PHYSIOLOGIE ET NUTRITION

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1 PHYSIOLOGIE ET NUTRITION VEGETALE. TP en SN II4 I-INTRODUCTION. Chez les plantes et chez les animaux, la vie ne pourrait se passer d eau, constituant important. Le végétal a sa concentration en eau qui varie fortement en fonction des conditions environnementale et physiologique. Nous avons une grande variation de l eau disponible dans les plantes. On estime que les tissus végétaux présentent une moyenne grossière de 70% d eau. La plante est caractérisée par un mouvement perpétuel d eau, entre les racines et les parties aériennes. Pour cela, il va y avoir mis en place de système spécialisé dans l absorption de l eau et de solutions minérales et de transport. II-L EAU ET LA CELLULE VEGETALE. A-DIFFERENT ROLE DE L EAU. 1-PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUE. L eau est un élément important pour tout ce qui concerne les réactions biologiques. L eau demeure liquide aux températures moyennes de la vie. Elle joue un rôle important dans la régulation thermique des plantes. Elle a un rôle de solvant. L eau est transparente, ce qui est essentiel à la capacité photosynthétique de la plante. 2-TRANSPORT DE L EAU. Le transport de l eau se fait par un transport passif ne nécessitant pas de l énergie chimique. Ces mouvement sont régit par les lois de l osmose. 1

2 L eau traverse les membranes hémiperméable pour équilibrer les concentrations entre deux compartiments. A- OSMOMETRIE. Pour caractériser le transport de l eau, on utilise un osmomètre. Dans la «tulipe» on met une solution à forte concentration en saccharose, et l eau du bécher va rentrer dans la tulipe pour faire augmenter le niveau d eau. Dans un second temps, on peut utiliser un piston pour «mesurer» la pression osmotique. On ajoute de la pression sur le piston, jusqu à ce que le niveau d eau de la tulipe rejoigne celui du bécher. B-POTENTIEL CHIMIQUE. Pour calculer le potentiel chimique d une solution, on utilise les lois de la thermodynamique : μ = μ 0 + RT ln a + VP + z FΨ + mg h «RT ln a» correspond à l activité chimique. «VP» correspond au potentiel de pression. «z FΨ» correspond au potentiel électrique. «mg h» correspond au potentiel de gravité. On considère que le potentiel électrique de l eau est nul μ eau = 0. C est la valeur la plus élevée qu on puisse trouver. Le potentiel de gravité est négligeable au niveau cellulaire. Le potentiel électrique aussi est négligeable, bien que la molécule d eau soit un dipôle. La molécule d eau, est neutre. Pour simplifier, on n utilise pas le μ mais le Ψ, soit le potentiel hydrique, exprimé (non pas en J.Mol -1 ) en bars ou en MPa. 2

3 On a : Ψ = Ψ solut é + Ψ pression + Ψ matriciel + Ψ gravit é Le potentiel de gravité est négligeable pour les plantes de moins de 10m de hauteur. Le potentiel matriciel n est important que dans le cadre de l imbibition (lorsque les tissus sont très déshydratés, on assiste à un phénomène d hydratation des molécules, comme dans les graines ). Le potentiel de soluté est toujours inférieur ou égal à zéro. Le potentiel de pression a une valeur négative lorsqu il y a une tension (comme lorsqu on crée du vide dans un piston contenant un peu d eau). S il est positif, il y a un phénomène de pression, provoquant la turgescence de la plante. Lorsqu on met en une cellule végétale dans différent environnement, les potentiels de soluté et de pression vont être modifiés. Lorsqu on met la cellule végétale dans une solution de saccharose. L eau de la cellule fuit, vers l extérieur. Lorsqu on la met dans de l eau pure. L eau du récipient entre dans la cellule pour diluer les solutés de la vacuole. Les force de pression permettent à la plante d effectuer différents mouvements cellulaires (stomates, plantes carnivores ). 3- LIAISONS DE L EAU DANS UN VEGETAL. On observe qu il y a plus de soluté dans la racine. Ce qui engendre un transport favorable du sol vers la plante. Si on augmente la concentration saline dans le sol, la racine augmente encore plus sa concentration en soluté dans ses racines pour garder ses mouvements d eau. Ainsi on détermine différents types de plantes (qu elle vive dans une rivière avec de l eau quasi distillée, ou dans un sol particulièrement salé). Les plantes halophytes : peuvent accumuler d énorme quantité de soluté dans ses racines. Avec un Ψ soluté supérieur à 10 bars (1MPa). Près de milieu marins Les xérophytes (genre cactus) : poussent dans le désert, là ou il n y a pas d eau. Elles ne peuvent pas pour autant vivre là où il y a beaucoup de sel. Elles développent un système de mucilage qui emmagasine beaucoup d eau Les glycophytes (sensibles ou résistantes), avec Ψ soluté = 1 bars (0,1MPa). Chez les champignons, le Ψ s peut atteindre 100bars (10MPa), ce qui leur permet de coloniser un grand nombre de milieu. 3

4 4- POTENTIEL HYDRIQUE D UN ECHANTILLON. On met des échantillons végétaux dans des solutions de plus en plus saline. Plus la concentration de la solution, la différence de poids diminue. Au point d intersection avec l axe des abscisses, c est le point isotonique Vu que Ψ p est nul. On a Ψ w = Ψ s. Et Ψ s =-π et π=crt.. 4

