ELECTROPHYSIOLOGIE PRINCIPES ET TECHNIQUES

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1 ELECTROPHYSIOLOGIE PRINCIPES ET TECHNIQUES TRANSPORTS MEMBRANAIRES ELECTROGENIQUE Fabrice DUPRAT Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire Université de Nice Sophia-Antipolis Décembre

2 Objectifs de ce cours Comprendre le fonctionnement des canaux ioniques. Comprendre les données présentées dans un article scientifique. Lecture des représentations classiques (courbes courant/potentiel, inactivation,...) Signification des paramètres mesurés en électrophysiologie (conductance, seuil d activation, probabilité d ouverture, ctes de temps...) 2

3 Déroulement du cours Durée du cours 5 h sur les principes et techniques de l'electrophysiologie. 3 h sur les bases de neurosciences et la plasticité synaptique. Evaluation (examen final du C4): Etude d un ou plusieurs cas concrets (articles de littérature scientifique en Anglais). Questions de cours sur les principales notions. Prévoir un dictionnaire Anglais/Français et une calculatrice. 3

4 Plan du cours LES PHENOMENES ELECTRIQUES EN BIOLOGIE ETUDE DES PHENOMENES ELECTRIQUES D ORIGINE BIOLOGIQUE TRANSPORTS MEMBRANAIRES LES CANAUX IONIQUES NOTIONS DE BIOPHYSIQUE TECHNIQUES D ETUDE: LE POTENTIEL IMPOSE GATING DES CANAUX IONIQUES LE PATCH CLAMP TECHNIQUE D ETUDE: LE COURANT IMPOSE CANAUX ENDOGENES ET EXOGENES POINTS DE REPERES 4

5 LES PHENOMENES ELECTRIQUES EN BIOLOGIE 5

6 Les phénomènes électriques en biologie L'anguille électrique La torpille 6

7 ETUDE DES PHENOMENES ELECTRIQUES D ORIGINE BIOLOGIQUE 7

8 Animal entier: EEG E.E.G.: Electroencephalogramme Electrodes externes Electrodes implantées 8

9 Animal entier: ECG E.C.G.: Electrocardiogramme Electrodes externes 9

10 Organe entier: coeur Cœur entier Cœur isolé perfusé de souris R 200 ms P Q S T Electrodes Drici et al Circulation

11 Organe entier: cerveau Microélectrodes 11

12 Tissus: tranche de cerveau Electrodes 12

13 Tissus: nerf isolé 13

14 Cellules: Neurones en culture Microélectrode Pipette de patch clamp 14

15 Protéine canal KcsA Zhou et al. 15

16 TRANSPORTS MEMBRANAIRES 16

17 Assymétrie de la membrane plasmique Bicouche lipidique Protéines membranaires Interne Externe Concentrations ioniques dans les cellules de vertébrés Na K Ca Cl

18 Protéines de la membrane plasmique x

19 Notions générales sur les transports membranaires A C C Gradient de [A] Transports passifs Diffusion facilitée ATP Qté transportée Gradient de [C] Transports actifs secondaires Transports actifs avec consommation d ATP Gradient de [ ] 19

20 A B Symports A B Transports membranaires A C A Antiports A B B Electroneutre Electrogène Electrogène Electroneutre Electroneutre A Uniports C Gradients de A et B Electrogène ATP Electroneutre Gradient de C 20

21 Synapse électrique, jonctions Gap 21

22 Synapse électrique, jonctions Gap 30 µm 30 µm 100 µm 22

23 Conclusion sur les transports membranaires Transports électrogèniques Possibilité de mesures électrophysiologiques Cas des canaux ioniques 23

24 LES CANAUX IONIQUES 24

25 Les canaux clonés ou exogènes Structure protéique connue Nombre de segments transmembranaires Homologies de séquence Sites consensus Réalisation d anticorps, d antisens, de sonde d hybridation,... 25

