Épreuve B (durée 3h) 15 décembre 2010 L auxine dans le développement post-embryonnaire des Angiospermes

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1 Épreuve B (durée 3h) 15 décembre 2010 L auxine dans le développement post-embryonnaire des Angiospermes Les plantes produisent des substances considérées comme des hormones végétales car sécrétées en très faibles concentrations mais ayant des effets considérables, même en quantité infime. Pour exemple, vous trouverez ci-dessous la formule chimique d une auxine, l acide indol acétique (AIA). L auxine est impliquée dans de nombreux processus de contrôle du développement des Angiospermes. Ce devoir vous permet d en étudier trois. A partir de l exploitation des documents et de vos connaissances, vous étudierez quelques-uns des rôles de l auxine (noté AIA) dans le développement post embryonnaire des Angiospermes. Vous limiterez l exposé aux thèmes indépendants abordés par les documents. -Vous rédigerez une introduction (1,5pt) et une conclusion générale (1pt). - Votre exposé sera structuré en un plan hiérarchisé (1,5pt). - Vous synthétiserez toutes les données obtenues dans un schéma-bilan à la fin de chaque thème. - Les documents peuvent être découpés et collés sur la copie, à condition d être exploités. - Il sera tenu compte du soin de la copie comme de la qualité de la rédaction et de l orthographe (1,5pts) Thème 1 - Auxine et ramification (7,5pts) Document 1-1: distribution de l auxine au niveau d une plantule d Avoine, en ordonnées, concentration de l auxine (merci à L. Géray) plantule d Avoine apex tige Reste des réserves de la graine racine 1

2 Documents 1-2 Phénotype de la ramification chez un mutant insensible à AIA Document 2a - Morphologie d un plant de Arabidopsis thaliana. Wt plante sauvage, axr1-12 mutant insensible à l auxine (la production d auxine est normale mais certaines cellules sont incapables de recevoir le signal auxine) Des données quantitatives sont regroupées dans le tableau 2b. Les 2 barres représentent la même distance Genotype Tableau 2b comparaison du phénotype sauvage et du mutant axr1-12, au même âge Données: moyenne±écart-type; (nombre de plantes étudiées) n= 20. Rapport entre la longueur des rameaux latéraux et la longueur de la tige principale Longueur de la tige principale (cm) Sauvage (wt) 0,40 ± ,7 ± 1.06 axr1-12 1,20±0.24 7,93±0.93 Document 1-3: On teste l effet de l auxine sur des fragments de tiges de génotype sauvage cultivés in vitro, et en entier (avec l apex). On mesure la longueur des rameaux latéraux. On peut appliquer en plus de l auxine soit du côté apical (cercles vides), soit du côté basal (carrés). Les témoins correspondent à des fragments de tige cultivés in vitro sans ajout d auxine (cercles pleins). 2

3 Thème 2 : Auxine et croissance des tiges (10,5pts) (merci à C. Kleman) Document 2-1. Effet de l'auxine sur la croissance de tiges de Pois d'après Jacobs et Ray, Plant Physiol., 1986 Des segments de tige de taille déterminée sont mis en culture dans des boîtes de pétri et leur taille est mesurée régulièrement à l'aide d'un micromètre situé sur l'oculaire d'un microscope. En parallèle, le ph pariétal de ces segments est mesuré à l'aide d'une microélectrode. A B Temps (minutes) A: élongation moyenne des segments de tiges (microns=micromètres). B: ph des parois des cellules de ces mêmes tiges. La flèche indique le moment où 20 mmol d'auxine (AIA) ou bien du tampon seul est ajouté(e) au milieu de culture des tiges. Chaque point est établi à partir d'une mesure effectuée sur 30 segments, les barres verticales correspondent aux erreurs standard de chaque point. (A) (B) dépôt Document 2-2: gel d'électrophorèse de protéines de tige de Pois, coloré au rouge ponceau (A) ou mis en présence d'un anticorps dirigé contre les pompes à protons membranaires (H + -ATPase) (B) Les tiges de Pois sont préalablement traitées à l'auxine (+ AIA) ou non (-AIA); les protéines de ces tiges sont extraites puis soumises à une électrophorèse en présence de SDS. (d'après Rober-Kleber et coll., Plant Physiol., 2003) 3

