Mise au point du diagnostic prénatal de la thrombopénie fœtale allo-immune

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1 Université Paris VI - UPMC MASTER SCIENCES ET TECHNOLOGIE Mention BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE 1 ère année de Master Mise au point du diagnostic prénatal de la thrombopénie fœtale allo-immune Aurélie DENIS Responsable du laboratoire : Dr Cécile KAPLAN Maître de stage : Emilie LE TORIELLEC Laboratoire d Immunologie Plaquettaire Institut National de la Transfusion Sanguine 6 rue Alexandre Cabanel Paris cedex 15

2 Université Paris VI - UPMC MASTER SCIENCES ET TECHNOLOGIE Mention BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE 1 ère année de Master Mise au point du diagnostic prénatal de la thrombopénie fœtale allo-immune Aurélie DENIS Responsable du laboratoire : Dr Cécile KAPLAN Maître de stage : Emilie LE TORIELLEC Laboratoire d Immunologie Plaquettaire Institut National de la Transfusion Sanguine 6 rue Alexandre Cabanel Paris cedex 15

3 REMERCIEMENTS Je remercie, tout d abord, le Docteur Cécile KAPLAN-GOUET responsable du laboratoire d Immunologie plaquettaire de m avoir accueillie au sein de son équipe. Je tiens à remercier particulièrement Madame Emilie LE TORIELLEC, mon maître de stage, ingénieur de recherche, pour avoir encadré mon travail, et pour la confiance qu elle m a accordée tout au long de ce stage. Je remercie également Monsieur Gérald BERTRAND, ingénieur de recherche, pour tous ses conseils et ses explications, et pour son extrême gentillesse. Merci à Monsieur Vincent JALLU, ingénieur de recherche, pour sa bonne humeur et d avoir partagé son bureau avec moi. Je remercie également toute l équipe du laboratoire : Corinne MARTAGEIX, Jeannine QUESNE, Frédéric BIANCHI, Christophe CHENET, Cécile CASALE, Thomas BERANGER, Sébastien PHILIPPE, Nicolas GIULIANI, Virginie DUFOUR et la secrétaire Théréza MARIE pour leur disponibilité et leur sympathie. Toutes ces personnes ont contribué, par leur disponibilité et leur bonne humeur, à rendre mon stage enrichissant et motivant.

4 RESUME Les thrombopénies fœtales et néonatales alloimmunes sont les plus fréquentes des thrombopénies isolées sévères du fœtus et du nouveau-né avec une incidence estimée à un cas pour 800 à 00 naissances et sont à l origine d accidents hémorragiques graves. Elles résultent de l immunisation maternelle vis-à-vis des antigènes plaquettaires du système HPA (Human Platelet Alloantigen) présents chez le fœtus et absents chez la mère. Les plus fréquents, dans la population caucasienne, sont HPA-1a, -3a et -5b. Le diagnostic prénatal (DPN) des thrombopénies fœtales est réalisé à l heure actuelle à partir d amniocentèse, un geste invasif pouvant être à l origine de fausses couches spontanées. Le DPN non invasif est donc un enjeu majeur du laboratoire d immunologie plaquettaire. Une méthode de génotypage sur l ADN fœtal présent dans le sang maternel a déjà été développée pour HPA-1 en combinant deux techniques : la PCR-SSP et la PCR-HRM afin de permettre un diagnostic non invasif plus sûr et à un terme précoce de la grossesse. L objectif de ce travail de recherche était d une part d augmenter la cohorte de patientes pour lesquelles un génotypage plaquettaire HPA-1 fœtal était nécessaire, afin de valider la méthode. D autre part, il s agissait de mettre au point un protocole pour le diagnostic prénatal des systèmes HPA-3 et HPA-5. Pour HPA-1, l incompatibilité ou la compatibilité avec le fœtus pour neuf patientes a pu être observée dans les deux techniques, augmentant ainsi la cohorte à 58 patientes. Le DPN pour HPA-3 a pu être mis au point, à l exception de l allèle «b» en PCR-SSP. La majorité des femmes impliquées dans une immunisation HPA-3 étant de génotype «bb», la recherche de l allèle «a», présent sur l ADN fœtal, permettra de diagnostiquer pour la majorité des cas une incompatibilité dans ce système. Pour HPA-5, la PCR-SSP a donné de bons résultats. De plus, le programme utilisé est le même que pour le système HPA-1, permettant un génotypage en même temps et donc un gain de temps sur le rendu des résultats et la prise en charge des patientes. La suite de ce projet consiste à valider la méthode de DPN pour les systèmes HPA-3 et -5 en effectuant ces techniques sur une centaine de patientes afin d évaluer la reproductibilité de la méthode. A terme, il ne sera plus nécessaire d effectuer des amniocentèses pour le diagnostic prénatal de la thrombopénie fœtale ou néonatale allo-immune, un simple prélèvement de sang maternel suffira au diagnostic. De tels progrès seront un atout considérable pour la prise en charge thérapeutique dans le domaine de la périnatalité, élément essentiel de la santé publique.

5 TABLE DES MATIERES ABREVIATIONS INTRODUCTION....1 I) Présentation.1 1) L INTS 1 2) Le laboratoire d immunologie plaquettaire 1 II) Les plaquettes.1 1) Structure..1 2) Fonction..2 III) Thrombopénie fœtales ou néonatale allo-immune 2 1) Aspects cliniques 2 2) Cause 3 3) Antigènes plaquettaires impliqués..3 4) Diagnostic...4 a) Cytométrie en flux 4 b) MAIPA 4 c) Typage plaquettaire.5 5) Prise en charge post-natale..5 6) Prise en charge des grossesses à risque. 5 OBJECTIF DU PROGRAMME DE RECHERCHE...6 MATERIELS ET METHODES 7 I) Matériels 7 II) Méthodes 7 1) Extraction ADN...7 2) Quantification..7 3) PCR-SPP.7 4) PCR-HRM... 9 RESULTATS... I) Validation de la méthode de DPN sur HPA-1... II) Mise au point du DPN sur HPA-3 14 III) Mise au point du DPN sur HPA DISCUSSION... 19

6 ABREVIATIONS ADN ARN Ct DMSO DNases DPN EDTA Fc FNAIT GP GIP HIC HLA HPA HRM IgG INTS MAIPA MgCl2 MHNN PCR PRP RNases SSP VIH Acide Désoxyribo Nucléique Acide Ribo Nucléique Threshold Cycle Diméthylsulfoxide DésoxyriboNucléases Diagnostic PréNatal Ethylène Diamine Tétra-Acétate Fragment constant Foetal and Neonatal Allo-Immune Thrombopenia Glycoprotéine Groupement d Intérêt Public Hémorragie Intracrânienne Human Leucocyte Antigen Human Platelet Antigen High Resolution Melting Immunoglobulines G Institut National de la Transfusion Sanguine Monoclonal Antibody Immobilization of Platelet Antigens Chlorure de Magnésium Maladie Hémolytique du Nouveau-Né Polymerase Chain Reaction Plasma Riche en Plaquettes RiboNucléases Single Specific Primer Virus de l Immunodéficience Humain