5 On met une feuille dans la Chambre de Schrolender. On augmente la pression dans la chambre. Au bout d un certain point, l eau va sortir : on a dépassé la valeur du potentiel de turgescence. On peut utiliser un psychromètre.. B- RELATIONS HYDRIQUES DANS LA PLANTE. Il y a une grande absorption d eau. Cette eau doit traverser toutes les couches de tissus, puis traverser la plante vers les parties aérienne pour être évapotranspirée. On a environ 5% de l eau qui absorbé au niveau de la racine qui servira à la croissance de la plante. 95% ne servira qu à l évapotranspiration. A-TENEUR EN EAU. Lorsqu on s intéresse à la croissance d une plante, on ne doit pas s intéresser à la matière fraiche mais bien à la matière sèche, qui donne une meilleure idée des variations de croissance. On effectue d abord une dessiccation (passage bref de quelques minutes à 110 ) pour détruire les différentes activités enzymatiques, puis on le déshydrate à 60. 5

6 Pour comparer la MF à la MS, on utilise un outil : θ sec = E 100 avec E = mass d eau et MS θ=poids sec. Dans la patate, on a 20 fois plus d eau que de matière sèche. Dans les graine, on en a 10 fois moins. Conclusion vaut mieux aller dans le désert avec des patate que des graines. B- ABSORPTION DE L EAU. ELEMENTS EXTERNES INFLUANT SUR L ABSORPTION. Différents facteur influent sur l absorption : -la taille des particules : -le sable : particule de plus de 50µm, friable, mais retient mal l eau, se dessèche rapidement et perd ses engrais par lessivage. -le limon : particules de 2 à 50µm -l argiles : particules < 2µm, retient beaucoup l eau, peut se compacter induire un durcissement ou peut se saturer d eau et entrainer un manque d oxygène. Un sol idéale devrait contenir 40% de sable ; 40% de limon et 20% d argile. -présence d humus : il rend le sol friable, aéré, retient beaucoup d eau (1000 fois plus que l argile) sans se compacter DONC prévient le desséchement du sol et le lessivage. Il fournit progressivement des matières nutritives (engrais, minéraux) provenant de la décomposition. Rend le sol favorable aux organismes qui l habitent (vers, bactéries ). La composition du sol entraine des changements au niveau de la capacité du sol à libérer cette eau. C- SITE D ABSORPTION. A l aide de l expérience de Rosène, on repère la partie de la racine qui absorbe l eau. On met de l eau et on rajoute de l huile qui empêche toute absorption d eau. Si on laisse la partie apicale dans l eau et qu on met les poils absorbant dans l huile, la plante meurt l absorption se fait dans une partie plus haute que l apex. 6

7 Ces poils permettent l augmentation de la surface d échange (facteur 100). On peut avoir 200 à 500 poils par cm² chez les eudycotylédones. Chez les monocotylées ça peut aller jusqu à 1000 par cm². Chez les ligneuses on a très peu de poils absorbant, et on a la mise en place d un mycorhize. Habituellement les racines se ramifient. Le rhizotron est la partie où la racine peut absorber de l eau. Si on met expérimentalement une plante à pousser dans un sol hétérogène de sable et de tourbe, les racines se ramifient en traversant simplement le sable et envoie des expansions dans la tourbe. Le végétale peut différencier les différent types de sol. Chez les plantes, on a généralement 50% de la masse qui est racinaire. Le volume du sol qui va être traversé par les racines est très important. Il y a des plantes qui vivent non fixée au sol. Elles poussent sur un support, elles sont dites épiphytes. Elles peuvent absorber directement l eau de l atmosphère (il faut une atmosphère très humide ^^). Pour qu il y ait un transfert d eau de l air vers la plante, il faut que les feuilles aient un très faible potentiel hydrique (en accumulant des solutés). Certaines ont un velamen. 7

8 D autre comme les fougères, qui pousse sur les arbres. Elles ont des feuilles qui sont des feuilles réservoir. Elles forment un petit puits qui emmagasinent de l eau et des particules et permettent la nutrition. D- LES COMPOSANTS DE L ABSORPTION DE L EAU. Dans une coupe de racine, plus on va vers le centre, plus la concentration en soluté augmente, plus la potentiel hydrique diminue, ce qui crée un appel d eau vers le centre de la plante. Puis l eau arrive dans la stèle, et là l endoderme va avoir un rôle de filtre au niveau du passage du cortex au vaisseau vasculaire. On remarque qu après l endoderme, la concentration en soluté diminue. Ceci est dû au fait qu il faille passer d un transport horizontal à un transport verticale dans les vaisseaux, par un autre mécanisme. Pour le comprendre on étudie l expérience de Dixon. On remplit un entonnoir d eau. On y connecte un tube en verre. Au sommet de l entonnoir on met du plâtre qui sert de surface poreuse qui permet au vapeur d eau. On ajoute du mercure dans le cristallisoir en bas. Résultat : l eau va s évaporer (à cause de la chaleur), ce qui crée un appel de matière qui fait monter le niveau de mercure, jusqu à près d 1 mètre de mercure soit 15 mètre d eau!!! C est la force de cohésion des molécules d eau. Par liaison hydrogène, lorsqu une molécule d eau s évapore, elle entraine ses voisines avec elle qui entrainent leurs voisines avec elles 8