4 Document 2-3 (d après Berger et Gloumph, Plant Cell, 2006) A- Expression du gène de l'expansine dans de jeunes plants de Pois (in vivo). L'expansine est une protéine de la paroi, dont le rôle est de casser les liaisons non covalentes entre hémicelluloses et microfibrilles de cellulose. L'expression d'un gène est fréquemment étudiée à l'aide de "RNA-blot" (= "empreinte d'arn" en français), qui mesure la quantité d ARNm pour le gène étudié dont voici le principe succinct : - Les ARN d'un fragment de végétal sont purifiés. - Ces ARN sont séparés par électrophorèse. - Les ARN séparés sont transférés sur une membrane, pour faire une empreinte : le gel d'électrophorèse est mis au contact de la membrane et les ARN du gel se fixent sur la membrane tout en conservant la disposition en bandes séparées acquises lors de l'électrophorèse. - Cette membrane est mise au contact d'une sonde radioactive (= hybridation); la sonde est un fragment de 20 à 30 nucléotides, correspondant à un morceau de séquence du gène que l'on souhaite détecter. -Après plusieurs rinçages, la membrane hybridée est mise au contact d'un film photographique, qui réagit uniquement au rayonnement radioactif en devenant noir. Dans cette expérience, la tige de plantule de Pois a été sectionnée en 4 fragments notés A, B, C et D, dont on a extrait séparément les ARN (voir figure de plantule ci-dessous). Ensuite deux sondes ont été utilisées, sur 2 RNA-blots identiques : une sonde correspond à un morceau du gène de l'expansine (noté LeExp2); l'autre à un morceau de gène d'arnr (ou rrna). Ébauches de feuilles racines RNA-blots réalisés à partir de 4 fragments de tiges de Pois, et testés avec 2 sondes différentes. En parallèle sont indiqués les taux de croissance de chacun de ces fragments : seul le fragment D ne présente aucune croissance détectable. B- Expression du gène de l'expansine invitro et effet de l auxine dans cette expérience, des tiges de Pois entières sont incubées pendant 12 heures dans 4 boîtes de pétri contenant un milieu de culture nutritif. Au bout de ces 12 heures, on rajoute de l'auxine en concentration variable dans les 4 boîtes de pétri. Après 24 heures de mise en contact avec l'auxine, les ARN des tiges des 4 boîtes sont extraits et traités pour faire deux RNA-blots. RNA-blots réalisés à partir de tiges de Pois soumises à des concentrations croissantes d'auxine (de 0 à 10 mmol.l -1 ), et testés avec 2 sondes. 4

5 Thème 3 : Auxine et différenciation du xylème (9,5pts) (merci à C. Kleman) Document 3-1 La différenciation du xylème est étudiée chez le végétal Zinnia elegans : des cellules isolées de ce végétal et mises en culture en présence d auxine se différencient en éléments de xylème. On mesure le pourcentage de cellules différenciées en éléments de vaisseau de xylème, dans le milieu de culture contenant de l auxine. (d'après Thelen et Northcote, Planta, 1989) Document 3-2 : Synthèse d une enzyme pariétale de synthèse de la lignine et auxine Les RNA-blot (voir technique thème précédent) sont réalisés à partir de cellules isolées de Zinnia - prélevées à différents temps de culture - mise en culture dans un milieu avec auxine (+AIA) ou sans (-AIA) La sonde utilisée est dirigée contre l ARNm d'une enzyme pariétale permettant la mise en place de la lignine. (d'après Ye et Varner, PNAS, 1994) Document 3-3 : Hybridation in situ réalisée sur une empreinte de coupe transversale de tige de Zinnia. Une coupe fraîche de tige est pressée sur une membrane, afin d'effectuer une empreinte des tissus. La membrane est ensuite traitée avec la même sonde que dans le document 3-2 (d'après Ye et Varner, PNAS, 1994) (A) coupe transversale de tige de Zinnia Barre d échelle= 0.4 mm. (B) détail de la partie périphérique de la tige (voir page suivante) (C) Hybridation in situ réalisée sur l'empreinte de tige de Zinnia (même échelle qu'en A). 5