7 INTRODUCTION I) Présentation 1) L INTS L Institut National de la Transfusion Sanguine (INTS) est un Groupement d Intérêt Public (GIP). Il se rattache à la veille et la sécurité sanitaire. Ses activités sont dévolues à l'analyse, à la maîtrise et à la prévention des risques transfusionnels ainsi qu'à l'évolution de la transfusion sanguine et de la médecine transfusionnelle en France et dans le contexte européen. L INTS regroupe un centre national de référence pour les groupes sanguins, un centre national de référence pour la surveillance des hépatites B et C et du VIH, un laboratoire du polymorphisme génétique et un laboratoire d immunologie plaquettaire. 2) Le laboratoire d immunologie plaquettaire Ce dernier est un laboratoire multidisciplinaire regroupant des compétences en immunologie, hématologie, biochimie et biologie moléculaire. Il possède deux activités principales : laboratoire d analyses médicales et laboratoire de recherche fondamentale. Des prélèvements de patients thrombopéniques, provenant de tous les hôpitaux français et de grands laboratoires privés (Biomnis, Cerba) sont reçus. Plusieurs techniques sont utilisées pour la recherche d une cause immunologique à la pathologie : la détection des immunoglobulines (IgG) fixées à la surface des plaquettes par cytométrie en flux, la détection des anticorps anti glycoprotéines plaquettaires, libres dans le sérum ou fixés sur les plaquettes, par la technique MAIPA (Monoclonal Antibody Immobilization of Platelet Antigens) et le typage plaquettaire : phénotypage par méthodes sérologiques et génotypage par biologie moléculaire. II) Les plaquettes 1) Structure Les plaquettes sanguines, également appelées thrombocytes, sont les plus petits éléments figurés du sang. Ce sont des particules anucléées, discoïdes, mesurant de 2 à 3 µm de

8 diamètre et prenant naissance dans la moelle osseuse. Elles sont produites par fragmentation de précurseurs : les mégacaryocytes. Dans le sang, elles sont au nombre de à par mm 3 et leur durée de vie est d environ 8 à jours. Elles sont ensuite éliminées par les macrophages dans la rate 1. La membrane plasmique des plaquettes est composée de nombreuses glycoprotéines (GP) et de phospholipides. Ces GP, appartenant à la famille des intégrines, sont présentes sous forme de complexes multimoléculaires GPIIb/IIIa, GPIa/IIa et GPIb/IX. Elles portent des déterminants antigéniques, appelés HPA (Human Platelet Antigen), responsables d allo-immunisation lors de transfusions ou de grossesses 2. 2) Fonction Leur rôle majeur intervient lors de l hémostase primaire : elles permettent le maintien de l intégrité du système vasculaire et constituent la première ligne de défense contre les hémorragies grâce à leurs propriétés d adhésion, de sécrétion, d agrégation et leur activité pro-coagulante. La GPIa/IIa interagit avec le collagène, et la GPIb/IX avec le facteur vonwillebrand lié au sous-endothélium, ce qui permet la formation d une mono couche de plaquettes sur la lésion afin de l obstruer, et l activation des plaquettes se fait ensuite en quelques secondes. La GPIIb/IIIa se lie enfin au fibrinogène plasmatique afin de former un caillot réversible appelé thrombus 2. III) Thrombopénie fœtales ou néonatale allo-immune L allo-immunisation plaquettaire materno-fœtale, qui touche un cas sur 00 naissances, est à l origine de thrombopénies fœtales ou néonatales allo-immune (FNAIT : Fœtal and Neonatal Allo-Immune Thrombocytopenia), ayant pour conséquence une diminution de plaquettes. Cette affection est considérée comme l équivalent plaquettaire de la Maladie Hémolytique du Nouveau-Né (MHNN) avec cependant la possibilité que le premier enfant soit atteint 3. 1) Aspects cliniques Pour un nouveau-né, le diagnostic de FNAIT est suspecté lorsqu il présente des pétéchies ou un purpura généralisé à la naissance ou dans les heures suivantes, sans signe clinique d une infection ou de malformations. Les enfants avec une thrombopénie modérée sont asymptomatiques et le diagnostic peut être méconnu. Chez le fœtus, la thrombopénie peut être

9 suspectée à l échographie fœtale. Dans 20 à 30% des cas, l enfant présente une hémorragie intracrânienne (HIC) in utéro ou lors de l accouchement pouvant conduire dans à 15 % des cas au décès 4. 2) Causes La FNAIT résulte d une incompatibilité materno-fœtale pour un ou plusieurs antigènes plaquettaires fœtaux hérités du père et absents chez la mère. Au cours de la grossesse, lors d une incompatibilité entre les allo-antigènes plaquettaires de la mère et du fœtus, la mère peut s immuniser, synthétisant des anticorps d isotype IgG vis-à-vis des allo-antigènes du fœtus considérés comme étrangers. Le transfert transplacentaire des anticorps maternels IgG a lieu dès 14 semaines de gestation, et les antigènes plaquettaires étant exprimés fortement dès 16 à 18 semaines de gestation, les plaquettes fœtales recouvertes d anticorps vont pouvoir être détruites tôt dans la vie fœtale par le système réticulo histiocytaire 5. 3) Antigènes plaquettaires impliqués A ce jour, 28 allo-antigènes plaquettaires ont été décrits. La majorité d entre eux est située sur le complexe GPIIb/IIIa. On compte six systèmes bi-alléliques (HPA-1 à -5, et -15) (table1). Antigène Glycoprotéine Nucléotide modifié Acide aminé modifié Référence HPA-1 GPIIIa 176 T>C L33P Newman et al. 6 HPA-2 GPIb 482 C>T T145M Kuijpers et al. 7 HPA-3 GPIIb 2621 T>G I843S Lyman et al. 8 HPA-4 GPIIIa 506 G>A R143Q Wang et al. 9 HPA-5 GPIa 1600 G>A E505K Santoso et al. HPA-15 CD9 28 C>A S703Y Schuh et al. 11 Table 1 : Allo-antigènes plaquettaires fréquents. L allèle le plus fréquent est désigné par la lettre «a», l allèle le moins fréquent par la lettre «b». La différence entre les deux allèles est liée, dans la majorité des cas, à la substitution d un seul nucléotide (l antigène HPA-14w est une exception, le polymorphisme correspond à une délétion de trois nucléotides) 12. La fréquence des allo-antigènes plaquettaires varie selon la population. Chez les caucasiens, l antigène HPA-1a est le plus souvent impliqué et le plus sévère dans les thrombopénies