9 C est ce mécanisme qui est utilisé pour faire monter la sève. Mais ce phénomène entraine une tension (contraire de la pression hydrostatique). C est pour cette raison que les vaisseaux sont sclérifiés : pour ne pas s écraser comme un pneu qu on viderait de son air. On a un différentiel de potentiel hydrique très favorable entre le sol et la racine, entre la racine et la feuille, et entre la feuille et l atmosphère. On a des tensions de 20 bars qui se créent chez certains végétaux. Il faut que le sol soit aéré, il ne doit pas se compacter, sinon, il n y a plus d oxygène. D où, parfois le recours à des pneumatophores. Il faut que les températures soient dans certaines limites. Ni trop froid, ni trop chaud. Plus il y a de vent, plus il y a de transpiration : mais encore, il en faut ni trop ni trop peu. E- LES MECANISMES DE L ABSORPTION. 2 grands types de plantes : les plantes à forte ou faible transpiration. Les faibles, actives ou osmotiques, elles utilisent la force du gradient dans les racines. Les fortes, passif utilisent les force de tension créées par l évapotranspiration! Expérience de Hales : on coupe une tige, on la fait tremper dans de l eau ce qui extrait la sève brut, et on met un siphon avec du mercure. On voit que les plantes peuvent développer des tensions (allant jusqu à 9 bars pour le marronnier!!!!). Mais pour certaines plantes, cette force est presque nulle. C-LA TRANSLOCATION (TRANSIT) DE L EAU. A- TRANSPORT RADIAL. La pression racinaire permet le transport actif de minéraux dans la stèle. Il s agit d un phénomène qui se fait surtout au cours de la nuit et qui vise à augmenter l osmolarité de la stèle. Le potentiel hydrique dans la stèle devient plus faible que le potentiel hydrique extérieur. L eau se déplace vers la stèle et pénètre dans les xylèmes par osmose : c est la pression racinaire. 9

10 L eau et les minéraux vont pouvoir subir différent types de transport. Le système apoplasmique, il consiste à juste passer par les parois. Le système symplasmique, on passe par les plasmodesmes, de cytoplasme en cytoplasme. Le système transcellulaire : le passage de l eau en traversant paroi, membrane cytoplasme, vacuole, cytoplasme, membrane, paroi. Ce système n est pas très utilisé, trop de traversées, trop de filtres. Dès qu on arrive à la stèle, l endoderme à cadre de Caspary, chez les eudycoltylédones empêche la voie apoplasmique. Après ça il y a le parenchyme vasculaire, qui fait la transition entre le transport horizontal et vertical. Puis ça va dans les xylèmes et hop! Ça monte dans les vaisseaux. Pour le phloème, pas besoin de résister à de forte tension, ça retombe tout seul ^^. Les limites de la capillarité : due à la cohésion entre les molécules d eau entre elle et avec la paroi des vaisseaux conducteurs. La montée est inversement proportionnelle au diamètre du tube. Grâce à cela, l eau ne peut pas monter plus haut que 1,5m dans les plus petites trachéides. La capillarité ne contribue que très peu à la monté de l eau dans les trachéides. Le fait qu il y ait des forces de tension énorme entraine des problèmes de cavitation : dès qu on tire fort, ça crée des bulles d air qui apparaissent. Quand une bulle se forme, l eau ne peut plus monter, l eau doit contourner la bulle pour recontinuer dans son trachéide. Pour régler ce problème, la plante condamne la partie envahie par les bulles. Trois forces qui contribuent à faire monter l eau : la capillarité, la pression racinaire, et l aspiration foliaire. 10

11 B- CIRCULATION DE LA SEVE ELABOREE. Potentiel de gravite : Ψg = ρgh avec ρ = 1000 kg/m 3 et g = 9,81 m/s² et h = hauteur L eau, par la voie du symplasme va passer des cellules du mésophile vers les cellules parenchymateuses. Ensuite se met en place aussi la voie apoplasmique. Le sucre est stocké dans une cellule criblée. Dans cette cellule y a une pompe à proton qui acidifie l extérieur de la cellule. Chaque proton qui sort fait rentrer un saccharose par antiport. On a un transport d organe source vers organe puits (méristème, tubercule). Dans la source, on a production massive de saccharose. Beaucoup de saccharose dans le vaisseau criblé dans le phloème on a des parois cellulosique et les cellules vont accumuler eau et saccharose augmentation de la pression hydrostatique mouvement de zone de haute pression vers zone de basse pression (baisse de pression parce que polymérisation de saccharose en amidon ou consommation du saccharose). Vitesse faible (10 à 100 cm/h). Les différents types de transport. On rappelle que l eau a besoin d aquaporine (on a un tout petit peu de diffusion libre d eau). Ces porines sont un système passif : il n y a mouvement d eau que s il y a différence de potentiel hydrique. Les mouvements d eau se font dans les deux sens. C- EMISSION D EAU. La pression racinaire peut entrainer dans certains cas la guttation ( rosée). La guttation a lieu généralement près des systèmes vasculaires (près des vaisseaux). La sortie de l eau se fait via des hydathodes (stomates aquifères). Ce mécanisme permet à l eau de sortir sous forme de petites gouttes et permet un transfert d eau dans le xylème. Ce phénomène n est observé que si le sol est gorgé d eau et si l air est assez humide pour ne pas que l eau s évapore immédiatement. 11