6 (B) Document 3-4 : Etude d un mutant à faible différenciation du xylème Pour mieux comprendre les mécanismes de différenciation, on a isolé des mutants de Zinnia qui présentent une faible différenciation du xylème dans leur tige (peu de vaisseaux sont produits et ils apparaissent plus bas dans la tige que chez le plant non muté) : deux mutants différents du gène ifl1 ont été ainsi isolés et sont notés ifl1-1 et ifl1-2. (d'après les travaux de Zhong et Ye, Plant Physiol., 2001) A- Comparaison des taux de radioactivité des extrémités basales de tiges de plants sauvages (notés WT) ou mutés. Des segments de tiges sont prélevés dans la zone en croissance située juste sous le méristème apical caulinaire. L'extrêmité du segment qui était située du côté du méristème plonge dans une solution nutritive contenant 1,5mmol.L -1 d'auxine radioactive. Après des temps d'incubation variables dans l'auxine radioactive, l'autre extrêmité (= extrêmité "basale") est récupérée pour faire un comptage de radioactivité. Taux de radioactivité (en coups par minute) B- RNA-blots (principe donné dans le document 2-3) réalisés à partir de tiges de plants sauvages ou mutés, et testé avec des sondes de 4 gènes de transporteurs membranaires à auxine (notés PIN1, PIN3, PIN4 ET PIN 6) 6

7 Correction DS n 4 (total 33pts) L auxine dans le développement post-embryonnaire des Angiospermes Thème 1- Auxine et ramification (7,5pts) A- L auxine montre un gradient de concentration apico-basal Doc 1-1 Rés : On observe un gradient de concentration de AIA: la concentration maximale est mesurée au niveau de l apex de la tige d où elle décroît. Puis il y a une augmentation de la concentration en direction de l apex racinaire. (0,75) Int: L auxine est synthétisée au niveau de l apex caulinaire (0,5) puis elle migre de façon orientée (transport basipète 0,5) jusqu aux racines, où il y a stockage et même transport basifuge (moins important). (0,5) B- L auxine est impliquée dans le contrôle du nombre et de la longueur des ramifications Doc 1-2 (image et tableau) Rés La comparaison entre le mutant axr1-12 et le sauvage montre que : - la tige principale et les feuilles sont significativement plus courtes chez le mutant (0,25) - les tiges portent plus de ramifications chez le mutant. (0,25) - les tiges portent des ramifications longues chez le mutant : le ratio (longueur rameaux)/(longueur tige principale) est plus élevé chez le mutant. (0,25) Donc le gène axr1-12 active l élongation de la tige principale et inhibe le développement du nombre et de la taille des ramifications (0,75) Comme il est indiqué que le mutant est insensible à AIA, on peut faire l hypothèse que c est l auxine qui active l élongation de la tige principale et inhibe le développement du nombre et de la taille des ramifications (0,5) C- L auxine agit sur la ramification en lien avec le transport basipète Doc 1-3 Rés : Le témoin montre que la longueur des rameaux augmente jusqu à stagner à une longueur de 30-35mm après 8 jours. (0,25) L application d auxine au côté apical ralentit et limite la croissance des rameaux (10-15 mm après 8 jours) Int : l auxine a bien un effet inhibiteur de la croissance des ramifications. (0,5) Rés : L application d auxine au côté basal n a aucun effet sur la croissance des ramifications, la courbe de croissance est identique à celle du témoin, les intervalles de confiance se chevauchent (0,5). Int : l auxine exerce son effet à la suite d un transport de l apex vers les rameaux secondaires (toujours le transport basipète, indispensable) (0,5). Schéma bilan (1,5) Le gène axr1-12 est impliqué dans la réception du signal AIA Thème 2 : Auxine et croissance des tiges (10,5pts) A- L auxine active l élongation des tiges par une baisse du ph pariétal Doc 2-1 (A) Rés 1: 20 minutes après l ajout d'aia, l élongation augmente fortement par rapport au témoin (de 60 à 240 mm, contre 50 à 80 mm pour le témoin) donc l élongation de la tige a lieu avec ou sans AIA, mais AIA stimule l'élongation de la tige. (1) (B) Le ph des parois reste autour de 5,8 en présence de tampon (compte tenu des erreurs standard). Alors que le ph baisse significativement par rapport au témoin après 10 min de mise en contact avec l'aia, passant de 5,8 à 4,8 Donc AIA fait diminuer le ph des parois (1) Le ph diminuant AVANT que l'élongation ne soit augmentée fortement (10 minutes d'écart), on peut supposer que la baisse de ph induit l'élongation accrue. (0,75) B- L auxine active la synthèse d un pompe à H + ATPase permettant le contrôle du ph pariétal Doc 2-2 Protocole: L électrophorèse est en conditions dénaturantes avec ajout de SDS, les protéines sont dépliées, la séparation des protéines se fait seulement selon leur masse moléculaire MM (0,25)