10 néonatales allo-immune suivi de HPA-5b et HPA-3a ; chez les Asiatiques il s agit de l antigène HPA-4b 13. 4) Diagnostic L enfant étant à risque hémorragique pendant toute la phase de thrombopénie sévère, il importe de faire rapidement le diagnostic de thrombopénie néonatale allo-immune afin de mettre en œuvre le traitement adapté. Le diagnostic est établi lorsque les allo-anticorps maternels sont identifiés correspondant à l incompatibilité antigénique plaquettaire entre la mère et l enfant. Il importe donc d effectuer la recherche et l identification de l alloanticorps maternel et d effectuer le typage plaquettaire de la famille 14. a) Cytométrie en flux La cytométrie en flux permet l identification des immunoglobulines associées aux plaquettes. Cependant, cette technique ne permet pas de déterminer si les anticorps sont fixés aux glycoprotéines ou au récepteur Fc des plaquettes. Cette technique, considérée comme un test de dépistage, ne permet pas d affirmer le caractère immunologique de la thrombopénie. En effet, les anticorps fixés aux plaquettes peuvent être dirigés contre le système HLA, les groupes sanguins ABO, ou les systèmes HPA 15. b) MAIPA A la différence de la cytométrie en flux, les méthodes d immunocapture antigénique permettent de caractériser ces anticorps. La détection des anticorps est réalisée par la technique de MAIPA (Monoclonal Antibody Immobilization of Platelet Antigens). Cette méthode immuno-enzymatique demeure la méthode de référence pour la détection et l identification des auto- ou allo-anticorps anti-gp plaquettaires. Elle est basée sur l immobilisation sur plaque des glycoprotéines plaquettaires sensibilisées par des anticorps monoclonaux murins. Seuls les anticorps ayant une spécificité pour les glycoprotéines, qu ils soient sériques ou fixés aux plaquettes, sont détectés 16.

11 c) Typage plaquettaire Le typage plaquettaire est réalisé par phénotypage grâce à des antisérums humains de référence contenant des anticorps anti-hpa1a, anti-hpa-3a, ou anti-hpa-5b. Cependant la connaissance des bases moléculaires des alloantigènes plaquettaires ainsi que le manque de réactifs sérologiques pour effectuer le phénotypage, ont conduit à la réalisation du génotypage plaquettaire. Le génotypage plaquettaire est effectué par une technique de PCR multiplexe qui associe l utilisation de billes fluorescentes et de puces à ADN (HPA BeadChip, BioArray Solutions). Pour le diagnostic prénatal sur liquide amniotique, le génotypage sur BioArray est associé à une technique de PCR SSP (Single Specific Primer - Polymerase Chain Reaction) 17. 5) Prise en charge post-natale En cas d hémorragie ou de numération plaquettaire inférieure à 30000/mm 3 pendant les 24 premières heures de vie, la transfusion de plaquettes maternelles lavées et irradiées est le traitement de choix. A défaut, le nouveau-né peut-être transfusé par des plaquettes de donneurs HPA-1bb (l incompatibilité HPA-1a étant la plus fréquente) ou en cas d urgence, par des plaquettes standards associées à l administration d immunoglobulines polyvalentes 18, 19. 6) Prise en charge des grossesses à risque Lors d une grossesse suivante, pour tout fœtus incompatible, le risque de récurrence est élevé avec une aggravation de l atteinte. Lorsque l incompatibilité entre les parents n est pas obligatoire (père hétérozygote pour un antigène plaquettaire), le laboratoire réalise un diagnostic prénatal par génotypage du fœtus. La prise en charge thérapeutique maternelle repose sur une injection hebdomadaire d immunoglobulines polyvalentes (1g/kg) de 16 à 20 semaines d aménorrhée jusqu au terme de la grossesse avec l éventuelle adjonction de corticoïdes à partir de 30 semaines. L accouchement est réalisé par césarienne 20.

12 OBJECTIF DU PROGRAMME DE RECHERCHE Le diagnostic prénatal (DPN) non invasif des thrombopénies fœtales est un enjeu majeur du laboratoire d immunologie plaquettaire. Le DPN est réalisé à l heure actuelle à partir d amniocentèse. Ce geste invasif peut être à l origine de fausses couches spontanées. Une méthode de génotypage sur l ADN fœtal présent dans le sang maternel a été développée, dans le laboratoire, pour HPA La combinaison de deux techniques de génotypage plaquettaire fœtal : PCR-SSP et PCR-HRM (High Resolution Melting - Polymerase Chain Reaction) à partir de l ADN fœtal circulant dans le sang maternel permet un diagnostic non invasif plus sûr et à un terme précoce de la grossesse. Deux autres systèmes sont régulièrement impliqués dans les thrombopénies fœtales et néonatales : HPA-3 et HPA-5. Cependant il n existe pas, à ce jour, de diagnostic prénatal non invasif pour ces systèmes. L objectif de ce travail de recherche est d une part d augmenter la cohorte de patientes pour lesquelles un génotypage plaquettaire fœtal pour HPA-1 est nécessaire, afin de valider la méthode. Pour cela une PCR-SSP et une PCR-HRM seront effectuées selon le protocole déjà développé. D autre part, il s agit de mettre au point un protocole pour le diagnostic prénatal des systèmes HPA-3 et HPA-5. En effet, le protocole pour HPA-1 ne peut être totalement applicable pour ces deux systèmes en raison d une région à amplifier riche en GC pour HPA-3 (formation de structure secondaire diminuant l accès aux amorces) et d un amplicon plus long pour HPA-5.

13 MATERIELS ET METHODES I) Matériels Les prélèvements recueillis au laboratoire proviennent de patients thrombopéniques, ou de familles sujettes aux thrombopénies fœtales et néonatales (un consentement pour l étude génétique est recueilli). Pour les femmes enceintes, pour lesquelles une thrombopénie néonatale avait été diagnostiquée pour un précédent enfant, le génotypage plaquettaire fœtal à partir du sang maternel (sérum/plasma) est effectué dès la ème semaine de grossesse Le sérum est préparé à partir de 5mL de sang, prélevé sur tube sec et centrifugé min à 2200g. Le plasma est, quant à lui, préparé à partir de 5mL de sang, prélevé sur tube EDTA (Ethylène Diamine Tétra-Acétate), centrifugé 4 min à 850g à 20 C. Le surnageant, correspondant au plasma riche en plaquettes (PRP), est récupéré puis centrifugé min à 2200g à 20 C. Le surnageant recueilli correspond alors au plasma. II) Méthodes 1) Extraction ADN L ADN circulant est extrait à partir de 1mL de sang maternel par le kit QIAmp Circulating Nucleic Acid (Qiagen), permettant l extraction d ADN circulant à partir de grands volumes (1 à 5mL) de plasma ou de sérum. La méthodologie, décrite dans le guide du kit, a été suivie sauf pour l élution qui a été réalisée dans 65µL d eau. 2) Quantification Il s agit de déterminer la concentration d ADN extrait à partir de sérum ou plasma par la technique précédente. Pour cela, la quantification d ADN est réalisée par le fluorimètre Qubit (Invitrogen) à l aide d un agent fluorescent et intercalant de l ADN, en suivant les recommandations du fournisseur. 3) PCR-SSP La PCR-SSP en temps réel est basée sur la détection d un signal fluorescent (SYBR Green) permettant de mesurer en continu la quantité d ADN synthétisée au cours de la phase exponentielle. Le Sybr Green ne fluoresce que lorsqu il est lié à l ADN double brin. La quantification de la fluorescence du Sybr Green est à associer à la courbe de fusion