26 Superfamilles des canaux clonés Canaux Cl - Récepteurs canaux Canaux Na P P P P Canaux Ca 2 P P P P sous unités α, β, δ, γ 26

27 Sous unités auxiliaires: Kvβ2 Van Huizen et al. 1999, FEBS Lett. 457,

28 Structure et assemblage des Kv Kv x4= P 6 28

29 Structure et assemblage des Kir P 29

30 Structure et assemblage d autres canaux 30

31 Structure du récepteur-canal nicotinique 31

32 Passage des ions K Miller et al. 32

33 Filtre de sélectivité Zhou et al

34 Deshydratation des ions K Zhou et al

35 Passage des ions K Zhou et al

36 Classification des canaux ioniques Nature du/des principaux ions transportés Na Cl - Ca K Face externe Face interne m 36

37 Régulation des canaux ioniques Régulation par un agoniste (ROC) AMPA GABA Face externe Régulation par le potentiel (VOC) --- Face interne Régulation par un ligand intracellulaire (SMOC) Ca AMPc 37

38 Biophysique des canaux ioniques Propriétés biophysiques: Canaux à rectification entrante Canaux à rectification sortante Canaux voltage dépendant Canaux avec une inactivation. 38

39 Pharmacologie des canaux ioniques Classification selon la sensibilité Exemple: Canaux apamine sensible (K Ca ) 39

40 Pathophysiologie des canaux ioniques Canaux potassiques Diabète, Ataxie épisodique de type 1 Syndrome du long QT Syndrome de Bartter Canaux sodiques La paramyotonie congénitale, la paralysie périodique familiale hyperkaliémique Syndrome du long QT Syndrome de Liddle Pseudohypoaldostéronisme de type 1 Canaux calciques La paralysie périodique familiale hypokaliémique L'hyperthermie maligne Syndrome de Lambert-Eaton, sclérose latérale amyotrophique, diabète de type I Canaux chlore La mucoviscidose La myotonie congénitale et la myopathie pseudohypertrophique de Becker. 40

41 Pharmacologie clinique des canaux ioniques Canaux sodiques Anti-arythmiques de la classe IA (quinidine, lidocaïne, encaïnide) Anti-arythmiques de la classe IB (lidocaïne) Anti-arythmiques de la classe IC (encaïnide) Pyréthrinoïdes (bioperméthrine) Diurétiques (amiloride). Canaux potassiques Anti-arythmiques de la classe III (amiodarone) Sulphonylurées (glibenclamide) Ouvreurs K ATP (nicorandil). Canaux calciques Anti-arythmiques de la classe IV (vérapamil). 41

42 NOTIONS DE BIOPHYSIQUE 42

43 Analogie électricité /eau / ion PHENOMENE ELECTRIQUE ANALOGIE AVEC L EAU PHENOMENE IONIQUE Courant électrique: i ou I Qté de charges (e - ) circulant par unité de temps. Porteurs de charges: électrons Produit par un générateur de courant: Sens positif = celui des charges positives Courant d un fleuve Débit d eau entre 2 points Pompe péristaltique Courant ionique: i ou I Quantité de charges (et non d ions) par unité de temps = flux global entre 2 points Porteurs de charges: ions Ampères: 10-6 A=1µA, 10-9 A=1nA, A=1pA Résistance: R Obstacle au passage des électrons Barrage sur un fleuve Les vannes sont ± ouvertes Résistance d un canal: Résistance R ou r en ohm: Ω (10 9 Ω =1MΩ) Conductance : g= 1/R Conductance d un canal: r = 1/g Conductance g ou γ en siemens: S = 1 ps = capacité à laisser passer des ions 43

44 Analogie électricité /eau / ion PHENOMENE ELECTRIQUE ANALOGIE AVEC L EAU PHENOMENE IONIQUE Potentiel électrique: E (U, V) Quantité de charges en un point Quantité d eau en un point Différence de potentiel ou tension: U, V (E) Différence en quantité de charges entre 2 points Produit par un générateur de tension Différence niveau d eau Différence de potentiel Différence de quantité de charges Volts: mv: 10-3 V 44