8 (A) On observe de nombreuses bandes colorées au rouge ponceau: chaque bande correspond à une protéine de MM donnée. Les bandes sont identiques dans les 2 pistes (+/- AIA) donc AIA n a pas d effet sur la composition globale en protéines. (0,75) (B) On observe une seule bande très épaisse, d'environ 100 kda dans la piste correspondant aux tiges traitées à l'aia; cette bande existe mais est peu visible pour les tiges non traitées à l'aia (0,5) La révélation est ici spécifique (grâce à l'ac) c est la protéine "pompe à H + ", de MM 100 kda (0,5) Interp: la pompe à protons est plus abondante après traitement à l'aia, donc AIA stimule la synthèse de pompe à H +. (0,5) Conclusion: L auxine stimule ainsi indirectement la sortie de H +. Ceci explique pourquoi l'aia diminue le ph pariétal (0,5) C- L auxine active aussi la synthèse des expansines, indispensables à l élongation Doc 2-3 A- Protocole Les RNA-blots permettent de connaitre la quantité d'un type d'arn (ARNm de l'expansine ou ARNr), par conséquent de déterminer le taux d'expression du gène correspondant. (0,5) Le RNA-blot des ARNr est un témoin montrant que l expression des gènes d ARNr ne dépend pas de la position dans la tige. (0,5) Rés: Les bandes sont d'épaisseur croissante avec la sonde LeExp2, la quantité d'arnm de l'expansine est croissante du fragment D (sans ARNm de l expansine) au fragment A (forte qté d ARNm de l expansine) Or les fragments D à A ont une croissance de plus en plus forte. Hypothèse: Une expression forte du gène de l'expansine entraîne de grandes quantités de protéines expansine. Ces protéines brisent les liaisons faibles entre molécules de la paroi, d'où une élongation cellulaire possible. (1) Doc 2-3 B- Témoin Avec la sonde rrna, les bandes sont toutes de même épaisseur, la quantité d'arnr est la même quelle que soit la quantité d'aia rajoutée donc AIA n'agit pas sur l'expression du gène de l'arnr dans les tiges. (0,5) Rés: Avec la sonde LeExp2, aucune bande n est observable sans AIA, et l épaisseur des bandes croît quand la quantité d'aia augmente Donc AIA stimule l'expression du gène de l'expansine dans les tiges, et par ce biais, l'élongation de la tige. (0,75) Schéma bilan (1,5) Thème 3 : Auxine et différenciation du xylème (9,5pts) A- L auxine active la différenciation des vaisseaux du xylème 1) Cinétique de la différenciation des vaisseaux du xylème Doc 3-1 après 60 heures de contact avec AIA, les premières cellules mises en culture se différencient; la différenciation est importante entre 60 et 80 heures de mise en culture (30 % de différenciation), audelà la différenciation plus lente (0,5) 2) L auxine active la synthèse d une enzyme de lignification