14 correspondante afin de vérifier la spécificité des produits amplifiés. En effet, chaque amplicon spécifique a une température de fusion qui lui est propre. La PCR est effectuée à l aide du Rotor Gene 2QPlex HRM de Qiagen et repose sur l utilisation de deux couples d amorces. Chaque couple est composé d une amorce commune et d une amorce spécifique de l allèle à amplifier (table 2). Ainsi, deux amplifications sont réalisées pour chaque antigène plaquettaire HPA-Xa et HPA-Xb (figure 2). Nom de l amorce Séquence HPA-1a sens 5 -ACTTACAGGCCCTGCCTCT-3 HPA-1b sens 5 -ACTTACAGGCCCTGCCTCC-3 HPA-1 anti sens 5 -AGCCCTTGTCGCTGAGG-3 HPA-3a sens 5 -GGGGGAGGGGCTGGGGA-3 HPA-3b sens 5 -GGGGGAGGGGCTGGGGC-3 HPA-3 anti sens 5 -GGCCCTGGGACTGTGAAT-3 HPA-5a sens 5 -AGTCTACCTGTTTACTATCAAAG-3 HPA-5b sens 5 -AGTCTACCTGTTTACTATCAAAA-3 HPA-5 anti sens 5 -CTCTCATGGAAAATGGCAGTAC-3 Table 2 : Séquence des amorces utilisées en PCR-SSP pour l étude de HPA-1, -3 et -5. Homozygote HPA-Xaa Allèle a Hétérozygote HPA-Xab Allèle a Allèle b Homozygote HPA-Xbb Allèle b Polymorphisme HPA Amorce sens allèle a spécifique Amorce sens allèle b spécifique Amorce antisens commune Figure 2 : Principe de la PCR SSP appliquée au génotypage plaquettaire. Deux mix sont préparés pour l ensemble des échantillons, contenant l amorce commune et soit l amorce HPA-Xa soit l amorce HPA-Xb, et sans ADN. 15µL de ce mix sont distribués dans chaque tube puis µl de chaque échantillon d ADN, préalablement ajusté à 1ng/µL, sont ajoutés (table 3). Concentration initiale Concentration/quantité finale Real Master Mix Syber Rox (5 Prime) 2,5 X 1X MgCl2 25 mm 2 mm Primer c 20 µm 0.5 µm Primer 1a/1b 20 µm 0.5 µm ADN - ng Table 3 : Préparation du mix SSP pour la système HPA-1, pour un échantillon.

15 Un programme de deux heures est utilisé pour le système HPA-1 : 2min à 95 C, (30sec à 95 C, diminution de 0,4 C à chaque cycle de 68 à 58 C, 30sec à 68 C ) x 25 cycles, (30sec à 95 C, 30sec à 54 C, 30sec à 68 C) x 25 cycles, courbe de fusion entre 70 et 95 C avec un pas de 1 C/sec 4) PCR-HRM La PCR-HRM en temps réel est basée sur l intégration à de l ADN amplifié par PCR d un fluorochrome intercalant (Eva Green) permettant de mesurer en continu la quantité d ADN synthétisée au cours de la phase exponentielle. L Eva Green ne fluoresce que lorsqu il est lié à l ADN double brin et est plus saturant que le Sybr Green. La PCR est effectuée à l aide du Rotor Gene de Qiagen et repose sur l utilisation d un seul couple d amorce qui encadre la région d ADN correspondant au polymorphisme de HPA-X (table 4). Nom de l amorce Séquence HPA-1 sens 5 -CTCCTGTCTTACAGGCCC-3 HPA-1 anti sens 5 -CACAGCGAGGTGAGCC-3 HPA-3 sens 5 GCCTGACCACTCCTTTGC-3 HPA-3 anti sens 5 GTCTGCGATCCCGCTTGT-3 HPA-5 sens 5 -GAAGGAAGAGTCTACCTGTTTACTA-3 HPA-5 anti sens 5 -GCAAATTAAACTATTAGTTTATTTTTTTTTTTTTACCT-3 Table 4 : Séquence des amorces utilisées en PCR-HRM pour HPA-1, -3 et -5. Un mix commun pour tous les échantillons est préparé sans ADN. 15µL de ce mix sont distribués dans chaque tube puis µl de chaque échantillon d ADN à 1ng/µL sont ajoutés (table 5). HRM Master Mix (Qiagen) Concentration initiale 2X Concentration/quantité finale Primer µm 0,7 µm ADN - ng Table 5 : Préparation du mix HRM pour le système HPA-1, pour un échantillon. 1 X Un programme de trois heures est utilisé pour le système HPA-1: 5min à 95 C, (sec à 95 C, 30sec à 60 C) x 50 cycles, 30sec à 95 C, 30sec à 60 C, cycle de HRM : augmentation de la température de 70 à 90 C avec un pas de 0.05 C/sec, et une courbe de fusion entre ces mêmes températures est également réalisée (pas de 1 C/sec).

16 Norm. Fluoro. df/dt Norm. Fluoro. df/dt RESULTATS I) Validation de la méthode de DPN sur HPA-1 La validation de la méthode de DPN sur HPA-1 a pour but d évaluer sa reproductibilité, sa fiabilité et sa sensibilité. Afin d augmenter la cohorte de patientes pour lesquelles un génotypage plaquettaire HPA-1 fœtal est nécessaire, une PCR-SSP et une PCR-HRM sont effectuées selon un protocole déjà développé. Ces deux méthodes doivent être réalisées pour un DPN complet. 1) PCR-SSP La PCR-SSP est effectuée sur des échantillons contrôles HPA-1aa, 1bb, sur les échantillons de patientes et sur un contrôle négatif (l eau). Les courbes d amplification et de fusion sont obtenues pour chaque allèle «a» et «b». A -0,5-1,0-1,5-2,0 Threshold B ,5 2-3, Cycle ºC C -0,5 D 7-1,0-1,5-2,0 Threshold ,5 2-3, Cycle ºC Figure 3 : PCR-SSP sur les échantillons contrôles HPA-1aa (rouge), HPA-1bb (bleu), l échantillon patient (vert). A et B représentent respectivement les courbes d amplification et de fusion pour l allèle «a». C et D représentent respectivement les courbes d amplification et de fusion pour l allèle «b». 1 0 Une droite seuil est tracée à la moitié de la phase exponentielle de cette courbe correspondant à la moitié de la fluorescence finale. L intersection entre la droite et la courbe en phase exponentielle correspond au cycle seuil Ct (Threshold Cycle).

