Cellules souches reprogrammées (ipscs) et Thérapie cellulaire. Loïc Garçon

Transcription

1 Cellules souches reprogrammées (ipscs) et Thérapie cellulaire Loïc Garçon.

2 Différents types de cellules souches Totipotentes Pluripotentes hes Multipotentes CSH

3 Les cellules souches totipotentes Peuvent développer après implantation in utero un embryon + les annexes Zygote fécondé Organisme entier Clonage Cellule somatique Ovocyte Dolly ( )

4 Les cellules souches pluripotentes = Cellules Souches Embryonnaires (ES) Ne peuvent développer après implantation les annexes extra embryonnaires Sont obtenues à partir d embryon surnuméraire après fécondation in vitro Stade blastocyste: prélèvement de la masse interne Colonie de cellules hes indifférenciées Mise en culture sur cellules stromales Limite éthique majeure à leur utilisation comme source cellulaire en thérapie cellulaire humaine

5 Intérêt des cellules hes Autorenouvellement: Possibilité d avoir une quantité illimitée de cellules indifférenciées Différenciation dans des milieux de culture donnée Permet d obtenir des cellules matures fonctionnelles différenciées ENDODERME Feuillet interne ECTODERME Feuillet externe Tube digestif et annexes (pancréas) Epiderme, système nerveux = Pluripotentes MESODERME Feuillet intermédiaire Hématopoïèse, muscle, vaisseaux

6 Comment tester la «pluripotence?» Protocole de différenciation in vitro Conditions de culture spécifiques à chaque lignage Formation de tératome chez la souris NOD-SCID Ectoderm Injection sous cutanée de cellules hes 8 semaines Tumeur sous cutanée = Tératome Mesoderm Endoderm

7 Modèle parfait en terme de thérapie cellulaire? Pas de limites de nombre de cellules Possibilité d obtenir des tissus matures Mais... Modèle «embryonnaire» Equivalent à du tissu adulte? Problème éthiques MAJEURS Comment trouver des cellules ayant les mêmes propriétés sans soulever de limitations éthiques?

8 Les cellules souches multipotentes Morphologies différentes Expressions Géniques différentes Fonctions différentes Incapables de se régénérer (sauf monocytes/lymphos): pas d autorenouvellement: elles sont figées dans leur différenciation Elles proviennent toutes d une même cellule souche Hématopoïèse: ensemble des processus hiérarchiques permettant une production régulée ET constante des différents éléments figurés du sang à partir d une cellule souche hématopoïétique Erythrocytes: par jour PN Neutrophiles: par jour Plaquettes: par jour

9 Schéma général de l hématopoïèse Cellules souches Progéniteurs CMP Common myeloid progenitor MEP Mega-erythroid progenitor GMP Ganulo-monocytic progenitor LT-HSC (Long-Term-HSC) ST-HSC (Short-Term HSC) CLP Common Lymphoid progenitor MATURATION TERMINALE: Acquisition des propriétés fonctionnelles O R G A N E S H E M A T O P. Cellules matures Erythrocytes Plaquettes Polynucléaire éosinophile Polynucléaire neutrophile Mastocyte Monocyte Lymphcyte B Lymphcyte T S A N G

10 Autorenouvellement Division asymétrique Concept de cellules souches multipotentes Deux propriétés fondamentales in vivo: AUTORENOUVELLEMENT Maintien d un pool de cellule souches Production d une cellule fille identique DIFFERENCIATION Production régulée d éléments matures Quiescence G0 Prolifération G1/S/G2/M Différenciation POOL DE CSH (90%) Progéniteur engagé Hiérarchie de cellules «souches» selon l étendue de cette différenciation

11 Quelles différences avec les cellules hes? 1- Potentialité restreinte à l hématopoïèse CSH X Autre mésoderme (muscle, vaisseaux) Endoderme Différenciation Ectoderme Erythrocytes Plaquettes Polynucléaire éosinophile Polynucléaire neutrophile Mastocyte Monocyte Lymphocyte B Lymphocyte T