45 Analogie électricité /eau / ion PHENOMENE ELECTRIQUE ANALOGIE AVEC L EAU PHENOMENE IONIQUE Capacité: C composé d un isolant entouré de 2 surfaces de conducteur = capacité d accumuler des charges réservoirs Capacité membranaire =la membrane plasmique est un isolant entouré de 2 conducteurs Capacité spécifique (µf/cm 2 ) - Loi d ohm: U = RI Si U = constante: si R alors I Si I=constante: si R alors U Barrage: si le courant alors la différence de niveau 45

46 Potentiel d équilibre - Loi de Nernst Potentiels d inversion dans les cellules de vertébrés Interne Externe E ion = 58 log [ion] ext / [ion] int Na mv K mv Ca mv Cl mv Voltmètre 0 mv K Cl - Cl - K Cl - Na Cl - K Cl - Na Cl - K Cl - Na Cl - K Cl - Na Cl - K Cl - Na Cl - Gradient de [K ] Gradient de [Na ] Gradient de charges Inclusion d un canal K Inclusion d un canal Na Gradient de [K ] Gradient de [Na ] Gradient de charges Gradient de [K ] Gradient de [Na ] Gradient de charges - K Cl - Na Cl - K Cl - Na Cl - Cl - Na Cl - K Cl - Na Cl - K Cl - Na Cl - K K Cl - Na Cl - - Na K Cl - Cl - K Cl - Na Cl - K Cl - Cl - Na K Cl - Na Cl - K Cl- Na Cl - K Cl - Na Cl mv Polarisée 60 mv Dépolarisée 46

47 Enoncé de la loi de Nernst E ion = RT zf [ ion] ln [ ion ext ] int Potentiel d équilibre d un ion E ion R: constante des gaz parfaits: 8,315 J.K -1.mole -1 (1 J = 1 V.C) T: température absolue en K ( K = C 273,16) z: valence de l ion (1 pour Na et K, 2 pour Ca 2 et -1 pour Cl - ) F: constante de Faraday: 9, C.mole -1 Valeurs de RT/F selon la température: Ln = 2,303 Log Si z = 1 et à 20 C on a: E ion = [ ion] 58log [ ion ext ] int Température ( C) RT/F (mv) 0 23, , , , , , , , ,73 47

48 TECHNIQUES D ETUDE LE POTENTIEL IMPOSE 48

49 Aspect technique du potentiel imposé Double microélectrodes E I // E = I = 1/g Rg1 x / gi Imposé Calculé Mesuré E imposé E mb I injecté 49

50 Le modèle de l ovocyte de xénope Ovocytes de xénopes Injection d ARN ou d ADN Etude des canaux clonés ou exogènes Double microélectrodes 50

51 Préparation des ovocytes de xénopes 51

52 Ovocytes: Injection d ARN ou d ADN 52

53 Le poste d enregistrement en double microélectrodes 53

54 Préparation des pipettes 54

55 Etude des courants natifs ou endogènes Preparation d un tissu 55

56 [ K ] Potentiel imposé par l expérimentateur [ ] Externe Gradient de charges imposé [K ] Gradient de [K ] Interne Flux net de K sortant [ - ] Flux net de K sortant Flux net de K nul Flux net de K entrant = état d équilibre (Nernst) 56

57 Potentiel imposé E = R x I Imposé Calculé Mesuré Courant (µa, na, pa) 5 Potentiel imposé E K =-70 mv Externe Potentiel (mv) Interne Gradient [K ] 57

58 Représentation schématique d un canal Externe Externe ---- Externe g Na = 0 g K = 0 g Na = 0 g K > 0 g Na > 0 g K = 0 I Na = 0 I K = 0 I Na = 0 I K > 0 I Na > 0 I K = 0 Interne V m = 0 mv Interne ---- V m = E K = - 84 mv Interne V m = E Na = 58 mv 58