17 Tout d abord, le contrôle négatif doit être vérifié. Pour l allèle «a», l eau sort entre 33 et 37 cycles et pour l allèle «b», elle sort à 26 cycles, mais aucun pic spécifique pour ces deux allèles n est observé (non représenté). Des critères d analyse ont été définis au préalable. Les duplicats de chaque échantillon (contrôles et allèle correspondant au génotype de la mère) doivent sortir entre 23 et 31 cycles et avoir un écart de sortie de cycle de moins de 0,3. Les courbes de fusion obtenues, pour être spécifiques de l amplicon recherché, doivent posséder un pic à 90,5 ±0,5 C. Les échantillons testés correspondent bien à ces critères. Le contrôle HPA-1aa sort à 23 cycles pour l allèle «a» et l écart type de sortie de cycle est inférieur à 0,3 (figure 3A). Un pic à 90,5 C est observé sur la courbe de fusion, il s agit donc d une amplification spécifique de l allèle «a» (figure 3B). Pour l allèle «b», le contrôle 1aa sort à 32 cycles, l écart type est inférieur à 0,3 (figure 3C) mais aucun pic à 90,5 C n est observé. Il n y a donc pas d amplification spécifique de l allèle «b» (figure 3D). Le contrôle HPA-1bb sort à 25 cycles pour l allèle «b» et l écart type est inférieur à 0,3 (figure 3C). Sur la courbe de fusion, un pic à 90,5 C est observé, il s agit d une amplification spécifique de l allèle «b» (figure 3D). Pour l allèle «a», le contrôle 1bb sort à 27 cycles, l écart type de sortie de cycle est supérieure à 0,3 (figure 3A), mais sur la courbe de fusion, un pic de faible intensité à 90,5 C est observé (figure 3B). Il y a donc, étonnamment, une amplification spécifique de l allèle «a». Les deux contrôles doivent montrer que la PCR a bien marché et doivent montrer la spécificité des amorces : pour le contrôle aa, amplification de l allèle «a» et pas d amplification pour l allèle «b» ; pour le contrôle bb, amplification de l allèle «b» et pas d amplification pour l allèle «a». Or on retrouve une amplification de l allèle «a» dans le contrôle bb. Ceci est du probablement au fait que le prélèvement provenait d une femme qui venait d accoucher d un bébé incompatible. L ADN fœtal n a pas complètement disparu, et est en faible quantité, d où un écart type de sortie de cycle entre les duplicats supérieur à 0,3. Ceci met donc en avant la difficulté d avoir un «réel» contrôle. Pour l allèle «b» la patiente sort à 28 cycles et l écart type de sortie de cycle est inférieur à 0,3 (figure 3C). Sur la courbe de fusion, un pic à 90,5 C est observé, il y donc une amplification spécifique de l allèle «b» (figure 3D). Pour l allèle «a», la patiente sort à 28 cycles et l écart type de sortie de cycle est supérieur à 0,3 (figure 3A). Les duplicats ne sont pas bons mais sur la courbe de fusion, un pic à 90,5 C est observé pour un des duplicats (figure 3B). L écart type de sortie de cycle peut être supérieur à 0,3, même si ce n est pas l idéal, car il s agit d évènements rares. Pour pallier cet effet, la PCR peut être recommencée

18 Normalised Fluorescence Normalised minus BB Normalised Fluorescence Normalised minus BBS avec une quantité d ADN plus importante. Il y aurait donc de l allèle «a» provenant du fœtus puisque la mère est connue pour être de génotype 1bb. La patiente est de génotype 1bb, comme le confirment les résultats mais il existe de l allèle «a» en petite quantité dans l échantillon. Il semble donc y avoir une incompatibilité entre la mère et le fœtus. Des résultats similaires ont été obtenus pour sept autres patientes. Les résultats sont à confronter avec ceux de PCR-HRM pour pouvoir conclure à une incompatibilité ou non. 2) PCR-HRM La PCR-HRM est effectuée sur les échantillons de plasmas ou de sérums de patientes, avec les contrôles HPA-1aa et 1bb appropriés extraits à partir de plasma ou de sérum en fonction de la nature des échantillons patients à analyser. Les courbes HRM normalisée et différentielle par rapport au contrôle HPA-1bb sont obtenues, car les patientes étudiées sont de génotype 1bb. Si la mère est de génotype 1aa, la courbe HRM différentielle se fait par rapport au contrôle 1aa. A 0 B C deg. D deg deg deg. Figure 4 : PCR-HRM sur les échantillons contrôles HPA-1aa (rouge), HPA-1bb (bleu), l échantillon plasma patient (vert) et l échantillon sérum patient (turquoise). A et B correspondent respectivement à la courbe HRM normalisée et à la courbe HRM différentielle par rapport au contrôle HPA-1bb, pour les échantillons de sérum. C et D correspondent respectivement à la courbe HRM normalisée et à la courbe HRM différentielle par rapport au contrôle HPA-1bb, pour les échantillons de plasma.