12 1-LE MECANISME DE LA TRANSPIRATION. 95% de l eau qui monte va être évaporé. De ces 95%, 90% vont être évaporés au niveau des feuilles, et 10 au niveau des lenticelles. La cuticule cireuse empêche la nécrose du parenchyme par dessiccation due à la lumière et à l atmosphère. Dans cette cuticule, on a mis des stomates pour permettre quand même une transpiration, mais une transpiration régulée. L eau arrive au niveau du xylème. L eau va suivre un gradient de potentiel hydrique, vers le parenchyme palissadique. L eau va former une pellicule dans l espace laissé par les cellules du parenchyme. Vu que la pellicule est fine, plus la pression hydrostatique est faible. Trois expériences : -On enferme les parties basses de la plante dans un sac pour ne pas qu il y ait d évaporation à ce niveau. Et on pèse à intervalle régulier. -On enferme toute la plante dans une cloche. Si on illumine avec telle ou telle lumière, on va observer plus ou moins de condensation sur la cloche. -On utilise un indicateur coloré qui se déplace lorsque l eau des racines monte. Chez les eudycotylédones, on a des stomates elliptiques. Chez les monocotylées, on a des stomates de type graminéen. On a deux cellules «de garde» sur les côté, qui ouvrent ou ferment le passage. Elles délimitent un espace qu on appelle «ostiole». Les cellules de garde sont entourées de «cellules annexes». L ensemble de ces structures forment un complexe stomatique qui va permettre d améliorer les échanges en eau entre les tissus du parenchyme et l atmosphère. Le CO 2 rentre par là. Mais rentre aussi les polluant (genre O 3 ou SO 2 ). Les stomates ne se trouvent pas que sur les feuilles (sur les tiges vertes), en général on a entrez 20 et 400 stomate/mm². Dans les cellules stomatiques, on a des fibres de cellulose perpendiculaire à l axe de la cellule. A l aide de la pression hydrostatique dans les vacuoles, on a turgescence ou plasmolyse des cellules ouverture ou fermeture. Pompe à proton ATPase, fait sortir des protons, ce qui provoque l hyperpolarisation du feuillet externe, ce qui active des canaux K + voltage-dépendants Accumulation de K + dans les 12

13 cellules de garde, augmentation de l osmolatrité, turgescence, ouverture de l ostiole. On a aussi une entrée de malate et d ions Cl -. Si avec de la fusicoccine ou du vanadate, on inhibe sélectivement les pompe à proton, les stomates restent fermées ABA arrive, entraine une entrée de calcium (et il y a libération de Ca 2+ de la vacuole vers le cytosol), ce qui va entrainer une inhibition du transfert de proton et l activation de canaux sortant de K + plasmolyse fermeture. Le vanadate est aussi un inhibiteur de la pompe à proton Contrôle des mouvements. La lumière (bleue principalement) entraine l ouverture du stomate un moment, puis fermeture. Le CO 2, si sa concentration est faible, en présence de lumière on a ouverture du stomate. Si sa concentration est forte, en présence de lumière, on a fermeture du stomate. La température. Dès qu elle s élève, on a ouverture du stomate. Mais lorsque la température devient trop élevée, il y a fermeture rapide du stomate. 2- LES VARIATIONS DE LA TRANSPIRATION. En hiver les arbres perdent leurs feuilles pour limiter la transpiration. Dans les milieux où l eau est peu accessible, on a des feuilles lancéolées, voire dans les cas extrêmes, des épines (cactacées). Les végétaux peuvent aussi jouer sur le nombre de stomates. Lorsqu on a un état du sol où l humidité de l eau devient un facteur limitant, la plante va émettre un signal de stress : synthèse au niveau de la racine d une phytohormone l acide abscicissique. Le vent et l agitation de l air est à prendre en compte : le vent accélère la transpiration de la plante. La température optimale de transpiration est de Les plantes CAM fixent le CO 2 la nuit, le transforme en acide organiques. La nuit, elles retransforment ces acides organiques en CO 2 et continue sa vie. Résultat, pas ou peu d évaporation. On a aussi une périodicité selon le moment de l année. L ouverture maximale se fait au printemps (beaucoup d eau et température acceptable). En été, s il pleut on a une ouverture presque maximale. Si la journée est sèche, les stomates s ouvrent dans la journée et se ferment 13

14 d un coup, la nuit tombée. Si la journée est très sèche, les stomates s ouvrent un peu le matin et se ferment très vite. En automne, s il pleut, on a beaucoup d eau, mais la journée est froide, alors on va avoir une ouverture vers midi, au moment d ensoleillement maximum, et fermeture. En hiver, le sol gèle, les racines ne sont plus capables de puiser de l eau. Mais il y a du soleil, il fait (il ne fait pas froid). Vu la chaleur des parties aériennes, la plante va ouvrir ses stomates, transpirer, mais ne pouvant pas renouveler l eau au niveau racinaire, la plante meurt c est triste. On peut mettre des molécules anti-transpirantes. Si on a des limbes on pourra pulvériser des polymères imperméables. On peut aussi mettre des agents fermeurs de stomate (comme le phénylacétate de mercure). On va augmenter la survie de la plante, mais on va empêcher le développement (photosynthèse). LA NUTRITION MINERALE CHEZ LES VEGETAUX. Au XVI siècle, Van Helmont fait une expérience. Il fait pousser un arbre pendant 5 ans. L arbre pèse 76 kg et le sol n a perdu que quelques grammes. Donc, la masse de la plante vient d ailleurs. Vu qu on a ajouté que de l eau d arrosage, on s est d abord dit qu une plante prenait toute sa masse dans les sels minéraux. Ce n est que quelques siècles plus tard qu on a compris que la masse de la plante venait du CO 2 atmosphérique. Mais la plante a quand même besoin de sel minéraux de l eau et du sol! N, K, Ca en quantité importante (macroéléments). La consommation en sels minéraux varie selon les espèces : crucifère (S), graminée (Si), halophyte (Na), calcifuge (très peu de calcium), épinard (K). La consommation en sels minéraux varie selon l âge des plantes : organe jeune (K, N, P). LES MACROELEMENTS. On a des métaux. Principalement sous formes de cations. On a des non-métaux, sous forme d anions. 14