12 Quelles différences avec les cellules hes? 2-Pas d auto renouvellement in vitro Différenciation obligatoire in vitro, on ne peut expandre les cellules CD34 + On ne sait reproduire le micro environnement médullaire Notion de niche hématopoïétique Exemple de l autogreffe: homing Exemple: myélome multiple Chimiothérapie de réduction Recueil de CSH Traitement intensif++ Aplasie très prolongée Colonisation de la MO Production de cellules matures Sortie d aplasie

13 Niche endostéale Ncad/Beta catenine VCAM Wnt1 TPO/Mpl SCF/c-kit Ang1/Tie2 CSH Quiescente Chémokines (CXCL-12/SDF1) MEC Niche vasculaire CSH En cycle Cellules endothéliales nombreuse (Hématopoïèse extramédullaire) Fibroblastes Ostéoclastes Ca 2+ Adipocytes Progéniteurs Travées Ostéoblastes SNS Cellules souches mésenchymateuses Ca 2+ Po2

14 Source idéale de cellules en thérapie régénérative Intérêt d un modèle pluripotent type hes Autorenouvellement in vitro Pluripotent Sans limite éthique à leur utilisation en thérapie cellulaire

15 La révolution ipsc Induced Pluripotent Stem Cells Cellules souches reprogrammées Shinya Yamanaka Cell, 131, , November 30, 2007 Décrites chez la souris en 2006 Décrites chez l homme en 2007

16 Fibroblaste 24 gènes candidats qui sont exprimés fortement dans les cellules ES 4 facteurs suffisent Oct4 Klf2 Sox2 cmyc

17 Formation de tératome: Cellules pluripotentes

18 Cellules pluripotentes participant à l embryogenèse in vivo Microinjection de cellules «reprogrammées» exprimant la GFP

19 Expression génique identique à celle des ES

20 Se maintiennent in vitro à l état indifférencié Passage 1 Passage 2 Auto renouvellement Passage n...

21 Fibroblastes cutanés Chez l homme...

22 Les hipscs expriment les marqueurs de cellules hes

23 Les hipscs prolifèrent in vitro à l état indifférencié Auto renouvellement

24 Les hipscs sont pluripotentes Induction de tératome

25 Amélioration des hipsc Source cellulaire Fibroblastes cutanés Cellules mononuclées (CD34 + ) Vecteurs de reprogrammation

26 Différents types de vecteurs Reprogrammation de cellules humaines Rétrovirus Lentivirus Lentivirus CRE/LOX Implique la division cellulaire Intégration définitive dans le génome de la cellule cible Persistance d une séquence exogène Vecteurs NON intégratifs - Adénovirus: efficacité de reprogrammation très faible - Virus Sendaï: - Virus ARN qui ne rentre pas dans le noyau: se dilue après 10 divisions - Grande efficacité de production protéique Efficacité de reprogrammation de 1% (fibroblastes) et de 0,1% pour les cellules sanguines

27 Méthodes alternatives Reprogrammation par injection de protéines Difficile++++, nécessite de protéine des protéines in vitro et de les injecter dans les fibroblastes Efficacité de programmation faible: 0,001% (Kim D et al, Cell Stem Cells, 2009) Reprogrammation par transfection d ARN Validée à partir des fibroblastes, bonne efficacité mais lourd (Warren et al, Cell Stem Cell, 2010) Reprogrammation par mirna Certains mirna sont fortement exprimés dans les hes Adjonction de mir 302b et/ou mir 372 aux 4F augmente de 15 fois l efficacité de reprogrammation Certaines combinaisons de mirna peuvent reprogrammer seules, sans les 4F

28 Les vecteurs épisomaux Production de ipscs sans «footprint» génomique

29 Intérêt des ipscs chez l homme Nombre illimité de cellules Modélisation de pathologies rares Compréhension physiopathologique Thérapie génique Thérapie cellulaire/médecine régénérative