19 Des critères d analyse ont été préalablement définis. Les duplicats de chaque échantillon doivent sortir avant 30 cycles, et la différence de sortie de cycle entre les contrôles et les patients doit être inférieure à 3. Les courbes de fusion obtenues, pour que l amplicon soit spécifique, doivent posséder un pic entre 81 et 82,5 C. Les échantillons de sérum sortent avant 30 cycles et la différence de sortie de cycle entre les contrôles et l échantillon patient est inférieure à 3. Sur les courbes de fusion, un pic à 81 C est observé pour le contrôle 1aa et à 81,7 C pour le contrôle 1bb et la patiente. Dans un tableau de résultat, le logiciel détermine le génotype des échantillons en fonction des contrôles prédéterminés et calcule un pourcentage de confiance à accorder à ce génotypage. Un seuil de confiance a été établit à 95%. En dessous de ce seuil, l échantillon est noté «variation», il est alors ni 1aa ni 1bb homozygote, mais il existe un «contaminant». Il est possible de voir sur le graphique si l échantillon est plus proche du contrôle 1aa ou 1bb et donc de déterminer la nature du contaminant, 1b ou 1a sachant le génotype des parents. L échantillon sérum patient est noté HPA-1bb avec un pourcentage de confiance supérieur à 95%. Il possède le même profil que le contrôle 1bb et ces résultats sont également observés sur les graphiques normalisés et différentiels (figures 4A et 4B). La mère étant de génotype 1bb, il semble exister une compatibilité entre la mère et son fœtus. Les échantillons de plasma, quant à eux, sortent bien avant 30 cycles et la différence de sortie de cycle entre les contrôles et l échantillon patient est inférieure à 3. Sur les courbes de fusion, un pic à 81 C est observé pour le contrôle 1aa et à 81,7 C pour le contrôle 1bb et la patiente. Dans le tableau de résultats, l échantillon plasma patient est noté «variation» avec un seuil de confiance définit à 95%. En effet, son profil est différent de celui des contrôles et ces résultats sont également observés sur les graphiques normalisés et différentiels (figure 4C et 4D). La courbe du patient coupe la courbe du contrôle 1bb. La mère étant de génotype 1bb, il existe donc un allèle a dans l échantillon. Il semble donc qu il y ait une incompatibilité entre la mère et son fœtus. Des résultats similaires ont été obtenus pour les sept autres patientes. 3) Résultats des DPN Pour toutes les patientes testées, les résultats des PCR-SSP et HRM sont concordants entre eux et avec les résultats attendus, permettant de conclure une incompatibilité avec leur fœtus dans le système plaquettaire HPA-1 sauf pour la patiente qui présente une compatibilité.

20 Norm. Fluoro. df/dt Norm. Fluoro. df/dt II) Mise au point du DPN sur HPA-3 1) PCR-SSP Pour la mise au point de la PCR-SSP pour le système HPA-3, l utilisation des amorces : sens HPA-3a (5 ACTGGGGGCTGCCCAT-3 ), sens HPA-3b (5 ACTGGGGGCTGCCCAG-3 ) et antisens (5 GTCTGCGATCCCGCTTGT-3 ) n a pas permis d obtenir des résultats satisfaisants. L ajout d additifs tels que du MgCl2, du glycérol, du formamide et du DMSO, seuls ou combinés, et à des doses croissantes, a été testé sans aucun succès. Une concentration en amorces de 1µM a donné les meilleurs résultats. Nous avons également testé plusieurs conditions dans le programme de PCR en faisant varier la température d hybridation, le nombre de cycles ou le temps de dénaturation. Pour finir, un mix contenant les amorces (décrites dans la table 2) à 1µM et sans additifs, une quantité d ADN de ng, un volume final de réaction de 25µL et le programme de PCR suivant : 2min à 95 C, (15sec à 95 C, diminution de 0,4 C/cycle de 68 à 66 C, 30sec à 72 C) x 5 cycles, (15sec à 95 C, 30sec à 61 C, 30sec à 72 C) x 30 cycles, courbe de fusion entre 70 et 95 C avec un pas de 1 C/sec, ont permis l obtention d une amplification spécifique de l allèle «a» pour les échantillons de génotype aa et ab. Les différentes conditions testées n ont pas permis l amplification spécifique de l allèle «b». Les courbes d amplification et de fusion sont obtenues pour chaque allèle «a» et «b». A -1,0-1,5-2,0 Threshold B 2,25 2,00 1,75 1,50 1,25-2,5 1,00 0,75 C -3,0-1, Cycle D 0,50 0,25 3,5 3, ºC -1,5 2,5-2,0 Threshold 2,0 1,5-2,5 1,0-3, Cycle ºC Figure 5 : PCR-SSP sur les échantillons contrôles HPA-3aa (rouge), 3bb (bleu), 3ab (violet). A et B représentent les courbes d amplification et de fusion de l allèle «a», C et D les courbes d amplification et de fusion de l allèle «b». 0,5

21 Tout d abord, le contrôle négatif doit être vérifié. Pour l allèle «a», l eau ne sort pas et pour l allèle «b», elle sort à 30 cycles mais aucun pic spécifique pour les deux allèles n est observé. Il ne s agit donc pas d une amplificaction spécifique (non représenté). Pour la mise au point, les tests ont été effectués en simplicat pour économiser le volume des échantillons du fait du manque de prélèvement. Ainsi, l écart type de sortie de cycle ne peut être calculé. Les critères d analyse sont les mêmes que ceux définis pour HPA-1. Le contrôle HPA-3aa sort à 24 cycles pour l allèle «a» (figure 5A). Un pic à 91 C est observé sur la courbe de fusion, il s agit donc d une amplification spécifique de l allèle «a» (figure 5B). Pour l allèle «b», le contrôle 3aa sort avant 30 cycles (figure 5C) mais aucun pic à 90 C n est observé. Il n y a donc pas d amplification spécifique de l allèle «b» (figure 5D). Le contrôle HPA-3bb sort avant 30 cycles pour l allèle «b» (figure 5C). Sur la courbe de fusion, un pic à 90 C est observé, il s agit d une amplification spécifique de l allèle «b» (figure 5D). Pour l allèle «a», le contrôle 3bb sort à 35 cycles (figure 5A) mais sur la courbe de fusion, aucun pic à 91 C n est observé (figure 5B). Il n y a donc pas d amplification spécifique de l allèle «a». Le contrôle HPA-3ab sort à 30 cycles pour l allèle «a» (figure 5A). Sur la courbe de fusion, un pic à 91 C est observé (figure 5B). Il y a donc une amplification spécifique de l allèle «a». Pour l allèle «b», le contrôle 3ab sort avant 30 cycles (figure 5C). Sur la courbe de fusion, un pic à 90 C est observé mais il est de très faible intensité (figure 5D). Il est donc difficile de conclure sur l allèle «b» pour ce contrôle. Pour l allèle «a», les contrôles aa, bb et ab montrent que la PCR a bien marché et montrent la spécificité des amorces : pour les contrôle aa et ab, amplification de l allèle a, pour le contrôle bb, pas d amplification. Cependant, les résultats pour l amorce «b» ne sont pas encore au point étant donné que le pic du contrôle ab n est pas assez franc. 2) PCR-HRM Pour la PCR-HRM, une PCR en gradient de température a permis de déterminer la meilleure température d hybridation. Nous avons testés les amorces décrites dans l article de Liew et al 22 et de nouvelles amorces (table 4), à des concentrations différentes et avec ajout d additifs tels que du MgCl2, du glycérol ou du formamide. Les meilleurs résultats ont été trouvés en utilisant un mix de PCR avec les nouvelles amorces à 1µM et sans additifs, et le programme suivant : 5min à 95 C, 20sec à 95 C et 30sec à 61 C pendant 60 cycles, suivi d un cycle de HRM (augmentation de la température de 80 à 95 C avec un pas de 0.05 C/sec).