9 Doc 3-2 On observe les bandes (correspondant à l ARNm de l'enzyme de lignification seulement à partir de 48 heures de mise en culture (a), et seulement en présence d'aia. Donc (a) le gène de l enzyme de lignification s'exprime plusieurs heures avant le début la différenciation (cf 3-1), cette enzyme est impliquée dans le processus de différenciation des vaisseaux du xylème, qui passe par une lignification de la paroir (0,75) Et (b) la synthèse de l enzyme est activée par l'aia. (0,5) Conclusion: AIA a un rôle d activation de la différenciation des vaisseaux du xylème (0,25) 3) Localisation de la synthèse de l enzyme de lignification Doc 3-3 (A)légende de la CT de tige ou schéma avec figurés conventionnels : faisceau cribro-vasculaire (xylème +phloème)/ parenchymes médullaire et cortical (0,75) (B) légende du détail : P=Phloème et X=Xylème superposés, fc/ic: cambium + parenchymes + épiderme + pf = sclérenchyme (1,5) (C) Protocole: L hybridation in situ permet de localiser des ARNm spécifiques et donc de localiser l expression d un gène (ici de l enzyme de synthèse de la lignine) (0,25) Rés: Le marquage spécifique par la sonde est localisé seulement sur le xylème et le sclérenchyme. Donc l ARNm et par conséquent l enzyme de lignification exprimés dans des tissus spécifiques, ceux qui sont lignifiés. (0,5) B- Le transport basipète de l auxine est important dans son action sur la différenciation du xylème Doc 3-4 (A) Le taux d'aia radioactive détectée côté basal de la tige augmente régulièrement pour les tiges de plants sauvages, jusqu'à atteindre un maximum après 30 et 48 heures d'incubation avec AIA* (600 CPM); L allure de l évolution de la radioactivité est la même pour les plants mutés mais les taux de radioactivité détectés sont toujours plus faibles (maximum à 400 CPM après 48h pour les mutants ifl1-1, 150 CPM pour les mutants ifl1-2) (0,5) Donc on retrouve le fait que AIA circule dans la tige selon le sens apex -> base de la tige : transport basipète Et ce transport est beaucoup plus limité dans le cas des mutants (perte de 30% à 75%), (0,5) d où l hypothèse : ces mutants n ont que peu de xylème différencié par manque d AIA dans la zone de différenciation (du côté basal) (0,5) Doc 3-4 (B) Rés 1: Les bandes sont d'épaisseur égales avec les sondes PIN1 et PIN6, pour les plants sauvages et mutés donc les plants sauvages et mutés produisent les mêmes quantités d'arnm donc de transporteurs à AIA Pin1 et Pin 6 (0,5) Rés 2: Les bandes sont absente ou plus fines avec les sondes PIN 3 et PIN4 pour les mutants par rapport aux sauvages donc les gènes Pin3 et Pin4 s'expriment moins chez les mutants. Il y a donc beaucoup moins de transporteurs à AIA pin 3 et 4 (surtout chez ifl1-2). (0,5) Par conséquent, chez les mutants, la différenciation du xylème ne se fait pas car le manque de transporteur d'aia conduit à un déficit d'aia dans les tissus précurseurs du xylème (0,5) Schéma bilan (1,5) 9