanol 7.10% Ethylène glycol 92.80% Types d échantillons Les premières analyses ont été réalisées avec du sang veineux recueilli sur EDTA. Ces échantillons ont été sélectionnés dans le stock des patients de la journée. Ils ont été choisis en fonction de l anémie, accompagnée ou non d une polychromasie marquant la présence de réticulocytes. Certains échantillons ont un tableau hématologique totalement normal, car il était important d avoir des résultats non pathologiques. Le nombre d échantillons testés s élève à 21 cas. Chaque échantillon, après utilisation, a été stocké entre 1 et 8 C. La 2 ème série a été prélevée sur sang veineux Héparine-Lithium. Ils ont été prélevés par une collègue à la clinique La Lignière. Aucun paramètre hématologique n a été pris compte, car ces données n avaient pas d importance pour la suite de cette étude. Cette série a aussi été stockée entre 1 et 8 C, après utilisation. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

18 4.2 Le comptage manuel des réticulocytes Principe Selon L Italien & Lord Dubé (1998) «on peut déterminer le nombre de réticulocytes présents dans le sang circulant à l aide de colorants vitaux qui précipitent les ribosomes et font apparaître la substance granulo-filamenteuse alors visible au microscope.» Type d échantillon Ce sont les mêmes que pour la 1 ère technique. NB : Au vu des premiers résultats, les frottis n ont pas été tirés chaque jour car la stabilité des réticulocytes, avec la méthode manuelle, est inchangée sur une durée de 8 jours. Il n est donc pas nécessaire de faire le comptage chaque jour Matériels et réactifs Bleu de Crésyl brillant à 10%, préparer et fournit par BioService SA Lames à microscopie et une lamelle rodée Microhématocrite Tubes plastiques avec les bouchons appropriés Etuve à 37 C Microscope optique avec un objectif 100x Technique 1. Mélanger à volume égal le sang et le colorant dans un tube. Dans le cadre de cette étude, les volumes étaient de 50 μl de sang et 50 μl de colorant. 2. Mettre le tube à l étuve à 37 C pendant 15 min 3. Après l incubation, bien mélanger 4. Tirer un ou plusieurs frottis, cela en prélevant le mélange à l aide du microhématocrite, déposer une goutte sur une lame et tirer un frottis selon la technique habituelle. 5. Laisser sécher 6. Compter sous le microscope Numération La numération se fait à l objectif à immersion 100x. Les globules rouges sont colorés en vert et l on voit dans le cytoplasme des réticulocytes la substance granulofilamenteuse colorée. A BBR, la numération se fait en comptant 10 champs de 100 érythrocytes, ce qui fait un total de 1000 érythrocytes. On compte le nombre de réticulocytes sur 10 champs, puis on additionne les 10 résultats, ce qui nous donne FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

19 un pour mille de réticulocytes. Par la suite, on peut convertir se chiffre absolu en giga par litre, cela par un calcul simple : Le nombre de réticulocyte en * érythrocytes en T/l = réticulocytes en G/l Il est nécessaire de faire cette mesure à double. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

20 5 Résultats L étude a commencé par l analyse de deux échantillons de sang, l un ayant une légère augmentation des réticulocytes et l autre ayant une forte réticulocytose. Ces 2 échantillons ont été analysés une fois chaque jour avec les 2 techniques de comptage (manuellement et sur l automate) sur une période de 8 jours, afin de se faire une idée globale sur la stabilité des réticulocytes. Ces deux échantillons étaient stables au niveau des valeurs, une différence de 1 à maximum 4 a été observée. L étude c est déroulée sur 8 jours car le laboratoire BBR garde les tubes dans le stock pendant une semaine, puis ils sont jetés. De plus les cellules deviennent trop abîmées pour continuer les analyses. Ce phénomène de stabilité dépassant les 24 heures était en contradiction avec la littérature et avec le personnel de laboratoire, qui a toujours appris que les réticulocytes n étaient stables que durant 24 heures. L étude a continué dans le même sens, c'est-à-dire qu il a fallu prouver que ces réticulocytes étaient stables plus de 24 heures avec des résultats pathologiques ou normaux. Mais une deuxième question s est alors posée, d où vient cette source des 24 heures? Est-elle due aux premières connaissances théoriques sur le réticulocyte citées dans l introduction (p.6-7) ou alors sur une expérience pratique? Vu que l on voit, que sur EDTA la stabilité est de plus de 24 heures, nous avons cherché un autre anticoagulant qui garde les cellules intactes, à savoir l Héparine-Lithium. Cet anticoagulant nous permettra de vérifier si la source des 24 heures est valable. A partir de ces conclusions, 2 stratégies ont été mises en place : 1. Effectuer des comptages de réticulocytes manuellement et automatiquement sur des échantillons prélevés sur EDTA. La technique manuelle a été effectuée dans le but de vérifié que la substance granulo-filamenteuse ne disparaisse pas au bout de quelques jours. Ces analyses nous permettrons de valider nos résultats ainsi que de prouver la stabilité de ces cellules. 2. Effectuer les mêmes analyses avec l anticoagulant Héparine-Lithium. Ces analyses nous permettrons de vérifier si la notion des 24 heures est valable. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