22 Normalised Fluorescence Normalised minus AAPL Normalised Fluorescence Normalised minus BBS La PCR-HRM est effectuée sur les échantillons de plasmas ou de sérums de patientes, avec les contrôles HPA-3aa et 3bb appropriés extraits à partir de plasma ou de sérum en fonction de la nature des échantillons patients à analyser. Les courbes HRM normalisées et différentielles par rapport au contrôle HPA-3bb (pour les mères HPA-3bb) et au contrôle HPA-3aa (pour les mères HPA-3aa) sont obtenues. 0 A 80 B deg deg. 0 C 80 D deg deg. Figure 6 : PCR-HRM sur les échantillons contrôles HPA-3aa (rouge), HPA-3bb (bleu), l échantillon sérum patient (marron) et l échantillon plasma patient (vert). A et B correspondent respectivement à la courbe HRM normalisée et à la courbe HRM différentielle par rapport au contrôle HPA-3bb, pour les échantillons de sérum. C et D correspondent respectivement à la courbe HRM normalisée et à la courbe HRM différentielle par rapport au contrôle HPA-3bb, pour les échantillons de plasma. -5 Les échantillons de sérum sortent entre 34 et 37 cycles et la différence de sortie de cycle entre les contrôles et l échantillon patient est inférieure à 3. Sur les courbes de fusion, un pic entre 88 et 89 C est observé en fonction des échantillons. Dans le tableau de résultat, l échantillon sérum patient est noté «variation». En effet, il ne possède pas le même profil que les contrôles et la courbe coupe celle du contrôle 3bb. Ces résultats sont également observés sur les graphiques normalisés et différentiels (figure 6A et 6B). La mère étant de génotype 3bb, il semble exister une incompatibilité entre la mère et son fœtus. Les échantillons de plasma, quant à eux, sortent entre 33 et 36 cycles et la différence de sortie de cycle entre les contrôles et l échantillon patient est inférieure à 3. Sur les courbes de fusion, un pic entre 88 et 89 C est observé en fonction des échantillons. Comme pour HPA-1, il existe un tableau de résultats avec un seuil de confiance définit à 95%. L échantillon plasma patient est noté HPA-3aa pour un des duplicats avec un pourcentage de confiance supérieur à 95%. En effet, il possède le même profil que le contrôle 3aa et ces résultats sont également observés sur les graphiques normalisés et différentiels (figure 6C et 6D).

23 Cependant, il existe un écart entre les duplicats ( Ct = 0.44), en effet l autre duplicat indique une incompatibilité. La mère est de génotype 3aa mais il est impossible de conclure à une incompatibilité ou non, la PCR devrait être refaite. La PCR-HRM a également été réalisée sur quatre autres patientes pour lesquelles l incompatibilité ou la compatibilité étaient connues. Des profils communs aux patientes compatibles d une part, et aux patientes incompatibles avec leur fœtus d autre part, ont été trouvés. III) Mise au point du DPN sur HPA-5 La PCR-HRM ayant déjà été mise au point auparavant, seule la PCR-SSP a été faite dans ce projet. Comme pour le système HPA-3, nous avons testés des concentrations croissantes d amorces et d additifs tels que le MgCl2, le glycérol, le formamide ou le DMSO. Plusieurs programmes ont été testés : 2min à 95 C, (30sec à 95 C, 30sec à 61 C, 30sec à 72 C) x 50 cycles, courbe de fusion entre 60 et 95 C avec un pas de 1 C/sec ; ou 2min à 95 C, (30sec à 95 C, Diminution de 0,4 C/cycle de 68 à 58 C, 30sec à 68 C) x 25 cycles, (30sec à 95 C, 30sec à 54 C, 30sec à 68 C) x 25 cycles, courbe de fusion entre 70 et 95 C avec un pas de 1 C/sec. Pour chaque programme, différentes températures d hybridation ont été testées. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec un mix contenant les amorces (table 2) à 0,5µM et du MgCl2 à 3,5mM et avec le programme suivant : 2min à 95 C, (30sec à 95 C, diminution de 0,4 C/cycle de 68 à 58 C, 30sec à 68 C) x 25 cycles, (30sec à 95 C, 30sec à 54 C, 30sec à 68 C) x 25 cycles, courbe de fusion entre 70 et 95 C avec un pas de 1 C/sec. La PCR est effectuée sur des échantillons contrôles HPA-5aa, bb et ab en utilisant une quantité d ADN de ng. Le volume final de réaction est de 30µL. Les courbes d amplification et de fusion sont obtenues pour chaque allèle «a» et «b» (figure 7). Tout d abord, le contrôle négatif doit être vérifié et ne pas présenté d amplification spécifique. Pour l allèle a, l eau sort à 39 cycles et pour l allèle «b», elle sort à 41 cycles, mais aucun pic spécifique sur la courbe de fusion n est observé pour les deux allèles. Le contrôle HPA-5aa sort à 31 cycles pour l allèle «a» et l écart type de sortie de cycle est inférieur à 0,3 (figure 7A). Un pic à 79 C est observé sur la courbe de fusion, il s agit donc d une amplification spécifique de l allèle «a» (figure 7B). Pour l allèle «b», le contrôle 1aa sort à 41 cycles, l écart type est inférieur à 0,3 (figure 7C) mais le pic observé est inférieur à 79 C. Il n y a donc pas d amplification spécifique de l allèle «b» (figure 7D).

24 Norm. Fluoro. df/dt Norm. Fluoro. df/dt Le contrôle HPA-5bb sort à 35 cycles pour l allèle «b» et l écart type est de 0.66 (figure 7C). Les duplicats ne sont pas bons, cependant sur la courbe de fusion, un pic à 79 C est observé. Il s agit donc d une amplification spécifique de l allèle «b» (figure 7D). Les duplicats donnant les mêmes résultats, et du fait du faible volume du contrôle, la PCR n a pas été refaite. Pour l allèle «a», le contrôle 1bb sort à 41 cycles et l écart type de sortie de cycle est inférieur à 0,3 (figure 7A), mais aucun pic à 79 C n est observé sur la courbe de fusion (figure 7B, pic à 75 C). L amplification n est donc pas spécifique. Le contrôle HPA-5ab sort à 33 cycles pour l allèle «a» et à 35cycles pour l allèle «b» avec un écart type de sortie de cycle inférieur à 0,3 (figure 7A et 7C). Sur les courbes de fusion, un pic à 79 C est observé pour les deux allèles (figure 7B et 7D). Il y a donc une amplification spécifique de l allèle «a» et de l allèle «b». -0,5 A -1,0 B 3,5 3,0-1,5 2,5 2,0-2,0 Threshold 1,5-2,5 1,0-3, Cycle 0,5 0, ºC -0,5 C -1,0 D 3,5 3,0-1,5 2,5 2,0-2,0 Threshold 1,5-2,5 1,0-3, Cycle ºC Figure 7 : PCR-SSP sur les échantillons contrôles HPA-5aa (rouge), 5bb (bleu), 5ab (violet) et l eau. A et B représentent les courbes d amplification et de fusion de l allèle a, C et D les courbes d amplification et de fusion de l allèle b. 0,5 0,0 Les trois contrôles montrent que la PCR a bien marché et montrent la spécificité des amorces : pour le contrôle aa, amplification de l allèle «a» et pas d amplification pour l allèle «b» ; pour le contrôle bb, amplification de l allèle «b» et pas d amplification pour l allèle «a» ; pour le contrôle ab, amplification des deux allèles.