59 Loi de Goldman Hodgkin Katz [K ] int = [K ] ext [K ] int > [K ] ext Flux sortant E K Total Flux sortant E K Total Flux entrant Flux entrant 59

60 Courants totaux Technique d étude: le voltage clamp 60

61 Technique d étude: le voltage clamp Courants totaux 61

62 GATING DES CANAUX IONIQUES 62

63 Structure et gating des canaux clonés Biggin & Sansom

64 Canaux voltage-dépendant [K ] int > [K ] ext [K ] int = [K ] ext E K E K Seuil d activation Seuil d activation 64

65 Interactions senseur au voltage et pore (Kcsa) Fermé (rétracté) Ouvert (extrudé) Activation Inactivation Inactivé (rétracté) Inactivé (extrudé) Gandhi et al

66 Gating des canaux ioniques Rectification entrante Diffusion facilitée V Blocage des courants sortants V I I 66

67 Rectification entrante Milieu externe K Membrane K Spermine Mg 2 Milieu interne 67

68 Canaux temps-dépendant Activation Inactivation 68

69 Patch Clamp Enregistrements de courants unitaires 69

70 LE PATCH CLAMP 70

71 Configurations du Patch Clamp 71

72 Poste de Patch clamp 72

73 Courant unitaire 73

74 Courant unitaire 74

75 Modèle F 1 k 2 k -2 F 2 k 1 k -1 O k i I 75

76 Histogramme d amplitude 76

77 Sommation des courants unitaires 77

78 Courant total i unitaire = γ ion. (V m -E ion ) I total = i unitaire. N. P o = g ion. (V m -E ion ) 78

79 Cas d une membrane comportant plusieurs conductances Schéma électrique Courants du nœud de Ranvier 79

80 TECHNIQUE D ETUDE LE COURANT IMPOSE 80

81 Current clamp Potentiel d action en current-clamp 81

82 CANAUX ENDOGENES ET EXOGENES 82

83 Etude des canaux natifs ou endogènes Dissociation mécanique et enzymatique Patch clamp 83

84 Cultures de cellules Etuce des canaux clonés ou exogènes Transfection, infection, injection Patch clamp 84

85 POINTS DE REPERES 85

86 Canaux ioniques des végétaux: Arabidopsis thaliana 86

87 Historique ans avant JC Les Egyptiens étudient les phénomènes liés à l anguille électrique GALVANI: Existence de phénomènes électriques au niveau de la matière vivante. 1827: Loi d OHM DU BOIS REYMOND: Propriétés électrogènique de la peau de grenouille BERNSTEIN: L intérieur et l extérieur des cellules sont composés d électrolytes de différentes concentrations séparées par une membrane perméable à ces électrolytes NERNST: Loi de Nernst donnant le potentiel d équilibre d un ion BERNSTEIN: Théorie de la membrane: - le potentiel de repos est du à la membrane, - notion de membrane électrique et de membrane biologique, - les concentrations ioniques sont différentes de part et d autres de la membrane - au repos la membrane n est perméable qu au potassium. 87

88 Historique EINTHOVEN: Naissance de l ECG (électrocardiogramme) : Naissance de l électrophysiologie, due aux améliorations techniques après la II nde guerre mondiale. 1935: Microélectrode intracellulaire HODGKIN: Des courants locaux peuvent dépolariser la membrane ROSENBERG-USSING: Différence entre les transports actifs et les transports passifs, au niveau des épithéliums LING-GERARD: Première microélectrode de verre HODGKIN-HUXLEY: Technique du voltage clamp 1952 CORABOEUF: Naissance de l électrophysiologie en France USSING: Etude des différentes perméabilités (K et Na ) sur les épithéliums, chambre de Ussing NEHER - SAKMANN: Technique de patch clamp NEHER - SAKMANN : Prix Nobel de Médecine. 88