15 NUTRITION AZOTEE. IMPORTANCE DE L AZOTE POUR LES PLANTES. Les composés azotés synthétisés chez l ensemble des organismes : Macromolécule (acides aminés, ADN, phosphatidylcholine), intervention dans l énergie cellulaire (ATP), maintien du pouvoir réducteur (NAD/NADH et NADP/NADPH). Composés azotés spécifiques des végétaux : -Hormones végétales (cytokinines, auxine) -Chlorophylle -Lignine qui dérive de la phénylalanine. -Flavonoïdes (antioxydants) qui dérivent de la phénylalanine. Une carence entraine une chlorose généralisée et l affaiblissement de la plante. Sans azote, la première protéine affectée est la Rubisco! I- DISPONIBILITE EN AZOTE POUR LES PLANTES : LE CYCLE DE L AZOTE. Le caractère limitant de l azote entraine une nécessité à le recycler. Le recyclage se fait en oxydant plus ou moins l azote. On part de NO 3 -, on ajoute un électron et on arrive à NO 2 -, puis NO (gaz à effet de serre, plutôt toxique), puis N 2 O (gaz toxique aussi), puis N 2 (azote moléculaire, gaz extrêmement stable)(, NH 2 OH qui est une étape facultative qui revient à NO 2 - ), NH 4 +, puis azote organique. 15

16 Il faut toujours un apport initial d azote. Mais on a un recyclage, parce qu on a un retour de la matière dans le sol (chute de feuille, consommation par les animaux qui meurent). On a aussi une perte d azote par érosion ou par lessivage (le NO 3 - est plus facilement entrainé par les pluies, etc. contrairement au NH 4 + qui a tendance à rester dans la plante), et aussi par les récoltes. 1- APPORT EN AZOTE : LA REDUCTION DE L AZOTE ATMOSPHERIQUE. L apporte géochimique (10%) va être produit par les éclairs dans le ciel, de la manière suivante : N 2 O + hν N 2 + O N 2 O + O 2NO NO + O 3 NO 2 + O 2 Ces éléments, dans les villes très polluées, ont une importance dans l apport atmosphérique d azote. 16

17 L apporte industrielle (30%), provient d engrais et est sous forme de NH 4 + ou sous forme d urée. Pour produire ces molécules à partir de N 2 et d hydrogène par le procédé d Haber-Bosh (haute température et haute pression) qui est très polluant. L apport biologique (60%), uniquement chez les bactéries procaryotes, libres ou symbiotiques. LA NITROGENASE. La nitrogénase reste très semblable même chez les espèces très éloignée. Il y a tellement de contrainte pour réussir la réaction qu elle catalyse, qu il ne peut y avoir de mutation. On utilise 16 ATP et 8 électrons pour réduire une molécule d azote moléculaire. N H e - 2NH 3 + H 2 (consomme 16 ATP). En fait, on la un complexe de protéines. La protéine II dinitrogénase réductase est un homodimère, codé par un seul gène nifh et possède en son centre un motif 4 fer-4 souffre. La protéine I dinitrogénase qui est un hétéro-tétramère (2 sous-unités α et 2 sousunités β) qui possède un motif Molybdène-Fer sur la sous-unité α. Chaque hétéro-dimère α/β est lié par un cluster P. 17

18 La ferrédoxine donne un électron à la protéine II. Cette dernière peut alors lier 2 ATP et se lier à la protéine I. Lorsqu on hydrolyse les 2 molécules d ATP, on transfère un seul électron à la protéine I. L électron passe par le cluster P et se fixe au motif FeMo. La protéine II se sépare, et recommence son cycle encore sept fois de plus (huit fois en tout). On peut enfin réduire un N 2 avec nos huit électrons. 2- LA NITRIFICATION. Si les sols sont plutôt alcalins (ph entre 7 et 8) et aérés (nécessite de l oxygène), on assiste à une nitrification. NH 3 + 3/2O 2 NO 2 + H 2 O + 2H+ 2 e - (réaction réalisée seulement par un certains groupe de bactéries, les nitrosomonas, et consomme 1 NADH 2 ) NO H 2 O NO H + + 2e - (réaction réalisée par un certains groupe restreint de bactérie, les nitrobacters). Contrairement à la nitrogénase, qui est presque la même pour tous, les enzymes de nitrification sont spécifiques à certains groupes bactéries chimio-lithotrophes autotrophes (qui n ont en commun que le fait d être gram - ). 18