21 5.1 Résultat de la 1 ère série Une série de 21 tubes prélevés sur EDTA ont été passés sur le Sysmex XT-2000i durant 8 jours. Pour chacun de ces échantillons, il manque à chaque fois deux jours dus au weekend. Ces échantillons ont aussi été comptés manuellement. Au vu des premiers résultats, le comptage manuel n a pas été effectué tous les jours car les premiers résultats montraient une bonne stabilité sur la durée même avec cette méthode de comptage. Pour chaque cas, la moyenne et les coefficients de variation (CV) ont été calculés. Figure 14: Echantillons passés sur le Sysmex XT-2000i en mode RET et classés en 3 catégories suivant les résultats Figure15 :Graphique des échantillons compris entre 5 et 15 Figure16:Graphique des échantillons compris entre 15 et 25 Figure 17: Graphique des échantillons de plus de 25 FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

22 Figure 18: Echantillons comptés avec la technique manuelle, échantillons en Tous les résultats effectués sur le Sysmex XT-2000i ont été regroupés en fonction de leurs valeurs en trois catégories. L une regroupant les échantillons contenant entre 5 et 15 de réticulocytes la deuxième contenant entre 16 et 25, et la dernière ayant plus de 25. Il n aurait pas été nécessaire de regroupés ces valeurs en 3 catégories, mais la réalisation des graphiques n aurait pas été possible avec autant de valeurs. Ces résultats sont tous rendu en pour mille car c est l unité de notre laboratoire. NB : Tous les résultats de cette analyse se trouvent en annexe Remarque On remarque que les CV de la méthode manuelle sont moins bons que la série de l automate, car c est une méthode nettement moins précise pour les raisons citées au paragraphe On voit aussi qu il y a des énormes différences de comptage entre un jour et un autre comme dans l échantillon 4 ou le 18. Les graphiques montrent bien ces différences. Effectivement, il est surprenant et bizarre qu un jour la valeur des réticulocytes chute et que le lendemain la valeur de départ soit retrouvée. Ces erreurs peuvent s expliquer par une mauvaise homogénéisation du tube avant d effectuer l analyse. Les valeurs entre la technique manuelle et la technique automatisée ne coïncident pas toujours (exemple : échantillon 1). Toutes ces différences peuvent s expliquer par les causes d erreurs de la technique manuelle cité au paragraphe 2.2.5, les agrégats de colorant ainsi que l estimation du nombre d érythrocytes par champs sont sûrement les explications les plus probables. Il est fort possible aussi qu il y eu une mauvaise homogénéisation des tubes avant d effectuer les analyses. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