30 Modélisation/thérapie génique Exemple de l anémie de Diamond Blackfan (DBA)

31 DBA -Généralités Syndrome d insuffisance médullaire constitutionnelle Transmission autosomique dominante avec pénétrance variable Atteinte sélective de la lignée érythroïde DBA: Maladie du RIBOSOME Mutations dans les gènes codant pour les riboprotéines dans plus de 50% des cas RPS19 (25%), RPL5 (7%), RPS24, RPS17, RPL35A RPL11, RPS7, RPL36, RPS15, RPS27A Boria I et al, Hum Mutat. 2010;31(12): Flygare, J. et al. Blood 2007;109:

32 Pourquoi des ipscs dérivés de DBA? Intérêt des ipscs comme source illimitée de cellules porteuses de la mutation Modélisation Criblage de molécules Thérapie génique Patient Cells Mutation Clone Vector Passage Caryotype Pluripotentialité /Tératome DBA 6.2 +/p.q126x fibroblastes cutanés RPS 19 Clone # 4 STEMCCA Tet on >40 Normal Fait DBA /p.r23x fibroblastes cutanés RPL 5 Clone # 3 STEMCCA >20 Normal Fait

33 Correction phénotypique par intégration génomique au sein du locus AAVS1 du cdna codant pour la protéine sauvage ZFN Target site AAVS1 locus Exon1 Exon2 paavs1-puro- CAGG-RPS19 or paavs1-puro- CAGG-RPL5 HA-L SA-2A-Puro-PA CAGG RPS19 or RPL5 HA-R - «Safe Harbor» pour une intégration génomique: effets minimaux sur les gènes avoisinants - Expression stable du transgène, sans extinction. Hockemeyer D. Nat Biotechnol. 2009;27(9): Zou J,. Cell Stem Cell. 2009;5(1): Ogata T,. J Virol. 2003;77(16): Smith JR,. Stem Cells. 2008;26(2): Epub 2007 Nov Zou J. Blood. 2011;117(21):

34 Protocole de différentiation hématopoïétique CD41 CD18 VEGF 50ng/mL BMP-4 25 ng/ml VEGF 50ng/mL BMP-4 25 ng/ml bfgf 20ng/mL Flt3 10 ng/ml VEGF 50ng/mL TPO 50 ng/ml bfgf 20ng/mL Flt3 50 ng/ml SCF 50 ng/ml VEGF 50ng/mL TPO 50 ng/ml Il-6 10 ng/ml Il-3 10ng/mL Flt3 50 ng/ml SCF 50 ng/ml EPO 2U/mL IGF-1 25 ng/ml Jour 0 Jour 2 Jour 4 Jour 8 Jour 14 ipscs Induction mésodermique Induction hémangioblastique Induction hématopoïétique Progéniteurs hématopoïétiques MKs 18% 3% 24% Ery CD235 (Glycophorine A) 56% My CD45

35 CD41 ratio /WT % cellules Clone +/p.q126x: Déficit érythroïde 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Déficit quantitatif et qualitatif 1,2 ** n=2 n=5 100% 80% 60% 40% 20% 0% Ratio des différentes lignées à J 14 WT2 WT3 WT2 WT3 WT WT 1 WT1 +/p.q126x Cytométrie de flux à J14 +/p.q126x 73% My Ery MKs 0 WT2 WT3 WT1 +/p.q126x WT2 WT3 WT1 RPS 24% 2% CD235

36 Effet de l expression forcée de RPS19 sur la différenciation hématopoïétique CD41 Ratio Ery/non Ery Augmentation du nombre de progéniteurs Nb cells/puit x ** n=4 0 GFP RPS19 Correction du défaut sélectif érythroïde GFP RPS19 0,5 0,4 ** ** ** ** 3% 35% 0,3 0,2 0,1 * NS CD235 0,0 WT1 1 WT2 2 WT3 3 +/p.q126 4 GFP 5 RPS19 6

