Macro-Assemblages Protéiques et Maladies à Prion + Virologie et Immunologie Moléculaire

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1 Axe : NanoBioSciences Macro-Assemblages Protéiques et Maladies à Prion prion Virologie et Immunologie Moléculaire Virologie et Immunologie Moléculaires Bât. Biotechnologies Domaine de Vilvert Jouy en Josas Tél : Fax : Responsables d équipe : Dr Sabine Riffault Sabine.Riffault@jouy.inra.fr Dr Bernard Delmas Bernard.Delmas@jouy.inra.fr Membres permanents de l équipe : Vincent BERINGUE Vincent.Beringue@jouy.inra.fr Christophe CHEVALIER Christophe.Chevalier@jouy.inra.fr Sabrina CRONIER Sabrina.Cronier@jouy.inra.fr Bruno DA COSTA Bruno.Dacosta@jouy.inra.fr Bernard DELMAS Bernard.Delmas@jouy.inra.fr Michel DRON Michel.Dron@jouy.inra.fr Nathalie LEJAL Nathalie.Lejal@jouy.inra.fr Davy MARTIN Davy.Martin@jouy.inra.fr

2 Mohammed MOUDJOU Mohammed. Human REZAEI Charles-Adrian RICHARD Pierre SIBILLE Anny SLAMA-SCHWOK Joan TORRENT Jasmina VIDIC Activité scientifiques de l équipe : L Unité de Virologie et Immunologie Moléculaires (VIM-UR892) étudie des agents pathogènes d intérêt pour la santé animale. Nos activités de recherches vont de la caractérisation moléculaire des agents pathogènes qui affectent les animaux de rente, jusqu à l étude des mécanismes de défense mis en œuvre par l'hôte. Nous nous intéressons à des virus de mammifères, d oiseaux et de poissons d intérêt agronomique, aux bactéries des poissons et aux agents non conventionnels «prion» des encéphalopathies spongiformes transmissibles. L équipe de Macro-Assemblages Protéiques et Maladies à Prion (MAP2) travaille sur les prions de mammifères, agents infectieux non conventionnels constitués d une protéine mépliée qui s accumule notamment dans le cerveau et provoque des désordres neurodégénératifs d issue irrémédiablement fatale chez l homme et l animal. Les objectifs de recherches consistent à : (i) étudier la diversité conformationnelle de la protéine prion et à comprendre ses mécanismes d assemblage, (ii) déterminer le support biologique de la diversité et du potentiel évolutif des prions et comprendre les bases moléculaires de leur pathogénicité, en travaillant notamment sur la caractérisation physico-chimique, biochimique et particulaire de l agent infectieux, et (iii) étudier la biologie cellulaire et la neurotoxicité des prions. Les maladies à prions, Alzheimer ou Parkinson étant toutes dues au mauvais repliement d une protéine de l hôte, l équipe a aussi développé des approches comparées destinées à mieux comprendre les processus moléculaires et physiopathologiques impliqués dans ces pathologies neurodégénératives en développant des outils ex vivo et in vivo originaux. Recherche(s) et résultat(s) obtenu(s) dans les domaines d actions des nanosciences :