25 DISCUSSION Les thrombopénies fœtales ou néonatales alloimmunes sont les plus fréquentes des thrombopénies isolées sévères du fœtus et du nouveau-né. Au cours des grossesses successives, l atteinte fœtale est de plus en plus sévère. Le diagnostic biologique doit pouvoir bénéficier des techniques les plus sensibles, fiables et reproductibles afin de mettre en place un traitement adapté pour l enfant atteint, et proposer une prise en charge adaptée des grossesses ultérieures. Le DPN des thrombopénies fœtales est réalisé à l heure actuelle à partir d amniocentèse. Ce geste invasif peut être à l origine de fausses couches spontanées. Le DPN non invasif est donc un enjeu majeur du laboratoire d immunologie plaquettaire. Une méthode de génotypage sur l ADN fœtal présent dans le sang maternel a déjà été développée pour HPA-1 en combinant deux techniques : la PCR-SSP et la PCR-HRM afin de permettre un diagnostic non invasif plus sûr et à un terme précoce de la grossesse (dès 15 semaines d aménorrhée). La technique par les sondes Taqman, étant plus coûteuse et ayant donné des résultats non spécifiques pour l allèle «a» recherché, n a pas été retenue. Afin de valider la méthode et sa reproductibilité, le DPN doit être réalisé sur un certain nombre de patientes (entre 30 et 0). Pour l instant, ce nombre est de 49 mais nous souhaitons l augmenter. Pour cela, nous avons réalisé les deux techniques de PCR sur neuf patientes HPA-1bb présentant une incompatibilité ou une compatibilité connue avec leur fœtus. Pour les neuf, l incompatibilité ou compatibilité a pu être observée dans les deux techniques, augmentant ainsi la cohorte à 58 patientes. En 2011, Scheffer et al. avaient développé une méthode de génotypage fœtal HPA-1a non invasive par PCR en temps réel. Les résultats faussement négatifs causés par l amplification non spécifique de l ADN maternel avaient été exclus par digestion enzymatique de l ADN grâce à Msp1. Cette digestion permettait de détruire l allèle «b», la majorité des mères étant HPA-1bb, et de n amplifier que l allèle «a» s il était présent chez le fœtus 23. La méthode que nous utilisons, grâce à deux techniques fiables, est moins sujette aux amplifications non spécifiques et aux digestions incomplètes qui pourraient se produire avec l utilisation d enzymes de restriction. De plus, la technique est applicable aussi bien aux immunisations HPA-1a que HPA-1b. Deux autres systèmes sont régulièrement impliqués dans les thrombopénies fœtales et néonatales : HPA-3 et HPA-5. Cependant il n existe pas, à ce jour, de DPN non invasif pour ces systèmes. Le protocole pour HPA-1 ne peut être applicable directement pour ces deux systèmes en raison d une région à amplifier riche en GC pour HPA-3 (formation de structure secondaire diminuant l accès aux amorces) et d un amplicon plus long pour HPA-5. Il est

26 donc nécessaire d adapter le protocole pour ces systèmes. Le DPN pour HPA-3 en PCR-SSP a pu être mis au point pour l allèle «a» mais les différentes conditions utilisées n ont pas permis l amplification spécifique de l allèle «b». La recherche de l allèle «a», présent sur l ADN fœtal, permettrait de diagnostiquer une incompatibilité entre la mère et son fœtus pour la majorité des cas d incompatibilité dans ce système étant donné que la majorité des femmes impliquées dans une immunisation HPA-3 sont de génotype «bb». La PCR-HRM a été réalisée sur six patientes pour lesquelles l incompatibilité ou la compatibilité étaient connues. Des profils communs aux patientes compatibles d une part, et aux patientes incompatibles avec leur fœtus d autre part, ont été trouvés. Il serait cependant nécessaire d effectuer cette technique sur d autres échantillons dont l incompatibilité est connue afin d augmenter la cohorte et de vérifier ces profils. Pour HPA-5, la PCR-HRM a déjà été mise au point. Nous nous sommes donc concentrés sur la PCR-SSP. Cette technique a donné de bons résultats avec une bonne spécificité des amorces pour chaque allèle et un pic à 79 C retrouvé sur les courbes de fusion pour chaque amplification spécifique. En revanche, de manière surprenante, les résultats obtenus avec un volume final de réaction de 30µL ne sont pas retrouvés dans 25µL, alors que la quantité d ADN et la concentration des différents réactifs du mix sont restées les mêmes. Il serait donc préférable d effectuer une nouvelle PCR afin de recontrôler cette information. De plus, il est intéressant de noter que le programme utilisé pour le système HPA-5 est le même que pour le système HPA-1. Ainsi, le génotypage de ces deux systèmes pourra se faire en même temps : dans des tubes séparés, puisque la composition du mix est différente, mais lors du même programme de PCR. Ce regroupement permettra de gagner du temps sur le rendu des résultats et permettre une prise en charge encore plus rapide des incompatibilités. La suite de ce projet consiste à valider la méthode de DPN pour les systèmes HPA-3 et -5 en effectuant ces techniques sur une centaine de patientes afin d évaluer la reproductibilité de la méthode. Le seul problème est le manque de prélèvements arrivant au laboratoire pour la recherche d incompatibilité dans ces systèmes. Cependant, la mise au point de ces techniques s ajoute à celles de HPA-1 et à la PCR-HRM déjà effectuée pour HPA-5 et constitue ainsi les méthodes de génotypage plaquettaire non invasif des trois systèmes pour lesquels les immunisations sont les plus fréquentes chez les caucasiens. A terme, il ne sera plus nécessaire d effectuer d amniocentèse pour le diagnostic prénatal de la thrombopénie fœtale ou néonatale allo-immune, un simple prélèvement de sang maternel suffira au diagnostic. De tels progrès seront un atout considérable pour la prise en charge thérapeutique dans le domaine de la périnatalité, élément essentiel de la santé publique.

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