23 5.1.2 Critères de validation de mes coefficients de variations et validation Pour valider cette analyse, il a fallu tout d abord déterminer l imprécision dans la méthode d analyse automatisée, c est pourquoi trois échantillons ont été choisis et passés sur l automate sept fois en l espace de trois heures. Les échantillons choisis sont compris dans trois intervalles différents au niveau des résultats des réticulocytes. Le premier échantillon est compris entre 5 et 15 de réticulocytes, le deuxième entre 16 et 25 et le dernier à plus de 25. Le coefficient de variation a été calculé pour chacun d entre eux. Cela nous a permis de connaître la reproductibilité inter-sérielle de l appareil au niveau de l analyse des réticulocytes. Au niveau de la technique manuelle, aucune reproductibilité n a été mise en place par une erreur de ma part et par une méconnaissance des techniques de validation de cette analyse. Ces CV inter-sériels nous donnent une idée sur les CV que l on devrait obtenir dans notre analyse. Echantillon compris entre: Ech.A Ech.B Ech.C 5 et et 25 de plus de 25 Mesures Ecart type Moyenne CV% Figure 19: Mesure des CV inter-sériels Pour valider ces CV des recherches ont été faites, tout d abord au niveau de la QUALAB où aucune référence sur une limite tolérée n a été trouvée. Mme Ansermet m a alors aidé à trouver les valeurs tolérées par le CSCQ, ils admettent pour la méthode manuelle une tolérance de 40. Ainsi, malgré mon erreur de ne pas avoir calculé les CV inter-sériels, quasi tous les échantillons peuvent être validés sauf l échantillon 18. Pour la méthode automatisée, le laboratoire tolère 15%, mes CV inter-sériels sont tous en dessous, donc on peut les valider. De même, les CV des échantillons sont bons sauf les échantillons 8 et 9. Ces CV en dehors des normes peuvent s expliquer par une mauvaise homogénéisation des tubes avant la mesure analytique. Les échantillons qui n ont pas pu être validés, seront donc exclus de l analyse, d ailleurs, ils ne figurent pas sur les graphiques. Il est important de souligner que les CV des échantillons entre 5 et 15 sont plus élevés car une légère différence au niveau des valeurs fait vite augmenter les CV. Le CV inter-sériel de cette catégorie est aussi assez élevé comme ceux des échantillons, cela nous montre bien que plus les mesures sont petites plus la mesure d imprécision est élevée. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

24 5.2 Résultat de la 2 ème série Une série de 15 tubes prélevés sur Héparine-Lithium ont été passés sur le Sysmex XT-2000i durant 8 jours. Comme pour les échantillons sur EDTA, il manque 2 jours dus au weekend. Cet anticoagulant a été choisi car il peut être utilisé pour les analyses hématologiques, cependant celui-ci est moins stable et moins performant que l EDTA car il «abîme» plus rapidement les cellules que l EDTA. Dans cette 2 ème série toutes les lames ont été tirées pour la méthode manuelle, car les valeurs chute chaque jour et un comptage de ces cellules devient alors nécessaire afin d avancer dans l étude. Figure 20: Echantillons passés sur le Sysmex XT-2000i en mode RET Figure22 : Echantillons Héparine-Lithium comptés sur le Sysmex XT-2000i FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

25 Figure 21: Echantillons comptés avec la technique manuelle Figure 23 : Echantillons Héparine-Lithium comptés manuellement Les résultats montrent bien une diminution progressive du nombre de réticulocytes pour chaque échantillon et cela dans les 2 méthodes (manuelle et automatique) Remarque Sur le graphique on voit qu il y a une baisse progressive et lente des réticulocytes. On remarque, comme dans la 1 ère série que les CV de la méthode manuelle sont moins bon que ceux de l automate pour les même raisons que citées dans la 1 ère série. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

26 5.2.2 Validation des CV Le CV limite toléré du CSCQ ainsi que le CV toléré sur la méthode automatique ne sont pas valable dans cette analyse, ils sont basé sur le prélèvement de choix, à savoir l EDTA. Les résultats continuellement en baisse de cette série modifient la mesure d imprécision, cette analyse au point de vu des coefficients de variation n est donc pas valable. Malgré cela, ils ont quand même été calculés. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