3 Etude de structure tridimensionnelle et la dynamique de la protéine prion. Structures de 12-mères (bleu) et 24-mères (rouge) oligomères de PrP calculées par la méthode ab initio à partir des intensités SAXS obtenus sur les oligomères purifiés. Rezaei, et al, JMolBiol, 2005,347, Les maladies à prion sont caractérisées par la présence dans le cerveau des sujets atteints d une isoforme pathologique (PrPSc) d une protéine naturelle de l hôte, la protéine prion cellulaire (PrPC). Contrairement à la PrPC qui dans sa forme monomérique cellulaire est une protéine riche en hélice α, la PrPSc sous sa forme pathogène agrégée est enrichie en feuillet β. Nous avons mis au point la production et purification de la protéine prion dans sa forme cellulaire, PrPC, et fibrillaire (PrPSc). La PrP, forme sous sa forme pathogène, forme des oligomères se taille divers. Plateau biophysique de l Unité nous permet d analyser la structure et la dynamique de ces objets de taille nanométrique. L enjeu de cet axe de recherche est de caractériser la structure de différentes formes de la protéine prion et de faire un lien entre leurs caractéristiques structurales et leurs infectiosités. La complexité du système (présence de plusieurs formes de nano-objets) ne permet pas de déterminer de manière univoque leur taille et forme nanométrique par les techniques de caractérisation indirectes usuelles (SAXS, SANS). Pour cela nous avons mis en place une approche consistant à la purification spécifique de ces nano-objets et ensuite leur caractérisation. Etude conformationelle de protéine PB1-F2 du virus de la grippe, sa détection dans les cellules infectées et ses interactions avec des membranes cellulaires Mesure de la taille des nano-objets formés par PB1F2par la techique de diffusion de la lumière (DLS). A) En milieu aqueux PB1F2 reste stablement monomérique en fonction du temps (Ø<10nm). B) PB1F2 La Grippe est l une des maladies les plus courantes et les plus mortelles que l homme ait connues au cours de son histoire. PB1-F2 est une protéine du virus de la grippe qui décrit comme un facteur de virulence impliqué dans la pathogénécité et la morbidité du virus. Récemment, nous avons mis au point l expression de la PB1-F2, issues de divers souches virales (grippe espagnole, souches pandémiques, H5N1 hypervirulents) en système recombinant procaryote et sa purification (Chevalier et al., 2010). PB1F2 est non-structurée en milieu aqueux, mais adopte une structure en feuillets β lorsque l on augmente l hydrophobicité relative du milieu (ajout de molécules mimant la membrane biologique et/ou de liposomes). Nous avons montré que dans certaines conditions PB1-F2 forme des fibres amyloïdes. Au cours du projet, nous produirons une étude comparative entre plusieurs souches d origines et de pouvoirs pathogènes divers. Nous chercherons à comprendre comment PB1-F2 interagie avec des membranes de différent compositions lipidique et quels

4 forme des objets de plus grande diamètre (50-100nm) dans un milieu hydrophobe. Insert, une image obtenue en coloration négative obtenues par microscopie électronique montre que ses objets sont de taille hétérogène, bar 100 nm. Chevalier et al., J. Biol. Chem., 2010, 285, sont les résidus critiques impliqués dans les changements structuraux de PB1-F2 associés à cette activité. Nous développerons, également, des biocapteurs pour la détection de PB1F2 dans les échantillons biologiques (cellules ou poumons infectés par virus de la grippe). Nous avons mis en point un biocapteur optique qui détecte la protéine à l aide d un anticorps spécifique. Depuis 2010 en collaboration avec l équipe UMR 8182, Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d Orsay nous optimisons la sensibilité et la taille du biocapteur. Plus particulièrement cette collaboration a été mise en place afin d élaborer un biocapteur à base de nanotube de carbone. Nous espérons que l utilisation de nanotubes permettra de gagner en sélectivité, sensibilité et à réduire le seuil de détection de la protéine. En conclusion, le nouveau biocapteur pourra servir pour la détection précoce de l infection. Nanosenseur pour détection des odeurs Fabrication de nanobiosenseur olfactif. A) Micrographie électronique d une cellule exprimant un récepteur olfactif. Les molécules du récepteur sont localisées à l aide d un anticorps spécifique couplé au grain d or. B) Microsomes obtenus à partir de membrane des levures transformée exprimant le récepteur olfactif ont des tailles différentes. Bar, 200 nm C) Nanosomes obtenus par sonication des microsomes ont les diamètres uniformes d environ 40 nm. Ces structures servent comme éléments sensibles du nanobioseneurs. Elles sont élaborées et fabriquées à l INRA Jouy en Josas. D) Nanoélectrode qui permet d immobiliser de manier fonctionnelle des nanosome. Fabriqué à l Université de Barcelone (Laboratoire de Avec l équipe Noemi de l INRA de Jouy en Josas, notre équipe fait partie du consortium européen du projet BOND ( ) qui a pour but de développer un nanobiosenseur à base de récepteurs olfactifs pour la détection des odeurs ( Pour réaliser ce projet ambitieux, nous produisons les nanosomes à partir de morceaux de membrane isolée de cellule qui exprime le récepteur olfactif d intérêt. La Figure illustre la fabrication de ce biosenseur. Notre laboratoire VIM est charge de tester la fonctionnalité des nanosomes, de les caractériser, ainsi de mettre au point la méthode de leur immobilisation fonctionnelle sur la surface du nanobiocapteur.