19 Chez ces bactéries nitrifiantes, on utilise le métabolisme du nitrate pour produire des protons, qui se lient à de l O 2 pour former de l H 2 O et former au passage un gradient de proton. Ce gradient de proton permet la réduction du NAD en NADH (au final dans le complexe 1). 3- ASSIMILATION OU PERTE D AZOTE : LA DENITRIFICATION. On a deux types de dénitrifications : la dénitrification assimilatrice aérobie et la dénitrification dissimilatrice anaérobie La dénitrification assimilatrice : NO 3 NO 2 NH 4 glutamate. Réduction assimilatrice production de biomasse déchets organiques et décomposition complexe par les déaminases ammonification aérobie. La dénitrification dissimilatrice : perte sous formes gazeuses NH 3, NO, N 2 O et N 2. Cette dénitrification a lieu en condition d oxygène limitant, il y a mise en place de chaînes respiratoires alternatives. Ici, le nitrate sert d accepteur terminal d électrons. Cela peut se faire par des bactéries qui possède un complexe nitrate réductase membranaire. Un complexe hémique est suivit d un motif Fe-S et de molybdène qui sont capable de capter des électrons et de les transmettre à la nitrate réductase qui utilise cet électron pour transformer NO 3 - en NO 2 -. Dans le prériplasme de ces bactéries, de nombreuse enzyme vont convertir le NO 2 -. Cette conversion consomme pas mal d électrons. NO 2 2NO N 2 O N2. Bien sûr chacun de ces gaz peut diffuser hors de l organisme et être rejeté dans l atmosphère (on peut arrêter la réaction périplasmique à chaque étape). 19

20 II- ABSORPTION DE L AZOTE MINERALE CHEZ LES VEGETAUX. 1- RAPPEL. L absorption racinaire consiste en un transport vers les vaisseaux conducteurs. 20

21 2- RACINES : CARACTERISATION PHYSIOLOGIQUE DE L INFLUX DE NITRATE. Transport à contre gradient de concentration mais aussi contre le gradient électrochimique surtout pour le nitrate. On va donc avoir besoin d énergie pour faire rentrer le nitrate dans la cellule, d où la présence d un système de symport (symport= co-transport actif). On a donc du nitrate en excès dans le sol. Il y a transport, via le système ci-dessus, au niveau des poils absorbants. Le nitrate rejoint les vaisseaux conducteurs, où il est transporté jusqu aux feuilles où il est enfin assimilé. Le nitrate va être transloqué au niveau des plastes. DEUX SYSTEMES DE TYPE SYMPORT SONT PRESENTS DANS LA PLANTE. Ces deux symports sont NRT1 et NRT2. Ils présentent une affinité différente avec les nitrates selon externe en nitrate (NO 3 - ). 21

22 3- IDENTIFICATION DE NRT1, UN SYSTEME DE TRANSPORT DE FAIBLE AFFINITE. Les mutants capables de pousser en présence de chlorate (ClO - 3 ) sont tous affectés au niveau du transport, ils ne peuvent transporter que des très faibles quantités de nitrate. - Puisque le ClO 3 est un analogue que nitrate, il peut être transporté par le même transporteur, de plus, le chlorate peut utiliser la nitrate réductase pour transformer le chlorate en chlorite. Il y a accumulation très toxique du ClO 2 -, car cette espèce chimique n est pas reconnue par la nitrate réductase. Il y a une forte régulation du transporteur NRT2. 4- LES SYSTEMES AMT DE TRANSPORT D AMMONIUM. Les AMT sont des symports. S il n y a que de l ammoniac dans le sol, on aura une acidification de l iosphère (=milieu externe). Il ressort des expériences que la présence de NH 4 + associer à la présence de NO 3 - est une condition optimale d absorption d azote, car une haute concentration en NH 4 + entraine une acidification du milieu, ce qui facilitera l entrée de l azote par un symport NO 3 - /H +. Ceci s explique par le fait que lorsque la plante absorbe du NH 4 +, elle fera sortir plus facilement un proton. LE SYNDROME AMMONIACAL. Lorsque le NO 3 - sort de la vacuole, des acide organique sont former (pour compenser la charge négative qui sort de la vacuole et entre dans le cytoplasme). Si on n a une nutrition azotée exclusivement à base de NH 4 +, cette formation d acide organique n aura pas lieu. Hors, ces acides organiques formeront les acides aminés nécessaires pour la détoxification du NH 4 + toxique (en le transformant en NH 3 + ). Mais si on a une nutrition azotée exclusivement à base de NH 4 +, on n a pas d acide organique, donc pas d acides aminés, donc accumulation toxique de NH 4 + : c est le syndrome ammoniacal. 22