27 5.3 Résumé sur les anticoagulants choisis Afin de mieux comprendre la différence entre ces anticoagulants voici un récapitulatif de leurs fonctions et de leurs composantes : EDTA L'EDTA (K3 EDTA) est le sigle de l'acide tripotassium éthylènediamine-tétraacétique. La formule chimique de cet acide diaminotétracarboxylique est C10H16N2O8. Ce tétra-acide est un agent chélatant puissant et forme des complexes métalliques très stables, ce qui en fait un poison. Cet anticoagulant est utilisé à une concentration de 1,5 mg pour 1 ml de sang complet. Le mode de cet anticoagulant est d «enlever» le calcium ionisé par un processus de chélation, le calcium devient alors insoluble et empêche la coagulation du sang. C est l anticoagulant de référence en hématologie. ( Figure 24 : Molécule de L EDTA Héparine-Lithium L héparine est une molécule qui fait partie des glycosaminoglycannes (GAG). Cet anticoagulant est utilisé à une concentration de 0.2 ml d héparine saturée pour 1 ml de sang complet. Cet anticoagulant est sous forme solide en petite bille. Il agit comme l antithrombine, il empêche la formation du caillot en inactivant la thrombine. C est un anticoagulant rarement utilisé en hématologie car il est moins efficace dans la «conservation» des cellules que l EDTA. (Turgeon,1993, p.16 et 17) FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

28 6 Discussion Tous ces résultats nous montrent bien qu il y a une aberration au niveau de la littérature sur la stabilité des réticulocytes. Il a été nécessaire de se renseigner auprès de plusieurs personnes et d effectuer des recherches littéraires afin de comprendre pourquoi la littérature citait à chaque fois que les réticulocytes n étaient stables que 24 heures après la prise de sang. Aucunes de mes recherches dans la littérature ne m a permis de comprendre pourquoi ces cellules étaient «censées» n être stable que 24 heures. Le personnel du service d hématologie du CHUV n avait pas vraiment d idée sur ce phénomène. Les hématologues du CHUV pensaient à un blocage au niveau de la maturation dû à l anticoagulant EDTA. Plusieurs mails ont aussi été envoyés à des hématologues mais aucune réponse ne m est parvenue. 6.1 Réflexion et hypothèses sur la stabilité des réticulocytes La stabilité des réticulocytes est inchangée avec l anticoagulant de base de l hématologie qui est l EDTA, il y a donc une incohérence entre les résultats de ce travail et la littérature. Effectivement la littérature cite que le réticulocyte reste que 24 heures dans la circulation sanguine mais ce n est pas le cas dans un tube de sang anticoagulé sur EDTA. A l époque, il se peut que la différenciation entre les réactions physiologiques in vivo (dans le corps) et in vitro (dans un tube) ne soient pas vraiment différenciées et ces croyances sont restées dans les mœurs. Les résultats sur EDTA avec la méthode manuelle montrent aussi une stabilité des réticulocytes sur plusieurs jours. Cela démontre bien que la structure granulofilamenteuse ne disparait pas même sur une longue durée. Cela contredit d avantage la notion de la stabilité sur 24 heures car même sans les nouvelles techniques automatisées actuelle, la stabilité dépasse ce délai. Cette source des 24 heures fut basée sur la technique manuelle, car à l époque les automates à cytométrie de flux n existaient pas. Alors comment se fait-il que de nos jours la technique manuelle donne des résultats stables sur une longue durée et qu à l époque non? Les hypothèses qui vont suivre peuvent répondre à cette question mais ce ne sont que des hypothèses. Il se peut aussi qu à l époque, l anticoagulant EDTA soit mis en excès dans les tubes et il détruisait les cellules. Cela serai assez plausible car les résultats de cette étude avec l anticoagulant Héparine-Lithium montre bien une diminution des réticulocytes au bout de 24 heures. J entends par là, que les connaissances sur les anticoagulants étaient moins précises à l époque que maintenant, un excès d anticoagulant pourrait avoir un effet nocif sur les cellules. De même, de nos jours certains anticoagulants valident la thèse des 24 heures, quelques années en arrière, il se peut que l anticoagulant EDTA validait aussi cette théorie. Les résultats sur Héparine-Lithium démontrent que la théorie de la stabilité des réticulocytes durant 24 heures est vraie mais il est rare d effectuer des analyses hématologiques avec cet anticoagulant. Ces résultats démontrent bien que la théorie de la stabilité des réticulocytes sur 24 heures est basée sur des faits. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