37 Conclusions Possibilité de reprogrammer des ipscs à partir de DBA Faible efficacité: intérêt d autres vecteurs de reprogrammation? Défaut érythroïde d intensité variable Ce déficit peut être corrigé par expression forcée après ciblage génomique Intérêt ultérieur en thérapie génique MAIS: Modèle d hématopoïèse primitive

38 Limite actuelle des ipscs dans les maladies du sang Greffe de cellules souches hématopoïétiques: injection par voie IV de cellules souches hématopoïétiques: Exemple: myélome multiple - Autologue: autogreffe: support transfusionnel Recueil de CSH Chimiothérapie de réduction Traitement intensif++ Aplasie très prolongée Colonisation de la MO Production de cellules mature Sortie d aplasie - Non autologue: allogreffe: Remplacement d une système hématopoïétique pathologique d un receveur par un système hématopoïétique d un donneur sain, effet immunologique antitumoral Graft Versus Leukemia. * Donneur compatible intrafamilial/fichier * Sang de cordon

39 Utilisation de HSC dérivées d ipscs comme source cellulaire en transplantation autologue? Reprogrammation Cellules somatiques ipscs Différenciation Correction génique - Talen - CrispR - ZFN HSC corrigées ipscs corrigées ACTUELLEMMENT IMPOSSIBLE Erythrocytes Plaquettes Polynucléaire éosinophile Polynucléaire neutrophile Mastocyte Monocyte Lymphcyte B Lymphcyte T

40 Autres applications en thérapie régénérative - Maladie hépatique: Déficit en alpha 1 antitrypsine (Yusa et al, Nature, 2011) DF ipscs Foie Transplantation in vivo Chez la souris Correction génique

41 Nombreux essais cliniques en cours/programmés

42

43 Érythropoïèse in vitro Application possible en médecine transfusionnelle.

44 Possibilité de produire des érythrocytes matures et fonctionnels: A partir de cellules CD34 + sans sérum (MC Giarratana et al, Nat Biot., 2005) CD 34 + EPO-IL3-SCF J1-J8 EPO-CELLULES STROMALES J9 J11 CELLULES STROMALES J11-J20 A partir de cellules CD34 + sans sérum et sans stroma (MC Giarratana et al, Blood., 2011) LK CD 34 + EPO-IL3-SCF J1-J7 EPO-SCF J7-J11 EPO J % plasma humain ½ vie: 37 à 54 jours Transfusion autologue Après marquage Cr 51

45 1 Le nombre de GR SP 1 CD34 + SP1 unité GRs GRs = 50 à 100 X - Possibilité de produire des GR de groupes sanguins rares - Mais production d HbF 2 Dépendance au don CD 34 + EPO-IL3-SCF J1-J7 EPO-SCF J7-J11 EPO J % plasma humain PEU D AUTORENOUVELLEMENT - Nécessité de banques - Différenciation non continue

46 Possibilité de produire des érythrocytes matures et fonctionnels: A partir de ipscs/hes (H. Lapillonne et al, Haematologica, 2010): AUTORENOUVELLEMENT MAIS!!! 1- Enucléation faible 2-Erythropoïèse «primitive» 3-Aspect quantitatif

47 Reprogammation directe.

48 Reprogrammation directe: transdifférenciation MyoD (Tapscott SJ et al, Nature, 1988) Ascl1, Brn2, Myt 1, Neuro D1 (Pang ZP et al,, Nature, 2011) GATA 4, Mef 2c, Tbx5 (Ieda M et a, Cell, 2010)) GATA 4, Hnf1, Foxa3 p19arf (Huang et al, nature, 2011)) GATA 4 Mef 2c Tbx5 GFP Cardiomyocytes GFP + Amélioration de la fonction cardiaque (Quian L et al, nature, 2012)

49 Reprogrammation directe et hématopoïèse Expression forcée d OCT4 dans des fibroblastes humains Szabo E. et al. Nature 458, (2010) doi: /nature09591 Reprogrammation directe de fibroblastes humains en mégacaryocytes Ono Y et al, Blood, 120, (2012)