23 III- ASSIMILATION DES NITRATES ET REDUCTION EN AMMONIUM. 2- ASSIMILATION DES NITRATES ET REDUCTION EN AMMONIUM. On a des systèmes d assimilation du nitrate au niveau du cortex. S il est en grande quantité il va être stocké dans la vacuole. Si la plante a assez d énergie, elle va transformer le nitrate en nitrite en NH 4 +. ASSIMILATION PAR LA NITRATE REDUCTASE ET NITRITE REDUCTASE. Le nitrate va être réduit. NO - 3 NO NH 4 (première enzyme : nitrate réductase assimilatrice cytosolique ; deuxième enzyme : nitrite réductase (chloro)plastique) Dans les plastes, le NH + 4 va être assimilé. On a besoin, au niveau des plastes d avoir des transporteurs à NO - 2. Pour réduire le nitrate on va utiliser les électrons fournit par NADH. Les 6 électrons nécessaires à la réduction du NO 2 - sont apportés par 6 ferrédoxines (elle-même fournit par le photosystème 1). STRUCTURE DE LA NITRATE REDUCTASE (NR). On a un homodimère. Chaque monomère est composé comme suit : -on a une flavine (FAD) -un domaine charnière qui associe le FAD au domaine suivant. -un domaine hémique. -puis le domaine catalytique proprement dit, qui est un domaine à cofacteur à molybdène. Le molybdène étant un métal, peut être à l état oxydé ou réduit, et pour échanger des électrons. Même si, en termes de stabilité, chaque sous-unité a besoin de la présence de l autre, elles fonctionnent indépendamment l une de l autre. Le domaine charnière entre le FAD et l hème est sensible aux protéases. Si on coupe à ce niveau, qu on donne à FAD un donneur d électrons, FAD les prendra les électrons. 23

24 Si on prend juste la partie Hème/MoCo, et qu on ajoute un fort donneur d électron, on va quand même réussir à transférer les électrons pour la réduction des nitrates. Les différentes parties sont opérationnelles seules. Comme si les gènes de s étaient accidentellement retrouvés les uns à la suite des autres. STRUCTURE DE LA NITRITE REDUCTASE (NIR). Elle a seulement deux domaines : -un domaine qui va se lier la ferrédoxine réduite. -un domaine 4Fe-4S/hème. Le domaine 4Fe-4S/hème est un groupement dit prostétique, car il n est pas de nature protéique mais se lie à l apoprotéine pour que le domaine ait sa fonctionnalité. En cas de carence en azote, le nitrate sera assimilé dans la racine. Mais dans ce cas, pas de photosynthèse, donc pas de ferrédoxine. Alors comment ça se passe? On a recours à la voie des pentose-phosphates. Dans cette voie, on une expulsion de deux électrons qui vont réduire du NADP + en NADPH. Ces NADPH produit vont chacun réduire 2 ferrédoxines (donc 4 ferrédoxine en tout). Pour la NiR on a besoin de 6 électrons par nitrite. On va donc devoir réduire une molécule et demie de glucose pour transformer un nitrite. C est très coûteux en énergie. On va mettre ne place des systèmes de régulation de la NiR pour éviter d avoir trop de nitrite en cas de carence en pouvoir réducteur. Elle a un peptide signal, dans la région N-terminal, qui dirige la NiR dans le chloroplaste. La NR n en a pas, elle restera dans le cytosol. 3- FACTEURS ENVIRONNEMENTAUX INFLUENÇANT L ACTIVITE DE LA NR. On a deux façons d inhiber l activité de la NR : soit on stop la synthèse de l enzyme, soit on la désactive une fois synthétisée. Pour savoir si notre gène est transcrit ou pas, on broie une cellule, on récupère tous les ARNm, et on révèle spécifiquement l ARNm de notre NR, avec une sonde. On «évalue» ensuite la puissance du signal pour connaitre la proportion d ARNm synthétisée. On peut faire des mesures dans différentes conditions. On met des feuilles et des racines en présence continue de NO 3 - et on regarde l évolution de la production d ARNm avec le temps d exposition au nitrate. Ça donne un truc du genre : 24

25 ARNm des feuilles ARNm des racines On observe l activité de la NR en fonction des cycles jour/nuit : Activité de la RN Activité de la RN 25

26 On reste à concentration constante de nitrate et on alterne les cycles jour/nuit : ARNm de NR ARNm de NR Pendant la journée, la quantité d ARNm diminue. Pendant la journée elle augmente. La concentration en acide aminé (glutamine) suit une progression en miroir. Il y a un décalage entre transcription d ARNm et synthèse de protéine (NR). La nuit on produit les ARNm qui seront transformé en enzyme plus tard et utilisée dans la journée, pour réduire les nitrates. On dit que la production de NR suit un cycle circadien. C est le saccharose qui indique qu il y a effectivement des chloroplastes fonctionnels qui assimile le carbone, qui produisent du pouvoir réducteur, qui permet l assimilation de nitrate. D où le fait que la nuit, on arrête de traduire les sarnm en enzyme, parce qu on n a pas de pouvoir réducteur pour faire fonctionner cette enzyme, parce qu on n a pas de photosynthèse (normal : c est la nuit). 26

27 PRINCIPE D INACTIVATION DE LA NR. On commence par une diminution de la concentration en CO 2, cela favorise l activité d une kinase qui phosphoryle la NR (sur sa Sérine 534), ce qui la rend affine avec une petite protéine, la protéine : NR est inactivée lorsqu elle est liée à Dès qu on a augmentation de la concentration en CO 2, on favorise l activité d une phosphatase qui déphosphoryle la NR. La protéine ne peut pas y rester liée, elle se détache et NR est réactivée. IV- ASSIMILATION DE L AZOTE AMMONIACAL. Une fois le nitrate transformé en ammonium (NH 4 + ), il doit être assimilé. Il est à noter que le nitrate n est pas la seule source d ammonium. On a une assimilation primaire et une assimilation secondaire. L assimilation primaire c est le transport et la réduction des nitrates, le transport d ammonium direct, la fixation de l azote atmosphérique. L assimilation secondaire correspond à l absorption d azote produit par la photorespiration, le catabolisme protéique (hydrolyse de la Rubisco avant la chute des feuilles pour ne pas gâcher), l utilisation des composés impliqué dans le transport de l azote (asparagine, arginine, uréides), la mobilisation de l azote, la germination des graine (déamination). On se rend compte, que comme la Rubisco, on a des protéines qui sont synthétisées (même si on en n a pas vraiment besoin) et qui peuvent servir de stock d azote. 1- ASSIMILATION DU NH 4 + PAR LE SYSTEME GS/GOGAT. Il existe des organes de réserves (comme le tubercule de pomme de terre). On observe aussi une grande proportion d azote stockée dans les graines. Il existe des molécules spécifiques qui n ont pas d activité enzymatique qui, au moment de la germination, vont devenir sensible aux protéases (les déaminases) qui les métabolisent en produisant du NH