29 Il est aussi envisageable que l EDTA contiennent une substance qui bloque la maturation des réticulocytes, effectivement un métamyélocytes ne devient jamais un bâtonnet dans le tube de sang. Les leucocytes se détériorent assez rapidement dans un tube EDTA, dans cette étude, lors des comptages avec la méthode manuelle, les réticulocytes avaient un joli aspect sous le microscope. Bien sur que les globules rouge étaient un peu hémolysé mais les réticulocytes présentait bien, alors qu avec l anticoagulant Héparine-Lithium, ils étaient un peu «détériorés». Alors, il y a peut être une maturation des réticulocytes sur l anticoagulant Héparine-Lithium et sur EDTA celle-ci est bloquée. 6.2 Rajout de l analyse des réticulocytes Au vu des résultats obtenus sur les tubes EDTA, il serait possible d instaurer un rajout de l analyse des réticulocytes. Le rajout est possible mais est-il vraiment nécessaire? Pas forcément car BBR-LTC est un laboratoire ayant beaucoup d analyses venant de cliniques privées. Les patients, qui sont en clinique, sont hospitalisés et sont à disposition s il est nécessaire de les repiquer afin de faire la numération des réticulocytes. Il est vrai que pour les cabinets médicaux ce rajout serait intéressant. Néanmoins les résultats d analyse sont assez vite transmis au médecin dans la journée, alors la numération des réticulocytes pourrait être demandé par le médecin en fin de journée et l analyse pourrait toujours être faîte sur le tube du jour. Lors de cette étude, la stabilité des réticulocytes a été prouvée sur 8 jours. Au vu de ces résultats, le laboratoire envisage alors de changer leur document, mais à combien de jours fixerai-t-il la faisabilité de cette analyse? Il est clair que les réticulocytes sont stables en tout cas 8 jours mais il serait inutile de fixer un rajout possible sur 8 jours. Car le patient a peut être une numération des réticulocytes dans son sang différente qu il y a 8 jours en arrière. Les numérations des cellules en hématologie varient rapidement selon les réactions du corps humain, il est donc préférable dans ces cas de refaire une prise de sang. De plus, le patient devra forcément retourner chez son médecin pour avoir les résultats de ces analyses. Si le médecin a oublié de demander l analyse des réticulocytes, il peut repiquer le patient au moment où il lui rend ses résultats. Un rajout sur 2 jours peut être envisageable car un cabinet médical peut être fermé un jour et les résultats des patients ne seront que étudiés le lendemain. Dans ces cas là, un rajout peut être utile. Le laboratoire pense modifier leur document en instaurant un rajout possible entre 2 à 3 jours maximum après la prise de sang. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

30 7 Conclusion Cette étude démontre bien que les réticulocytes sont stables plus de 24 heures sur EDTA, malgré cela la question du pourquoi la littérature cite qu ils sont stables plus de 24 heures reste ouverte. Pour y réponde, il faudrait approfondir les recherches sur l anticoagulant EDTA. Je n ai pas trouvé tous les composants de cet anticoagulant, ni de nos jours ni dans les années antérieures. Il serait intéressant de prolonger l étude et surtout de continuer les recherches littéraires afin de savoir comment la notion de la stabilité de 24 heures a été instaurée et sur quelles bases. D autres tests que les analyses hématologiques pourraient prouvé peut-être qu il y a un composant de l EDTA qui bloque la maturation des réticulocytes. Par rapport au rajout, je pense que ce serait une très bonne idée de l instaurer pour les cabinets médicaux. Les oublis d analyses arrivent assez souvent. Il faudrait pouvoir instaurer un temps limite telle que 2 jours comme cité préalablement. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté

31 8 Critiques personnelles La partie pratique c est très bien déroulée. Le début fut un peu difficile car l idée première de ce travail a dû être remise en cause. Parfois, ce fut aussi difficile de trouver les échantillons ayant une forte réticulocytose. La réalisation de cette étude fut remplie d aléas. Effectivement, la mise en œuvre d une étude pareille n est pas des plus simples. Car le raisonnement à faire afin d avancer n est pas toujours facile et prend souvent du temps, les techniques de validations sont différentes que durant nos cours, elles me paraissaient compliquer et grâce à ce travail elles me paraissent un peu plus claires. La rédaction fut parfois difficile mais enrichissante. La recherche des informations fut conséquente mais ça m a permis d approfondir mes connaissances et d évoluer dans mon travail. Ce travail m a permis de démontrer que, parfois, la théorie que l on croit vrai depuis des années peut être remise en cause. FutureLab BBR-LTC ème volée ESSanté