5 Nanobioelectronique). E) Réseau de nanoélectrodes. Chaque point est une nanoélectode présenté dans le D. F) Visualisation en AFM du réseau de nanoélectodes. Les points sont les nanosomes immobilisées (1). Une nanoélectode zoomée (2). Les diamètres du cliché dans le (2). Vidic et al., Anal. Chem., 2007,79, ; Vidic et al., Lab Chip, 2006, 6, ; Minic et al., Biochim Biophys Acta, 2005, 1724, ; Minic et al., FEBS J. 2005, 272, Programme de recherche : Nous proposons comme projet, une étude biophysique des bases moléculaires de la pathologie dit à prion : dynamique conformationnelle de la protéine prion et ses interactions avec les membranes. Au plan international, les recherches sur les protéines prions se sont développées selon trois axes majeurs. Les deux premiers se définissent comme une étude de l'effet de l'agent pathogène soit in vivo sur des animaux, soit ex vivo sur des modèles cellulaires permissifs ou non, ceci dans le but de déterminer les modifications et l'intervention des groupes tissulaires et compartiments subcellulaires lors de la réplication de l'agent pathogène. Le troisième axe de recherche est centré sur l'étude physico-chimique de la protéine PrP. En effet, les maladies à prions se situent dans la catégorie des pathologies liées au mauvais repliement des protéines et donc de ce fait l'étude de la dynamique conformationnelle de la PrP qui constitue un pré-requis absolu pour la compréhension des mécanismes intimes de cette pathologie. Les axes de recherche développés au sien de notre équipe sont centrés sur les bases moléculaires du mécanisme de la conversion de PrP c -> PrP Sc en considérant ce dernier comme un problème de dynamique du repliement de la protéine. Ainsi, nous utilisons et développons : Des approches cinétiques, vue d'une étude fine de la dynamique conformationnelle de la protéine PrP en relation avec sa diversité conformationnelle (cf. phénomène de souche). La biologie structurale, afin d'établir les bases moléculaires de la formation des différents conformères et d'identifier les régions et les résidus impliqués dans ces différences. Etude des interactions protéine/membrane, afin d'étudier les mécanismes moléculaires des phénomènes cytotoxiques associés à la formation des oligomères riches en feuillet β à l'instar des autres amyloïdopathies. Les relations entre changement de conformation, agrégation et transmission de la maladie sont encore mal comprises. L hypothèse la plus largement admise, propose une réaction auto-catalytique à partir d un nucléus et combinée à une polymérisation. Il est supposé, en plus, que cette réaction fait intervenir plusieurs cofacteurs soit de type protéique soit de type lipidique. Pour cette raison, nous cherchons à établir de nouveaux éléments en ce qui concerne la dynamique conformationnelle

6 de la PrP recombinante in vitro, la cinétique de sa polymérisation et ses interactions avec des modèles membranaires. En plus de cette étude sur le PrP, nous souhaitons élargir le projet sur une «PrP C -like» protéine nommée «Shadoo» pour décrire que cette protéine était pendant une longe période dans l ombre de la protéine prion. Nous espérons découvrir des mécanismes moléculaires nouveaux participant à la conversion de la forme cellulaire de la protéine prion en sa forme pathogène, et caractérisant son agrégation, afin de comprendre la transmission de cette maladie. Références : Chevalier et al., J. Biol. Chem., 2010, 285, Vidic et al., Anal. Chem., 2007,79, Vidic et al., Lab Chip, 2006, 6, Minic et al., Biochim Biophys Acta, 2005, 1724, Minic et al., FEBS J. 2005, 272, Rezaei et al, JMolBiol, 2005,347,