28 On a aussi une forte quantité de NH 3 + qui est produit lors de la photo-respiration des plantes C3. On part de 1,5 Ribulose bi-phosphate et la Rubisco va soit former deux PGA soit former un PGG et un phosphoglycolate. Ce phosphoglycolate, lorsqu il entre dans le peroxysome va être transformé pour former un aldéhyde (glyoxylate) et une molécule d eau. Par transamination, le glyoxylate va former une glycine : on fixe un NH 2!!! Puis, dans les mitochondries, deux glycines sont transformées en une sérine, par décarboxylation et déamination (on rejette un CO 2 et un NH 3 ). Le NH 3 assimilé ainsi peut être trois fois supérieure à celui assimilé par assimilation primaire. On a 4 acides aminés essentiels à l assimilation de NH 4 +, ils dérivent des acides α- cétoniques du cycle de Krebs : -l α-cétoglutarate donne le glutamate et la glutamine. -l oxaloacétate donne l aspartate et l asparagine. Les deux premiers acides aminés synthétisés sont la glutamine et le glutamate. Ensuite ils sont, rarement, utilisés tel quel. Sinon, ils sont transformé en aspartate (à partir du glutamate). L asparagine va être assimilé la nuit, parce qu elle assez inerte (pas de modification du métabolisme général). La quantité de glutamate reste constante, par contre l α-cétoglutarate oscille selon les cycles jour/nuit. On part du glutamate amidation (catalysée par la glutamine synthétase ou GS qui consomme de l ATP) glutamine transfert du NH 2 directement sur le carbone α de l αcétoglutarate 2 glutamates (celui de départ + un qui a assimilé de l azote). Le transfert du NH 2 se fait par la Glutamate OxoGlutarate Amino-Transferase (GOGAT). Cette réaction correspond à une réduction de cétone, qui nécessite un apport d électrons. On a donc 2 types de GOGAT : une qui consomme du NADH et une autre qui consomme deux ferrédoxines. 28

29 On a deux inhibiteurs : la Méthionine SulfOximine (MSO) et l azasérine qui présentent une partie homologue respectivement avec la glutamine et l α-cétoglutarate, qui inhibent donc respectivement la GS et la GOGAT. On a deux GS et deux GOGAT. GS1 et GS2 sont très proche et ont des activités chimique très très proches : la seule différence c est leur localisation (intracellulaire et tissulaire). GS1 est racinaire et cytosolique (à plus de 95%) ; la GS2 est foliaire et (chloro)plastique (à plus de 95%). La GOGAT NADH-dépendante est racinaire tandis que la GOGAT ferrédoxinedépendante (codée par le gène GLU1) est foliaire. En fait elles n ont pas exactement le même rôle. On fait une expérience : On remarque que les mutants qui n expriment pas GS2 ou GLU1 se développent normalement que si on les met sous 1% de CO 2. Sous atmosphère ambiante, elles sont chlorotiques (jaunes et toute moche). On remarque que la quantité des chlorophylles dans les mutants est toujours inférieure à celle présente chez le sauvage (dans toutes les conditions). Les mutants à l air sont dans le même état qu en carence en azote. En fait, quand on diminue la concentration en CO 2, la Rubisco se met en mode photo-respiration et produit 1 PGA et 1 phosphoglycolate et pour gérer ce phosphoglycolate, il faut de la GS et de la GOGAT. 2- ASSIMILATION DU NH 4 + PAR LE SYSTEME GLUTAMATE DESHYDROGENASE (GDH) : UNE VOIE ALTERNATIVE. Il faut savoir que la GS a une plus forte affinité pour le NH 4 +, que la GDH. En condition d excès d azote, on utilise la GDH pour décharger le GS de son boulot et parce qu on a atteint une concentration en NH 4 + suffisante au vu du K m de la GDH 29

30 3- SYNTHESE DES AUTRES ACIDES AMINES DANS LA PLANTES. On a suivit la formation de glutamate. On sait qu on peut former de l aspartate en transaminant du glutamate sur de l oxaloacétate. Cette réaction est catalysée par l aspartate amino-transférase (AAT). (On a une autre transamination évoquée précédemment : celle du glyoxylate pour former de la glycine dans les peroxysomes.) On peut avoir une amidation de l aspartate par la glutamine pour donner du glutamate et de l asparagine. Réaction catalysée par l asparagine synthétase (coûte l hydrolyse d un ATP en AMP). A la fin de la journée on a formé plein de glutamine. On va lui retirer un N pour former de l asparagine, forme de réserve. 30

31 DEUX SCHEMAS IMPORTANTS. 31